一种瑞士乳杆菌、高产GABA的直投式发酵剂及其应用的制作方法

一种瑞士乳杆菌、高产gaba的直投式发酵剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种瑞士乳杆菌、高产gaba的直投式发酵剂及其应用。


背景技术：

2.γ
‑
氨基丁酸(γ
‑
aminobutyric acid，简称gaba)又称为氨酪酸、伽马氨基丁酸等，是一种广泛存在于动物、植物和微生物体内的非蛋白氨基酸，是哺乳动物神经系统中重要的抑制性神经递质。它参与体内多种代谢活动，具有重要的生理功能，如镇静神经，改善睡眠，美容润肤，降血压，抗癫痫，抗抑郁，延缓脑衰老机能，补充人体抑制性神经递质，促进肾机能改善，抑制脂肪肝及肥胖症等。因为其具备的优良理化特性，目前gaba被广泛应用于食品、医药等领域，一直是国内外研究的热点。但因为gaba价格昂贵，生产成本高，在一定程度上限制了其应用。目前微生物发酵法被认为是安全有效并且快速高效的制备方法，且不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。
3.乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)是指能利用可发酵碳水化合物产生乳酸、无芽孢的革兰氏阳性菌的总称，被美国fda认为是“gras(generally recognized as safe)”级食品添加剂，在食品等工业具有广泛应用。微生物发酵生产gaba主要是指l
‑
谷氨酸(l
‑
glu)在谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，gad)的催化作用下发生脱羧反应，它是利用菌株自身的酶系统来催化gaba的合成。利用乳酸菌在发酵过程中产生gaba，不仅可以大幅缩减成本，简化生产工艺，也能让消费者有不一样的风味体验。
4.但目前存在的一些乳酸菌即使可以代谢产gaba，但不在《可用于食品的菌种名单》内，或者一些菌株在含有牛奶或复原乳等乳制品的发酵体系中发酵性能较差，这些都限制了富含γ
‑
氨基丁酸乳制品的发展和应用。例如，公开号为cn110200070a的专利公开了一种富含gaba的酸奶及其制备方法，采用乳酸乳球菌乳酸亚种和嗜热链球菌的复合菌剂发酵制备酸奶，当复合菌剂的添加量为0.1～10％时，发酵6～16h后酸奶中的gaba含量只有418～450mg/g。从天然发酵食品中筛选出能够在牛乳中代谢高产gaba的可食用菌株，丰富功能乳酸菌资源具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种瑞士乳杆菌、高产gaba的直投式发酵剂及其应用。在该直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌3878与嗜热链球菌3881复配后，能协同提高产γ
‑
氨基丁酸效率，在乳制品的发酵体系中具有较好的产γ
‑
氨基丁酸效果。
6.本发明的具体技术方案为：一株瑞士乳杆菌，所述瑞士乳杆菌命名为3878，已在2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.21812，微生物分类命名为瑞士乳杆菌lactobacillus helveticus。
7.一种高产gaba的直投式发酵剂，包括嗜热链球菌和所述瑞士乳杆菌；所述嗜热链
球菌命名为3881，已在2021年2月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.21811，微生物分类命名为嗜热链球菌streptococcus thermophilus。
8.本发明的瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881分别分离自新疆农家自制酸奶和奶疙瘩，两种菌株均具有较好的产γ
‑
氨基丁酸能力，在乳制品的发酵体系中具有较高的产γ
‑
氨基丁酸效率；同时，这两种菌株还具备良好的耐酸耐胆盐特性，在ph值为2.5以及胆盐含量为0.3％的条件下均能维持较高的存活率；此外，上述两种菌株都是被囊括于卫生部2010年颁布的《可用于食品的菌种名单》的食品级微生物，安全性高。
9.本发明将瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881复配制成复合菌剂后，两种菌株之间能够发挥协同作用，相较于单菌而言具有更高的产γ
‑
氨基丁酸效率，在短时间内即可产生大量gaba。经实验，当将本发明的直投式发酵剂用于酸奶发酵时，在发酵10h后酸奶中的gaba含量即可达到1500mg/kg左右，发酵16h后可达2680mg/kg。
10.作为优选，所述瑞士乳杆菌3878与嗜热链球菌3881的质量比为1:0.1～1000。
11.作为优选，所述瑞士乳杆菌和嗜热链球菌均为冻干菌粉。
12.作为优选，所述瑞士乳杆菌和嗜热链球菌中的活菌数为1.0
