一种细胞内吞释放响应的化合物及其应用的制作方法

1.本发明属于基因治疗领域，具体涉及一种细胞内吞释放响应化合物及其应用。


背景技术：

2.基因治疗(gene therapy)是一种是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，从而达到治疗目的。基因治疗用于有效治疗先天性及后天性疾病，已在癌症、x染色体相关重度免疫缺陷等疾病治疗中显示出巨大的治疗潜力。常见基因药物有小干扰rna(sirna)、质粒dna(pdna)、小发卡rna(shrna)、反义寡核苷酸(odn)、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)等。质粒dna，即pdna，是一类自然存在常见于细菌中的小型环状双链dna，有时也见于古生菌和真核细胞中。pdna常被视作复制子，可在不同的宿主细胞中实现自主复制。在基因工程中，人工构建的质粒常用作特殊基因的载体。
3.基因药物的导入方法主要包括：物理方法、病毒载体介导方法及非病毒载体介导方法。物理方法即是通过电穿孔、高压注射、磁转染、基因枪等方式将基因药物输送到靶细胞内。物理方法大都能高效地实现基因药物直接进入细胞并实现表达，但目前因电压刺激、器官损伤等原因尚难以进入临床，仍限于实验用动物阶段。病毒载体介导的基因输送主要包括腺病毒转染、慢病毒转染及逆转录病毒转染。病毒转染虽然具有高效、准确的优点，但以病毒为载体的基因输送仍然有较大局限性，包括潜在的致瘤性、免疫原性及广泛的组织嗜性且制备较为困难。非病毒载体介导的方法是指利用脂质体、聚合物、无机材料等方法实现基因的输送。能够有效解决病毒载体存在的局限性，在安全性上远胜病毒载体且容易制备。具有高转染效率、低免疫原性、易进行化学修饰及易放大生产等优点。
4.然而，目前常用的非病毒载体任然存在着诸多问题。例如，采用阳离子脂质体进行导入时，阳离子脂质/核酸复合物在输送过程中会遇到一系列的细胞外和细胞内障碍，由于复合物带有较强的正电荷，在细胞外环境中，这些复合物首先会与血液中带负电荷的白蛋白发生结合，形成较为大的颗粒，因此，容易被网状上皮细胞识别并清除，很难到达靶部位。此外，阳离子/核酸复合物表面带较多的正电荷还易引起细胞毒性，对正常组织造成伤害。为解决上述问题，许多研究者尝试对复合物表面进行peg修饰，以遮蔽较多的正电荷，防止聚集，从而提高复合物的体液稳定性，并延长复合物在体内的循环时间。然而，常规peg(dspe
‑
peg2000较为常用)修饰虽在稳定基因递送方面显示了非常突出的优点，但是也存在修饰后的制剂转染效率低的问题。
5.综上所述，本领域迫切需要开发一类新的用于导入基因药物的脂质体或所述脂质体与基因药物形成的复合物，这些复合物在细胞外环境中稳定性高、不易被清除、细胞毒性小，且使用该类化合物进行转染时转染效率高。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种用于将基因药物(如核酸)导入靶细胞的新化合物。
7.在本发明的第一方面，提供了一种化合物，所述化合物如式i所示，
[0008][0009]
其中，
[0010]
r1为亲脂性头部；
[0011]
r8为亲水性链(较佳地，为peg)；
[0012]
x选自下组：o、s、nr
a
；
[0013]
y选自下组：o、s；
[0014]
r2选自下组：无、r7‑
l
‑
r9‑
w；且当r2为r7‑
l
‑
r9‑
w时，r7与“c＝n”连接；
[0015]
r7选自下组：取代或未取代的c1
‑
c6烷基、取代或未取代的c6
‑
c12芳基(较佳地，苯基)；r7中，所述的取代是指基团中的一个或多个氢被选自下组的一个或多个(较佳地，1
‑
3个)取代基所取代：氘、卤素(f、cl、br、i)、氰基、硝基、n(r
a
)2、c1
‑
c6烷基、c3
‑
c8环烷基、c6
‑
c10芳基、5至12元杂芳基、5至10元杂环基；
[0016]
l选自下组：无、o、s、取代或未取代的c1
‑
c6亚烷基、取代或未取代的c3
‑
c6亚环烷基；
[0017]
r9为选自下组：无、c1
‑
c6亚烷基、取代或未取代的c6
‑
c12芳基(较佳地，c6
‑
c10芳基；更佳地，苯基)、取代或未取代的5至12元杂芳基(较佳地，5至10元杂芳基；更佳地，5至6元杂芳基)、取代或未取代的c3
‑
c12亚环烷基、取代或未取代的5至10元杂环基；
[0018]
w选自下组：无、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
r’c(o)r
”‑
、
‑
r’c(o)or
”‑
、
‑
r’oc(o)r
”‑
、r’s(o)r
”‑
、
‑
r’s(o)2r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’c(o)n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’c(o)on(r
a
)r
”‑
、
‑
r’oc(o)n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’s(o)n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’s(o)2n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)c(o)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)oc(o)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)c(o)or
”‑
、
‑
r’n(r
a
)s(o)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)s(o)2r
”‑
；
[0019]
r’和r”各自独立地选自下组：无、未取代或被1
‑
3个r
b
所取代的c1
‑
c6亚烷基；r
b