×
10
11
～2.0
×
10
11
cfu/g。
13.所述瑞士乳杆菌或所述直投式发酵剂在制备富含γ
‑
氨基丁酸的酸奶中的应用。
14.作为优选，所述应用包括以下步骤：将所述瑞士乳杆菌或所述直投式发酵剂接种到灭菌全脂乳中，进行发酵，获得富含γ
‑
氨基丁酸的酸奶。
15.利用本发明的瑞士乳杆菌3878或直投式发酵剂对灭菌全脂乳进行发酵，能获得具有较高gaba含量的酸奶，且酸奶质地粘稠，结构细腻，无不良风味。
16.作为优选，所述瑞士乳杆菌或所述直投式发酵剂在灭菌全脂乳中的接种量为0.001～1％w/v。
17.作为优选，所述发酵的温度为40～45℃，时间为16～18h。
18.作为优选，所述灭菌全脂乳的制备方法包括以下步骤：将全脂乳粉、浓缩牛奶蛋白、蔗糖和谷氨酸钠溶于水中，均质，获得乳液；对乳液进行灭菌、冷却后，获得灭菌全脂乳。
19.作为优选，所述乳液中，全脂乳粉、浓缩牛奶蛋白、蔗糖和谷氨酸钠的浓度分别为8～12％w/v、0.2～0.3％w/v、7～9％w/v和0.3～0.5％w/v。
20.与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)在本发明的直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881均具有较高的产γ
‑
氨基丁酸能力，将两者复配后，能协同提高产γ
‑
氨基丁酸效率；(2)在本发明的直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881均为是被囊括于卫生部2010年颁布的《可用于食品的菌种名单》的食品级微生物，安全性高，且具有优良的耐酸耐胆盐性能，可作为商业发酵剂使用；(3)采用本发明的直投式发酵剂制得的酸奶中，具有较高的γ
‑
氨基丁酸含量，且质地粘稠，结构细腻，无不良风味。
附图说明
21.图1为本发明瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881的电子显微镜照片；其中，图(a)
为瑞士乳杆菌3878的电子显微镜照片，图(b)为嗜热链球菌3881的电子显微镜照片；图2为本发明对产gaba菌株进行初筛的薄层层析图；其中，泳道1、2、3、4、5分别为5个菌株；图3为实施例6中的发酵产酸曲线图；图4为实施例6、对比例1和对比例2在发酵过程中的gaba含量变化曲线图。
具体实施方式
22.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
23.实施例1：高产γ
‑
氨基丁酸菌株的筛选与鉴定1高产γ
‑
氨基丁酸菌株的筛选(1)培养基的配制mrs液体培养基：葡萄糖20g，酵母膏5g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.25g，吐温80 1ml，蒸馏水1000ml，115℃灭菌20min。
24.mrs固体培养基：在mrs液体培养基基础上添加15g/l琼脂。
25.mrs发酵培养基：在mrs液体培养基基础上添加10g/l的诱导物(谷氨酸钠)。
26.(2)乳酸菌的筛选取新疆采样的酸奶和奶疙瘩等奶制品1ml加入装有9ml的无菌生理盐水中，制成10
‑1浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到适宜浓度，静置备用。取上述各稀释度的菌液100μl涂布于mrs固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养48h后，挑取平板上生长良好的单个菌株于mrs固体平板上反复三区划线，直至整个平板上的菌落形态一致，单菌落接种到mrs液体培养基于37℃培养24h，选取革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性的菌株在含有50％甘油的mrs液体培养基中于～80℃冷冻保存。
27.将上述步骤得到菌株按1％接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，37℃培养24h进行活化，活化后的菌株接种于含10ml全脂牛乳培养基试管中，37℃静置培养至牛乳凝固，按1％接种量接种于含100ml全脂牛乳三角瓶中，37℃静置培养至牛乳凝固，进行感官评价，包括口感，气味和滋味，组织状态等。从中挑选凝乳快、质地粘稠并且风味优良的菌株，所得菌株在含有50％甘油的mrs液体培养基中于～80℃冷冻保存。
28.(3)产γ
‑
氨基丁酸菌株的初筛上述菌株经两次mrs液体培养基37℃培养24h后，接种到含10g/l谷氨酸钠的mrs发酵培养基中，37℃静置培养24h，4 000r/min离心10min，上清液4℃保存备用。
29.菌株初筛采用薄层层析法进行定性分析，判断所筛选的菌株是否为产γ
‑