为取代或未取代的选自下组的基团：氘、c1
‑
c6烷基、苯基、苄基、杂芳基、c3
‑
c6环烷基、4至7元杂环基；
[0020]
r3选自下组：取代或未取代的c3
‑
c12环烷基(较佳地，c5
‑
c7环烷基)、取代或未取代的5至12元杂环基、取代或未取代的c6
‑
c12芳基(较佳地，c6
‑
c10芳基；更佳地，苯基)、取代或未取代的5至12元杂芳基(较佳地，5至10元杂芳基；更佳地，5至6元杂芳基)；
[0021]
r
10
各自独立地选自下组：h、氘、c1
‑
c6烷氧基、羟基、n(r
a
)2、c1
‑
c6酰胺基(
‑
nr
a
‑
co
‑
c1
‑
c6烷基)、c1
‑
c6酰氧基(
‑
o
‑
co
‑
c1
‑
c6烷基)、c1
‑
c6烷基、取代或未取代的c6
‑
c12芳基、取代或未取代的5至12元杂芳基、取代或未取代的c6
‑
c12亚环烷基、取代或未取代的5至10元杂环基；且o＝0、1、2或3；
[0022]
r
a
为取代或未取代的选自下组的基团：h、氘、c1
‑
c6烷基、c2
‑
c6烯基、c2
‑
c6炔基、c6
‑
c12芳基(较佳地苯基)、5至12元杂芳基(较佳地5或6元杂芳基)、c3
‑
c12环烷基(较佳地c3
‑
c6环烷基)、4至12元杂环基(较佳地4至7元杂环基)；或者，相邻的2个r
a
以及与其相连共同构成取代或未取代的5至12元杂芳基(较佳地5或6元杂芳基)或取代或未取代的4至12元杂环基(较佳地4至7元杂环基)；
[0023]
除非特别定义，所述取代是指基团上一个或多个(较佳地1
‑
3个)氢被选自下组的
取代基所取代：氘、卤素(较佳地f、cl、br)、氰基、羟基、硝基、n(r
d
)2、c1
‑
c6烷基、c1
‑
c6卤代烷基、c1
‑
c6氘代烷基、c2
‑
c6烯基、c2
‑
c6炔基、c6
‑
c12芳基(较佳地苯基)、5至12元杂芳基(较佳地5或6元杂芳基)、c3
‑
c12环烷基(较佳地c3
‑
c6环烷基)、4至12元杂环基(较佳地4至7元杂芳基)、c1
‑
c6烷氧基、
‑
c(o)or
d
、
‑
oc(o)r
d
、
‑
so
2 r
d
、
‑
c(o)r
d
、
‑
nr
d
c(o)r
d
；
[0024]
r
d
各自独立地选自下组：h、氘、c1
‑
c6烷基。
[0025]
在另一优选例中，所述亲脂性头部包括衍生自脂质(较佳地，中性脂质)或为c10
‑
c20饱和或不饱和烃基的亲脂端；且所述亲脂端通过连接基团与x连接，或者直接与x连接。
[0026]
在另一优选例中，所述c10
‑
c20饱和或不饱和的烃基含有0、1、2、3、4或5个双键或三键。
[0027]
在另一优选例中，所述c10
‑
c20饱和或不饱和的烃基为直链或支链烃基。
[0028]
在另一优选例中，所述的中性脂质包括：固醇类脂质、磷脂酰胆碱类脂质、磷脂酰乙醇胺类脂质、鞘氨醇磷脂类脂质，或其组合。
[0029]
在另一优选例中，所述固醇类脂质包括：胆固醇(chol)。
[0030]
在另一优选例中，所述磷脂酰胆碱(pc)类脂质包括：dppc(1，2
‑
二棕榈酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰胆碱)、dmpc(1,2
‑
二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)、ddpc(1，2
‑
二癸酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰胆碱)、dspc(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、dopc(二油酰基磷脂酰胆碱)，或其组合物。
[0031]
在另一优选例中，所述磷脂酰乙醇胺(pe)类脂质包括：dspe(二硬脂酰基
‑
磷脂酰乙醇胺)、dppe(二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺)、dope(二油酰基磷脂酰乙醇胺)、dlpe(二月桂酰基磷脂酰乙醇胺)，或其组合。
[0032]
在另一优选例中，所述鞘氨醇磷脂类脂质包括：神经酰胺。
[0033]
在另一优选例中，所述亲脂端为衍生自选自下组的脂质的基团：chol、dspe、神经酰胺。
[0034]
在另一优选例中，r1为如式i
‑
a所示基团，
[0035]
r
1a
‑
w
a
‑
l
a
‑
(i
‑
a)
[0036]
其中，r
1a
为衍生自中性脂质的基团，或为c10
‑
c20饱和或不饱和的烃基；
[0037]
w
a
选自下组：无、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
r’c(o)r
”‑
、
‑
r’c(o)or
”‑
、
‑
r’oc(o)r
”‑
、r’s(o)r
”‑
、
‑
r’s(o)2r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’c(o)n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’c(o)on(r
a
)r
”‑
、
‑
r’oc(o)n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’s(o)n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’s(o)2n(r
a
)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)c(o)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)oc(o)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)c(o)or
”‑
、
‑
r’n(r
a
)s(o)r
”‑
、
‑
r’n(r
a
)s(o)2r
”‑
；
[0038]
l
a
为
‑
(z)
n
‑