氨基丁酸的菌株。展开相采用95％乙醇:25％氨水(3:1)，内含0.4wt％的显色剂茚三酮，以gaba标准品做参比，待测样品(上述上清液)点样5μl。采用新华一号层析纸展开结束后于85℃烘干显色10min，将显色结果与标样比较。采用95％乙醇:25％氨水(3:1)的展开相可成功将gaba和谷氨酸分离，从而得到可产gaba菌株。显色结果如图2所示。
30.(4)产γ
‑
氨基丁酸菌株的复筛菌株复筛采用高效液相色谱法(邻苯二甲醛衍生法)进行定量分析。gaba与衍生剂邻苯二甲醛能够反应生成具有较强紫外活性化合物，该衍生物可以溶于流动相溶液中，c18
反向高效液相色谱柱能够对其实现有效分离，同时采用紫外检测器检测，根据保留时间对其定性分析，利用峰面积和标准曲线法对其间接定量。具体步骤如下：1)试剂配制
①
0.4mol/l硼酸缓冲液(ph＝10)：取1.2366g硼酸，用naoh碱液调节溶液ph 10，用水定容至50.00ml容量瓶中。
31.②
0.1mol/l nahco3(ph＝9.5)溶液：取8.4g nahco3，用水定容至1000ml容量瓶中，并用naoh碱液调节溶液ph9.5。
32.③
邻苯二甲醛衍生试剂：取20mg邻苯二甲醛溶解于0.5ml甲醇中，加入9.0ml硼酸缓冲液，超声溶解，再加0.5mlβ
‑
巯基乙醇，过0.22um滤膜，4℃避光放置。
33.④
0.1mol/l醋酸钾溶液(ph＝5.9)：取9.814g醋酸钾，用醋酸调节溶液ph 5.9，用水定容至1000ml容量瓶中。
34.2)样品衍生衍生条件：处理好的上清液500ul，加入衍生溶液100ul，记录下加入时的时间，将溶液摇匀，衍生反应计时2min时准时进样。标品衍生条件一致。
35.标准曲线的配置：将γ
‑
氨基丁酸标准品用双蒸水分别配置成浓度为50mg/l、100mg/l、200mg/l、400mg/l、600mg/l、1000mg/l的6种标准工作液，分别衍生进样后，以γ
‑
氨基丁酸的色谱峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。
36.3)常规液相色谱条件色谱条件：色谱柱：安捷伦mmsbc
‑
18色谱柱(250
×
4.6mm，5μm)；流动相：醋酸钾缓冲盐缓冲液(0.1mol/ml，ph＝5.90)∶甲醇；流速：0.96ml/min；柱温：35℃；检测波长：340nm；进样量：20μl。
37.流动相梯度洗脱浓度如表1所示。
38.表1t/min醋酸钾溶液甲醇溶液0554523565730707.25545125545经过产γ
‑
氨基丁酸菌株的筛选，最终得到两株高产gaba的菌株，编号为3878和3881，并且两株菌协同发酵产gaba效果较单菌有显著提高：在含有10g/l谷氨酸钠的mrs发酵培养基37℃培养24h，菌株3878和3881单独发酵分别可产生115mg/l和465mg/l gaba，两者协同发酵可产生3000mg/l gaba。
39.2高产γ
‑
氨基丁酸菌株的鉴定(1)形态学鉴定将菌株在mrs琼脂培养基培养48h后，观察记录菌株在平板上的单菌落特征。经过革兰氏染色后用显微镜观察细胞形态，3878菌株和3881菌落的电子显微镜照片分别如图1(a)和图1(b)所示。
40.3878菌株在mrs琼脂培养基中生长形态为浅白色菌落，微透明、圆形、表面粗糙、边缘不整齐。革兰氏染色阳性，显微镜下观察细胞呈长杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动。
41.3881菌落为圆形，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致。革兰
氏染色呈阳性，不生芽，球形，成对或成链状。
42.(2)16s rdna序列分析
①
细菌基因组dna的提取吸取100μl 3878菌株和3881菌株菌悬液于灭菌后的m17液体培养基中，于40℃培养24h。按细菌基因组dna抽提试剂盒操作步骤提取菌株基因组dna。
43.②
pcr扩增pcr引物为：上游引物8f：5
’‑
agagtttgatcatggctcag
‑3’
下游引物1492r：5
’‑
acggttaccttgttacgactt
‑3’
pcr反应条件为：95℃预热3min，95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次，72℃保持5min，4℃保温。
44.③
琼脂糖凝胶电泳用移液枪先吸取2μl loading buffer，再吸取5μl pcr扩增产物，反复抽吸混匀，混合液加到样品槽中。待测样品加样完毕后，在电泳槽一端加入5μl dna marker。在120v恒电压、80a恒电流下进行电泳，当loading buffer指示剂移动到凝胶底部时，取出凝胶用凝胶成像仪在uv下成像，扩增片段长度为1.5kb左右。
45.④
16s rdna测序及序列比对阳性pcr产物送样至金唯智生物科技有限公司测序，测序结果在ncbi数据库中应用blast工具与genbank数据库已有序列进行比对分析，分析待测菌株与已知菌株相应序列的同源性，确定筛选出来的产糖菌株种属。
46.根据其生理生化特性及16s rrna序列分析的结果，确定筛选的乳酸菌3878为瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)，乳酸菌3881为嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)。
47.实施例2：菌株耐酸耐胆盐能力菌株耐酸能力3878和3881菌株经过连续两次传代后，取对数生长末期菌液，4000r/min离心10min，去掉上清，获得菌泥。加入与培养液相同体积ph 2.5的mrs或m17溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育1h、2h、3h后菌数的变化，设置三个平行。测得的不同时间下的活菌数见表2。
48.表2表2耐酸性实验结果显示：ph2.5在2h对两株菌的存活性没有显著的影响，3h时，3878菌株的活菌数降低0.7个数量级，3881菌株的活菌数降低0.81个数量级。正常人体胃液的ph值在1.5～4.5之间波动变化，菌株可在ph值为2.5的条件维持较高的存活率，表明3878菌株
和3881两菌株均具有优良的耐酸性。
49.菌株耐胆盐能力3878和3881菌株经过连续两次传代后，取对数生长末期菌液，4000r/min离心10min，去掉上清，获得菌泥。加入与培养液相同体积的含0.3％胆盐的mrs或m17溶液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育4h、8h后菌数的变化，设置三个平行。测得的不同时间下的活菌数见表3。
50.表3耐胆盐性实验结果显示：菌株在胆盐含量为0.3％的条件下仍然能够维持一定水平的存活率，间接说明3878菌株和3881两菌株具有较高的胆盐耐受能力。
51.实施例3：高产gaba的直投式发酵剂的制备1 3878和3881菌株冻干菌粉的制备将甘油管保存的瑞士乳杆菌3878菌株按1％的接种量接种于其优化培养基中，37℃培养箱中培养24h，活化3代后，接种于10l发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃培养15h，得到发酵液。8000r/min、4℃离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(ph 7.0)漂洗菌体1次，得到3878菌株的菌泥。
52.将甘油管保存的嗜热链球菌3881菌株按1％的接种量接种于其优化培养基中，43℃培养箱中培养24h，活化3代后，接种于10l发酵罐中进行高密度厌氧培养，于43℃培养12h，得到发酵液。8000r/min、4℃离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(ph7.0)漂洗菌体1次，得到3881菌株的菌泥。
53.将制得的两种菌泥分别以1:5的质量比与保护剂溶液(含乳粉、蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠和甘油)充分搅拌混匀。混合液于～80℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上。放入真空冷冻干燥箱干燥20h后，得瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉。平板计数得瑞士乳杆菌3878冻干菌粉中活菌数为1.1
×
10
11
cfu/g，嗜热链球菌3881冻干菌粉中活菌数为1.6
×
10
11
cfu/g。
54.2高产gaba的直投式发酵剂的制备将上述得到的瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉在洁净恒温恒湿操作间按质量比1:1进行充分混匀后进行包装，制备成高产gaba直投式菌粉发酵剂，于～20℃密封保存备用。
55.实施例4：高产gaba的直投式发酵剂的制备本实施例与实施例3的区别仅在于，直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉的质量比为1:0.1。
56.实施例5：高产gaba的直投式发酵剂的制备本实施例与实施例3的区别仅在于，直投式发酵剂中，瑞士乳杆菌3878冻干菌粉和嗜热链球菌3881冻干菌粉的质量比为1:1000。
57.实施例6：高产gaba直投式发酵剂在制备富含gaba酸奶中的应用本实施例中，全脂乳粉和浓缩牛奶蛋白粉均购自于新西兰恒天然集团。
58.1富含gaba酸奶的制备将全脂乳粉、浓缩牛奶蛋白、蔗糖和谷氨酸钠溶于55℃蒸馏水中，均质，获得全脂乳粉、浓缩牛奶蛋白、蔗糖和谷氨酸钠含量分别为10％(w/v)、0.2％(w/v)、8％(w/v)和0.4％(w/v)的乳液；将乳液95℃灭菌10min，冷却至43℃，得灭菌全脂乳。将实施例3中制得的直投式发酵剂按0.02％(w/v)的接种量接种于灭菌全脂乳中，43℃静置发酵16h后，对发酵乳进行柔和搅拌破乳，快速冷却至15℃，即得到富含γ