；其中，z各自独立地选自下组：c(r
c
)2、c3
‑
c6环烷基、o、s、nr
a
；
[0039]
n为2
‑
20的整数，r
c
各自独立地选自下组：氢、氘、c1
‑
c6烷基(较佳地，c1
‑
c4烷基；更佳地，选自：甲基、乙基)；
[0040]
r
a
、r’和r”的定义同前。
[0041]
在另一优选例中，z为ch2。
[0042]
在另一优选例中，r
1a
为衍生自选自下组脂质的基团：胆固醇、dopc、dope、ddpc、ddpe、dlpc、dlpe、dmpc、dmpe、dppc、dppe、dspc、dspe、dphype、鞘磷脂、神经酰胺、甘油二脂、鞘氨醇；或者r
1a
为c10
‑
c20饱和或不饱和的烃基。
[0043]
在另一优选例中，r
1a
为衍生自选自下组脂质的基团：chol、dspe(1，2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱)、神经酰胺(ceramide)、dope、dspc；或者r
1a
为c10
‑
c20饱和或不饱
和的烃基。
[0044]
在另一优选例中，n＝2、3、4、5、6、7或8；较佳地，n＝2、3、4、5或6。
[0045]
在另一优选例中，l
a
为
‑
(ch2)
n
‑
；较佳地，l
a
为
‑
(ch2)2‑8‑
；更佳地，l
a
为
‑
(ch2)2‑6‑
。
[0046]
在另一优选例中，r’和r”为无。
[0047]
在另一优选例中，w
a
选自下组：无、
‑
o
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
oc(o)nh
‑
。
[0048]
在另一优选例中，w
a
选自下组：无、
‑
o
‑
、
‑
c(o)nh2‑
。
[0049]
在另一优选例中，r
1a
选自下组：chol、dspe、神经酰胺(ceramide)；较佳地，r
1a
为chol。
[0050]
在另一优选例中，r1为chol
‑
oc(o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑5‑
、chol
‑
c(o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑5‑
或chol
‑
o
‑
(ch2)5‑8‑
；更佳地，r1为chol
‑
o
‑
c(o)
‑
nh
‑
(ch2)3‑
或chol
‑
o
‑
(ch2)6‑
。
[0051]
在另一优选例中，r1为chol
‑
c(o)
‑
nh
‑
(ch2)2‑5‑
或chol
‑
o
‑
(ch2)5‑8‑
；更佳地，r1为chol
‑
o
‑
c(o)
‑
nh
‑
(ch2)3‑
或chol
‑
o
‑
(ch2)6‑
。
[0052]
在另一优选例中，r3选自下组：取代或未取代的c3
‑
c12环烷基(较佳地，c3
‑
c7环烷基)、取代或未取代的c6
‑
c12芳基(较佳地，c6
‑
c8芳基)。
[0053]
在另一优选例中，r3基团中，所述的取代是指基团中1或2个氢被选自下组的基团取代：羟基、c1
‑
c6烷氧基。
[0054]
在另一优选例中，r3为取代或未取代的c6
‑
c8芳基，且所述的取代是指基团中1个氢被选自下组的基团取代：羟基、c1
‑
c3烷氧基。
[0055]
在另一优选例中，r3选自下组：苯基、羟基苯基、c1
‑
c3烷氧基苯基、环己基；较佳地，r3为苯基。
[0056]
在另一优选例中，r3为衍生自选自下组化合物的基团：为衍生自选自下组化合物的基团：较佳地，r3为
[0057]
在另一优选例中，r7为苯环或c1
‑
c6亚烷基。
[0058]
在另一优选例中，l选自下组：无、o。
[0059]
在另一优选例中，r9为选自下组：无、c1
‑
c6亚烷基(较佳地(ch2)1‑2)、c6
‑
c12芳基(较佳地苯基)。
[0060]
在另一优选例中，w选自下组：无、c(o)nh。
[0061]
在另一优选例中，r2选自下组：无、
‑
苯基
‑
c(o)nh
‑
、
‑
苯基
‑
o
‑
(ch2)1‑2‑
c(o)nh
‑
、
‑
苯基
‑
o
‑
苯基
‑
c(o)nh
‑
、
‑
苯基
‑
苯基
‑
c(o)nh
‑
、
‑
(ch2)1‑2‑
o
‑
(ch2)1‑2‑
c(o)nh
‑
(
‑
c(o)nh
‑
与亲水链连接)。
[0062]
在另一优选例中，r8为peg(聚乙二醇)。
[0063]
在另一优选例中，r8为平均分子量为190～22000的peg(即peg
200～20000
)。
[0064]
在另一优选例中，r8为平均分子量为1800
‑
2200的peg(即peg
2000
)。
[0065]
在另一优选例中，所述化合物如式ii所示，
[0066][0067]
其中，
[0068]
r4、r5和r6的定义同权利要求1中r
e
的定义；
[0069]
r1、r2、r3、r8、x和y的定义同权利要求1中定义。
[0070]
在另一优选例中，r4、r5和r6各自独立地选自下组：h、氘、c1
‑
c6烷氧基、羟基、n(r
a
)2、c1
‑
c6酰胺基、c1
‑
c6酰氧基、c1
‑
c6烷基、取代或未取代的c6
‑
c12芳基、取代或未取代的5至12元杂芳基、取代或未取代的c6
‑
c12亚环烷基、取代或未取代的5至10元杂环基。
[0071]
在另一优选例中，r4、r5和r6各自独立地选自下组：h、氘、c1
‑
c6烷氧基；较佳地，r4、r5和r6各自独立地为h或氘。
[0072]
在另一优选例中，所述化合物如式iii
‑
a所示，
[0073][0074]
其中，
[0075]
m＝200
‑
20000；
[0076]
r1、r2、r3、r4、r5、r6、x和y的定义同权利要求1中定义。
[0077]
在另一优选例中，m＝1000～4000；较佳地，m＝2000。
[0078]
在另一优选例中，所述化合物如式iii
‑
b所示，
[0079][0080]
其中，
[0081]
r
1a
为衍生自的中性脂质的基团，或为c10
‑
c20饱和或不饱和的烃基；
[0082]
w
a
选自下组：
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、c(o)
‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
oc(o)
‑
、s(o)
‑
、
‑
s(o)2‑
、
‑
nh
‑
、
‑
c(o)nh
‑
、
‑
c(o)onh
‑
、
‑
oc(o)nh
‑
、
‑
s(o)nh
‑
、
‑
s(o)2nh
‑
、
‑
nhc(o)
‑
、
‑
nhoc(o)
‑
、
‑
nhc(o)o
‑
、
‑
nhs(o)
‑
、
‑
nhs(o)2‑
；较佳地，w
a
选自下组：
‑
o
‑
、
‑
oc(o)nh
‑
、
‑
nhc(o)o
‑
；
[0083]
n为2
‑
20的整数(较佳地，n＝2、3、4、5、6、7或8)；
[0084]
r2、r3、r4、r5、r6、x和y的定义同权利要求1中定义。
[0085]
在另一优选例中，r
1a
如前定义。
[0086]
在另一优选例中，wa为
‑
o
‑
时，n＝5、6、7或8。
[0087]
在另一优选例中，wa为
‑
oc(o)nh
‑
或
‑
nhc(o)o
‑
时，n＝2、3、4或5。
[0088]
在另一优选例中，所述化合物如式iii
‑
c或式iii
‑
d所示，
[0089][0090]
其中，r
1a
、r3、r4、r5、r6、r9、y、l、w
a
、w、m和n的定义如前所述。
[0091]
在另一优选例中，各式(式i、式ii、式iii
‑
a、式iii
‑
b、式iii
‑
c或式iii
‑
d)中各基团定义同表1中化合物中所对应的基团。
[0092]
在另一优选例中，所述化合物选自表1中的化合物。
[0093]
在本发明的第二方面，提供了一种中间体i，所述中间体i如式iv所示，
[0094][0095]
其中，r1、r3、r4、r5、r6、x和y的定义同第一方面中定义。
[0096]
在另一优选例中，所述中间体i如式iv
‑
a所示，
[0097][0098]
其中，r
1a
、w
a
、r3、r4、r5、r6、y和n的定义如前所述。
[0099]
在本发明的第三方面，提供了一种中间体ii，所述中间体如式v所示，
[0100][0101]
其中，
[0102]
w
b
为活性连接基团；
[0103]
r1、r3、r4、r5、r6、r9、l、x和y的定义同第一方面定义。
[0104]
在另一优选例中，w
b
选自下组：
‑
r’cooh、
‑
r’c(o)h、
‑
r’oh、
‑
r’n(r
a
)h、
‑
r’so3h、
‑
r’so2h；其中，r’和r
a
的定义如前所述。
[0105]
在另一优选例中，w
b
为
‑
r’cooh；较佳地，w
b
为
‑
cooh。
[0106]
在另一优选例中，所述中间体ii如式v
‑
a所示，
[0107][0108]
其中，
[0109]
r
1a
、w
a
、r3、r4、r5、r6、y、l、r9、w
b
和n的定义如前所述。
[0110]
在另一优选例中，w
b
选自下组：
‑
cooh、
‑
oh、
‑
nh2。
[0111]
在本发明的第四方面，提供了一种如第一方面所述化合物的制备方法，所述化合物通过方法一或方法二制备得到；
[0112]
方法一：
[0113]
(1.1)在第一惰性溶剂中，使中间体i与nh2‑
r8发生反应，从而得到如式i所示的化合物；或者
[0114]
方法二：
[0115]
(2.1)在第一惰性溶剂中，使中间体i与nh2‑
r2‑
w
b
发生反应，从而得到中间体ii；和
[0116]
(2.2)在第二惰性溶剂中，使步骤(1)中得到中间体ii与w
c
‑
r8发生反应，从而得到如式i所示的化合物；
[0117]
其中，w
b
和w
c
各自独立地为相同或不同的活性基团；所述中间体i为如式iv所示的中间体，中间体ii为如式v所示的中间体；r2和r8的定义同权利要求1中的定义。
[0118]
在另一优选例中，活性基团w
b
和活性基团w
c
能够反应形成基团w。
[0119]
在另一优选例中，方法一中，中间体i为如式iv
‑
a所示的中间体。
[0120]
在另一优选例中，方法二中，中间体i为如式iv
‑
a所示的中间体且中间体ii为如式v
‑
a所示的中间体。
[0121]
在另一优选例中，w
b
选自下组：
‑
r’cooh、
‑
r’c(o)h、
‑
r’oh、
‑
r’n(r
a
)h、
‑
r’so3h、
‑
r’so2h；其中，r’和r
a
的定义如前所述；较佳地，w
b
为
‑
r’cooh。
[0122]
在另一优选例中，w
c
选自下组：
‑
r”cooh、
‑
r”c(o)h、
‑
r”oh、
‑
r”n(r
a
)h、
‑
r”so3h、
‑
r”so2h；其中，r”和r
a
的定义如前所述；较佳地，w
c
为
‑
r”nh2。
[0123]
在另一优选例中，步骤(1.1)中，中间体i与nh2‑
r8的摩尔比为(0.8～1.2):1。
[0124]
在另一优选例中，步骤(2.1)中，中间体i与nh2‑
r2‑
w
b
的摩尔比为(0.8～1.2):1。
[0125]
在另一优选例中，步骤(2.2)中，中间体ii与w
c
‑
r8的摩尔比为(0.8～1.2):1。
[0126]
在另一优选例中，步骤(1.1)的反应温度为20～150℃；较佳地，20～100℃。
[0127]
在另一优选例中，步骤(1.1)的反应时间为2～48h；较佳地，10～48h。
[0128]
在另一优选例中，步骤(2.1)的反应温度为20～150℃；较佳地，20～100℃。
[0129]
在另一优选例中，步骤(2.1)的反应时间为2～48h；较佳地，10～48h。
[0130]
在另一优选例中，步骤(2.2)的反应温度为0～100℃；较佳地，10～50℃；更佳地，15～40℃。
[0131]
在另一优选例中，步骤(2.2)的的反应时间为10～48h；较佳地，20～30h；更佳地，
24h。
[0132]
在另一优选例中，所述第一惰性溶剂选自下组：甲醇、乙醇、甲苯、二氯甲烷，或其组合。