‑
氨基丁酸的酸奶。
59.得到的富含gaba的酸奶奶香浓郁、色泽均匀、无乳清、结构细腻、质构粘稠，风味良好。
60.2酸奶理化指标测定1)酸奶中gaba含量的检测采用实施例1中γ
‑
氨基丁酸含量的检测方法对酸奶中gaba含量进行检测的，gaba含量高达2680mg/kg。在发酵过程中，gaba含量随时间的变化如图4所示。
61.2)ph值测定采用梅特勒
‑
托利多mettler toledo ph计直接测定，三次平行实验，取平均值。
62.实验测得富含gaba的酸奶的终点ph为3.80
±
0.15，发酵过程中的ph变化如图3所示。
63.3)滴定酸度的测定参照gb 5009.239
‑
2016中的方法，称取10g(精确到0.001g)已混匀的试样，置于150ml锥形瓶中，加20ml新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液电位滴定至ph 8.3为终点。滴定过程中，向锥形瓶中吹氮气，防止溶液吸收空气中的二氧化碳。记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数(v1)，代入下式中进行计算。三次平行实验，取平均值。
64.式中：x1——样品的酸度，单位为度(
°
t)[以100g样品所消耗的0.1mol/l氢氧化钠的毫升数计，单位为毫升每100克(ml/100g)]；c1——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/l)；v1——滴定时所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；v0——空白实验所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)；100——100g样品；m1——样品的质量，单位克(g)；0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/l)。
[0065]
实验测得嗜热链球菌冻干发酵酸乳的终点酸度为90
°
t。
[0066]
4)酸乳粘度的测定采用流变仪(美国博勒飞公司dv2t型)，在4℃下测试粘度，转子型号为64，分别在30r/min的速度下测定三次，选取第30s的数据为测量值。三次平行实验，取平均值。
[0067]
实验测得富含gaba的酸奶的粘度为2366mpa
·
s。粘稠的质感赋予酸奶良好的品质。
[0068]
实施例7：高产gaba直投式发酵剂在制备富含gaba酸奶中的应用本实施例与实施例6的区别仅在于，在富含gaba酸奶的制备过程中，将实施例3制得的直投式发酵剂换成实施例4制得的直投式发酵剂，直投式发酵剂在灭菌全脂乳中的接种量为0.001％(w/v)，静置发酵的温度为40℃，时间为18h。
[0069]
实施例8：高产gaba直投式发酵剂在制备富含gaba酸奶中的应用本实施例与实施例6的区别仅在于，在富含gaba酸奶的制备过程中，将实施例3制得的直投式发酵剂换成实施例4制得的直投式发酵剂，直投式发酵剂在灭菌全脂乳中的接种量为1％(w/v)，静置发酵的温度为45℃，时间为17h。
[0070]
对比例1：瑞士乳杆菌3878在制备富含gaba酸奶中的应用本对比例与实施例6的区别仅在于，在富含gaba酸奶的制备过程中，将实施例3制得的直投式发酵剂换成等质量的实施例3中制得的瑞士乳杆菌3878冻干菌粉。
[0071]
本对比例制得的酸奶中，gaba含量为285mg/kg。在发酵过程中，gaba含量随时间的变化如图4所示。
[0072]
对比例2：嗜热链球菌3881在制备富含gaba酸奶中的应用本对比例与实施例6的区别仅在于，在富含gaba酸奶的制备过程中，将实施例3制得的直投式发酵剂换成等质量的实施例3中制得的嗜热链球菌3881冻干菌粉。
[0073]
本对比例制得的酸奶中，gaba含量为655mg/kg。在发酵过程中，gaba含量随时间的变化如图4所示。
[0074]
对比实施例6、对比例1和对比例2发酵过程中gaba含量随时间的变化情况，以及最终制得的酸奶中的gaba含量，可以看出：相较于单一菌株发酵而言，采用瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881共同发酵，获得的酸奶具有更高的gaba含量。这说明瑞士乳杆菌3878和嗜热链球菌3881之间能发挥协同作用，提高产γ
‑
氨基丁酸的效率。
[0075]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0076]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。