[0133]
在另一优选例中，所述第二惰性溶剂选自下组：二氯甲烷、甲醇、乙醇，或其组合。
[0134]
在本发明的第五方面，提供了一种如第一方面所述的化合物的用途，用于修饰脂质体和/或脂质
‑
药物复合物。
[0135]
在另一优选例中，经修饰的脂质体和/或脂质
‑
药物复合物具有细胞內吞释放响应功能。
[0136]
在另一优选例中，所述脂质
‑
药物复合物为由脂质体与药物复合而成的脂质
‑
药物复合物。
[0137]
在另一优选例中，所述的药物为基因药物。
[0138]
在另一优选例中，所述基因药物为核酸。
[0139]
在另一优选例中，所述基因药物选自下组：rna(sirna)、质粒dna(pdna)、小发卡rna(shrna)、反义寡核苷酸(odn)、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)。
[0140]
在另一优选例中，所述的脂质体包括阳离子脂质和任选的辅助脂质。
[0141]
在另一优选例中，所述阳离子脂质包括：dotap(n
‑
[1
‑
(2,3
‑
双油酰氧基)丙基]
‑
n,n,n
‑
三甲基铵盐)、dodac(n,n
‑
二油烯基
‑
n,n
‑
二甲基氯化铵)、ddab(n,n
‑
二硬脂基
‑
n,n
‑
二甲基溴化铵)、dodap(1,2
‑
二油酰基
‑3‑
二甲基铵
‑
丙烷)、dotma(n
‑
(1
‑
(2,3
‑
二油烯基氧基)丙基)
‑
n,n,n
‑
三甲基氯化铵)、docdap(1,2
‑
二油酰基氨甲酰基
‑3‑
二甲基铵
‑
丙烷)、dlindap(1,2
‑
二亚油酰基
‑3‑
二甲基铵
‑
丙烷)、dltap(二月桂基(c12:0)三甲基铵丙烷)、dogs(二
‑
十八烷基氨基甘氨酰基精胺)、dc
‑
chol(3β
‑
[n
‑
(n’,n
’‑
二甲氨基乙基)]
‑
胆固醇)、dospa(二油酰基氧基
‑
n
‑
[2
‑
精胺甲酰胺基)乙基}
‑
n,n
‑
二甲基
‑1‑
丙烷三氟乙酸铵)、dmrie(1,2
‑
二肉豆蔻基氧基丙基
‑3‑
二甲基
‑
羟乙基溴化铵)、clindma(3
‑
二甲基氨基
‑2‑
(胆甾
‑5‑
烯
‑3‑
β
‑
氧基丁烷
‑4‑
氧基)
‑1‑
(顺,顺
‑
9,12
‑
十八碳二烯酰氧基)丙烷)、dodma(n,n
‑
二甲基
‑
2,3
‑
二油烯基氧基)丙胺)、cplindma(2
‑
[5
’‑
(胆甾
‑5‑
烯
‑
3[β]
‑
氧基)
‑3’‑
氧杂戊氧基)
‑3‑
二甲基
‑1‑
(顺,顺
‑9’
,12
’‑
十八碳二烯酰氧基)丙烷)和dmoba(n,n
‑
二甲基
‑
3,4
‑
二油烯基氧基苄基胺)，以及docarbdap(1,2
‑
n,n
’‑
二油烯基氨甲酰基
‑3‑
二甲基氨基丙烷)。
[0142]
在另一优选例中，所述阳离子脂质包括：dotap、dotam、dospa、dogs，或其组合。
[0143]
在另一优选例中，所述辅助脂质包括：固醇类脂质、磷脂酰胆碱类脂质、磷脂酰乙醇胺类脂质、鞘氨醇磷脂类脂质，或其组合；较佳地，所述辅助脂质为固醇类脂质；更佳地，所述脂质为胆固醇(chol)。
[0144]
在另一优选例中，所述固醇类脂质包括：胆固醇(chol)。
[0145]
在另一优选例中，所述磷脂酰胆碱(pc)类脂质包括：dppc(1，2
‑
二棕榈酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰胆碱)、dmpc(1,2
‑
二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)、ddpc(1，2
‑
二癸酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酰胆碱)、dspc(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、dopc(二油酰基磷脂酰胆碱)，或其组合物。
[0146]
在另一优选例中，所述磷脂酰乙醇胺(pe)类脂质包括：dspe(二硬脂酰基
‑
磷脂酰乙醇胺)、dppe(二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺)、dope(二油酰基磷脂酰乙醇胺)、dlpe(二月桂酰基磷脂酰乙醇胺)，或其组合。
[0147]
在另一优选例中，所述鞘氨醇磷脂类脂质包括：神经酰胺。
[0148]
在本发明的第六方面，提供了一种细胞内吞稀释放响应的脂质
‑
药物复合物，所述的脂质
‑
药物复合物为经如第一方面所述的化合物修饰的脂质
‑
药物复合物。
[0149]
在另一优选例中，所述的脂质
‑
药物复合物由脂质体和药物复合形成。
[0150]
在另一优选例中，所述脂质
‑
药物复合物为脂质
‑
基因药物复合物(即由脂质体和基因药物复合形成的脂质
‑
药物复合物)。
[0151]
在本发明的第七方面，提供了一种细胞内吞稀释放响应的脂质
‑
药物复合物，所述的脂质
‑
药物复合物由脂质体、药物(较佳地，基因药物)和如第一方面所述的化合物复合而成，且所述的脂质体包括：阳离子脂质和任选的辅助脂质。
[0152]
在另一优选例中，在所述脂质
‑
药物复合物中，阳离子脂质和如第一方面所述的化合物的摩尔比为1:(0.1～10)；较佳地，为1:(0.2～5)；更佳地，为1:(1
±
0.2)。
[0153]
在另一优选例中，在所述脂质
‑
药物复合物中，阳离子脂质、如第一方面所述的化合物和辅助脂质的摩尔比为1:(0.1～10):(0.1～10)；较佳地，为1:(0.2～5):(0.2～5)；更佳地，为1:(1
±
0.2):(1
±
0.2)。
[0154]
在另一优选例中，所述阳离子脂质如第五方面中的定义。
[0155]
在另一优选例中，所述辅助脂质如如第五方面中的定义。
[0156]
在本发明的第八方面，提供了一种制剂，其特征在于，所述制剂包括如第六方面或第七方面所述的脂质
‑
药物复合物。
[0157]
在本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括：如第一方面所述的化合物、阳离子脂质和任选的辅助脂质。
[0158]
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括药物(较佳地，为基因药物)。
[0159]
在另一优选例中，所述的阳离子脂质、辅助脂质和/或药物(较佳地，基因药物)的定义同第五方面中定义。
[0160]
在本发明的第十方面，提供了一种向细胞内导入药物的方法，包括步骤：使对象与如第七方面所述的药物复合物或如第八方面所述的药物复合物接触，从而导入药物。
[0161]
在另一优选例中，所述的药物为基因药物。
[0162]
在另一优选例中，所述的阳离子脂质、辅助脂质和/或药物的定义同第五方面中定义。
[0163]
在另一优选例中，所述的方法是体外非治疗性的。
[0164]
在另一优选例中，所述的对象是细胞。
[0165]
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：将如第七方面所述的药物复合物或如第八方面所述的药物复合物与细胞一起培养，从而向所述细胞内导入药物。
[0166]
在本发明的第十一方面，提供了一种细胞转染的方法，包括步骤：使对象(较佳地，细胞)与经第一方面所述的化合物修饰的脂质
‑
基因药物复合物接触，从而进行转染。
[0167]
在另一优选例中，所述的基因药物为dna。
[0168]
在另一优选例中，所述的方法是体外非治疗性的。脂质
‑
基因药物复合物与细胞一起培养，从而向所述细胞内导入基因药物。
[0169]
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：将经第一方面所述的化合物修饰的在本发明的第十二方面，提供了一种基因治疗的方法，包括步骤：向对象施用如第七方面所述的
脂质
‑
药物复合物或如第八方面所述的脂质
‑
药物复合物或如第八方面所述的制剂。
[0170]
在另一优选例中，所述的药物为基因药物。
[0171]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0172]
图1a和b分别显示了体外条件下的降解情况。
[0173]
图2显示了不同化合物的转染情况。
具体实施方式
[0174]
发明人经过广泛而深入地研究，意外地发现了一类具有特定母核结构的化合物具有优异的细胞吞噬响应功能。使用这类化合物修饰后的阳离子脂质体或包含这类化合物的阳离子脂质体能够用于输送基因药物的化合物并提供优异的细胞转染效率。该类化合物包括亲脂性头部、亲水性链(如peg长链)、和具有特殊母核结构的ph响应功能的中间基团。经本发明化合物修饰的阳离子脂质体或包含本发明化合物的阳离子脂质体与基因药物(如核酸)的复合物在细胞外环境下不易聚与白蛋白结合形成大颗粒，也不易被网状上皮细胞识别并清除，从而能够顺利到达靶标部位。同时经本发明化合物修饰或包含本发明化合物的复合物，在细胞内溶媒体环境中能够迅速降解(即本发明化合物因ph响应而断裂)，从而暴露出阳离子脂质与基因药物(如核酸)的复合物的正电荷，进而实现核酸的溶酶体逃逸，使核酸释放至细胞质中，进入细胞核，实现核酸的高效转染。基于此，发明人完成了本发明。
[0175]
术语
[0176]
如本文所用，“卤素”指f、cl、br、和i。更佳地，卤原子选自f、cl和br。
[0177]
除非另有说明，术语“c10
‑
c20饱和或不饱和的烃基”包括烷基、含一个或多个(如1、2、3、4或5个)双键和/或三键的不饱和烃基。较佳地，所述c10
‑
c20饱和或不饱和的烃基为直链或支链烃基(例如含1、2或3个直链的烃基)。
[0178]
除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即c1
‑
c6表示1
‑
6个碳)。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基等。
[0179]
如本文所用，“c1
‑
c6烷氧基”包括1
‑
6个碳原子的直链或支链的烷氧基。例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。
[0180]
除非特别说明，术语“环烷基”是指具有指定环原子数(例如，c3
‑
c8环烷基)并且完全饱和的或在环顶之间具有不超过一个双键的烃环。“环烷基”也指双环和多环烃环，例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷等。术语“杂环烷基”是指含有一至五个选自n、o和s的杂原子的环烷基，其中氮和硫原子任选被氧化，且氮原子任选被季铵化。杂环烷基可以是单环、双环或多环体系。杂环烷基的非限制性例子包括吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑烷酮、乙内酰脲、二氧戊环、苯邻二甲酰亚胺、哌啶、1,4
‑
二噁烷、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉
‑
s
‑
氧化物、硫代吗啉
‑
s,s
‑
氧化物、哌嗪、吡喃、吡啶酮、3
‑
吡咯啉、噻喃、吡喃酮、四氢呋喃、四氢噻吩、奎宁环等。杂环烷基可以经环碳或杂原子连接于分子的其余部分。
对于诸如环烷基烷基和杂环烷基烷基的术语，是指环烷基或杂环烷基通过烷基或亚烷基连接体连接到分子的其余部分。例如，环丁基甲基
‑
是连接到分子其余部分的亚甲基连接基上的环丁基环。
[0181]
除非特别说明，术语“芳基”表示多不饱和的(通常芳香性)的烃基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(最多三环)。术语"杂芳基"是指含有1至5个选自n、o、和s的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基的非限制性例子包括苯基、萘基和联苯基，而杂芳基的非限制性例子包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并三嗪基(benzotriazinyl)、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基(isobenzofuryl)、异吲哚基、中氮茚基、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡啶、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等等。以上芳基和杂芳基环系统各自的取代基选自下述可接受的取代基的组。
[0182]
为简洁起见，当术语“芳基”与其它术语(例如芳氧基，芳硫基，芳烷基)组合使用时，包括如上所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”是指包括其中芳基连接到与分子的其余部分连接的烷基的那些基团(例如苄基，苯乙基，吡啶基甲基等)。
[0183]
如本文所用，术语“杂原子”意在包括氧(o)、氮(n)和硫(s)。
[0184]
如本文所用，衍生自化合物或脂质是指该化合物或脂质中的活性基团(如氨基、羟基、羧基等)与另一个或一种化合物反应，从而形成的对应基团。
[0185]
脂质体
[0186]
脂质体(liposome)，是将药物包封于类脂双分子层内形成的微型囊泡体，主要成分为磷脂和胆固醇。脂质膜具有类似生物膜的结构，因而具有良好的生物相容性，包裹药物后，以内吞、融合的形式进入细胞，从而将药物输送到靶细胞。
[0187]
阳离子脂质体
[0188]
阳离子脂质体(cationic liposome)是由带正电荷的阳离子脂质和中性辅助脂质构成的脂质体。阳离子脂质体具有装载大分子基因药物能力强、体外转染效率高等优点，被广泛地应用到体内外研究中，也是目前使用最多的非病毒载体之一。阳离子脂质由带正电的亲水头部、疏水的尾部和连接头部与尾部的连接链组成。阳离子脂质体一般阳离子脂质和辅助脂质构成，阳离子脂质头部带正电荷，可以与带负电荷的核酸物质通过静电作用结合；辅助脂质一般不带电荷，具有稳定脂质双分子层或帮助脂质膜与内涵体膜融合作用。
[0189]
常见阳离子脂质有dotap、dotam、dospa等，不同脂质头部所带正电荷不同，决定脂质体装载核酸的量及毒性大小；常见中性脂质主要有chol、dope、dppc等。
[0190]
基因输送机制
[0191]
阳离子脂质/核酸复合物的基因输送机制为：阳离子脂质体与带有负电荷的核酸通过静电作用紧密结合，形成大小均匀的小粒径脂质/核酸复合物。正电荷的脂质/核酸复合物易于吸附到负电性的细胞膜表面，通过内吞或膜融合的机制进入细胞内，被内吞的脂质/核酸复合物经过溶酶体逃逸后释放核酸，dna类药物内涵体逃逸后被释放至细胞质，然后进一步进入穿透核膜进入细胞核内发挥作用。
[0192]
本文中所使用的缩写如下表所定义：
[0193][0194][0195]
细胞内吞释放响应的化合物
[0196]
本发明为了解决前述问题，提供了一类具有内吞释放响应的化合物，这些化合物在体液条件(即ph＝7.35
‑
7.45)下相对稳定，但在肿瘤微环境(ph＜6)或在细胞溶酶体条件(ph 5左右)下会降解，由于酸性环境中氢离子的作用，化合物中的ph响应的化学键(例如，本发明化合物所用的亚胺键(
‑
c＝n
‑
))会部分或全部断裂，从而将亲水链(如亲水长链peg)释放掉，并暴露出阳离子脂质体(如dotap)的正电荷属性，使得脂质/核酸复合物暴露出更多的正电荷，有效提高复合物的溶酶体逃逸能力，释放出更多的dna至细胞质中，从而提高
脂质体复合物的转染效率。
[0197]
具体地，本发明的化合物包括用于插入脂质体(或复合物)的亲脂性头部、亲水性链，以及连接亲脂性头部和亲水性链的响应基团，其中，所述响应基团是具有ph响应功能的。较佳地，所述中间链在ph大于7(如7.35～7.45)时保持稳定，在ph小于6时(如5左右)时，发生断裂，从而释放亲水性基团。
[0198]
本发明的主要优点包括：
[0199]
(a)本发明的化合物修饰的复合物(例如脂质
‑
核酸复合物)，在细胞外环境中稳定不易聚集、不易被清除、能够顺利达到靶标部位。
[0200]
(b)本发明化合物修饰的复合物，在细胞内环境中能够迅速降解(一般在2h内)，暴露出阳离子脂质与基因药物(如核酸)的复合物，实现溶酶体逃逸。
[0201]
(c)本发明的化合物修饰的复合物转染效率高，无血清条件转染略高于无修饰阳离子脂质体，有血清条件转染效率一般可达无修饰阳离子脂质体的10～20倍。
[0202]
(d)本发明化合物修饰的复合物，有效降低了阳离子脂质体对细胞的毒性。
[0203]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0204]
实施例1化合物的制备
[0205]
实施例1.1化合物6(cpd6)的制备
[0206]
流程一：
[0207][0208]
流程二：
[0209][0210]
(a)化合物1
‑
1的合成：将49.1g(0.259mol)的对甲苯磺酰氯溶于200ml吡啶中，室温下缓慢加入含有50.0g(0.129mol)胆固醇的吡啶溶液(300ml)中；滴加完毕后室温搅拌过夜。反应结束后加入3000ml二氯甲烷，并用1mol/l的盐酸溶液洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋去大部分二氯甲烷，然后加入适量甲醇重结晶得到产物(化合物1
‑
1)59.7g。收率85.4％
[0211]
(b)化合物1
‑
2的合成：将218.3g(1.850mol)的1,6
‑
己二醇加入含有50.0g(0.093mol)化合物1
‑
1的1,4
‑
二氧六环溶液(1000ml)当中，将反应液加热至80摄氏度反应5小时。反应结束后搅拌加入5000ml乙酸乙酯，然后用水洗涤3
‑
5次，再用饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋干并过柱得到产物(化合物1
‑
2)31.0g。收率69.7％
[0212]
(c)化合物1
‑
3的合成：将18.1g(0.104mol)的甲磺酸酐溶于200ml二氯甲烷中，冰水浴下缓慢加入含有25.0g(0.052mol)的化合物1
‑
2、18.0g(0.130mol)三乙胺的二氯甲烷(200ml)溶液中。滴加结束后室温反应过夜。反应结束后将反应液用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋干并过柱得到产物(化合物1
‑
3)21.9g。收率75.2％
[0213]
(d)化合物1
‑
4的合成：将206.3g(0.787mol)的三苯基膦和100g(0.787mol)的氯化苄溶于3000ml乙腈中，然后将反应液加热至回流反应5小时。反应结束后将反应液抽滤，所得到的固体用乙腈洗涤三次后得到产物(化合物1
‑
4)184.7g。收率69.4％
[0214]
(e)化合物1
‑
5的合成：将100g(0.725mol)的2,4
‑
二羟基苯甲醛，66.9g(0.797mol)
的碳酸氢钠，12.0g(0.072mol)的碘化钾和100.0g(0.725mol)的氯化苄加入1000ml的乙腈中，然后将反应液加热至回流反应过夜。反应结束旋去大部分反应液，加入5000ml的乙酸乙酯萃取，并将有机相用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋去大部分乙酸乙酯，然后加入甲醇重结晶得到产物(化合物1
‑
5)108.7g。收率65.8％
[0215]
(f)化合物1
‑
6的合成：将156.0g(0.403mol)的化合物1
‑
4，87.1g(0.382mol)的化合物1
‑
5溶于2000ml的乙腈中，室温下将61.1g(0.403mol)的dbu缓慢加入上述的混合液中。然后将反应液加热至回流反应过夜。反应结束后旋去大部分反应液，加入8000ml乙酸乙酯萃取，并将有机相用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后过柱得到产物(化合物1
‑
6)36.6g。收率56.8％
[0216]
(g)化合物1
‑
7的合成：将35.3g(0.117mol)的化合物1
‑
6、96.6g(0.700mol)的碳酸钾溶于500ml四氢呋喃中，室温搅拌15分钟，然后向此混合液中加入177.8g(0.700mol)的碘，并室温反应半小时。反应结束后加入过量的饱和亚硫酸氢钠溶液中和过量的碘，然后加入3000ml的乙酸乙酯萃取，并将有机相用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后过柱得到产物(化合物1
‑
7)16.6g。收率47.6％
[0217]
(h)化合物1
‑
8的合成：冰水浴下将17.8g(0.244mol)的dmf，37.3g(0.244mol)的三氯氧磷加入500ml的1,2
‑
二氯乙烷中，并室温搅拌一小时。然后向此混合液中加入14.7g(0.049mol)的化合物1
‑
7，并将反应液加热至回流反应过夜。反应结束后将反应液用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，洗涤后的有机相再用无水硫酸钠干燥后过柱得到产物(化合物1
‑
8)11.5g。收率71.4％
[0218]
(i)化合物1
‑
9的合成：冰水浴下将9.2g(0.048mol)的四氯化钛缓慢加入含有10.6g(0.032mol)的化合物1
‑
8的二氯甲烷溶液(100ml)中，然后室温反应一小时。反应结束后将反应液用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后过柱得到产物(化合物1
‑
9)5.9g。收率77.5％
[0219]
(j)化合物1
‑
10的合成：将11.4g(0.021mol)的化合物1
‑
3、4g(0.017mol)的化合物1
‑
9、8.2g(0.025mol)的碳酸铯、0.3g(0.002mol)的碘化钾溶于200ml的dmf中，然后将反应液加热至80摄氏度反应半小时。反应结束后往反应液里加入1000ml的乙酸乙酯，并用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后过柱得到产物(化合物1
‑
10)10.1g。收率83.7％
[0220]
(k)化合物cpd6的合成：将260.4mg(0.364mmol)的化合物1
‑
10、800.0mg(0.400mmol)的甲氧基聚乙二醇胺、0.5g已活化的3ao分子筛加入40ml无水甲醇中，然后将反应液加热回流反应36小时。反应结束后除去分子筛并旋去部分甲醇，待其冷却后会析出大量固体。然后抽滤得到固体，所的固体用甲醇洗涤三次得到产物0.5g。产率48.4％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.64(s,3h),0.82
‑
0.84(m,6h),0.88
‑
0.90(m,3h),0.94
‑
1.58(m,29h),1.79
‑
1.92(m,5h),1.95
‑
1.99(m,1h),3.07
‑
3.14(m,1h),3.35(s,3h),3.42
‑
3.47(m,3h),3.51
‑
3.69(m,200h),3.78
‑
3.81(m,5h),3.98
‑
4.01(m,2h),5.30
‑
5.31(m,1h),6.88
‑
6.90(m,1h),6.99(s,1h),7.41
‑
7.49(m,3h),7.72(d,j＝8.4hz,2h),8.15(d,j＝8.4hz,1h),8.63(s,1h)。
[0221]
实施例1.2化合物2(cpd2)的制备
[0222][0223]
(a)化合物2
‑
1的合成：将30g(0.067mol)的胆固醇甲酰氯溶于200ml的二氯甲烷中，并将此混合液在冰水浴下缓慢加入含有10.2g(0.101mol)的三乙胺和6.0g(0.080mol)的正丙醇胺的二氯甲烷(200ml)溶液中。滴加结束后室温反应过夜。反应结束后将反应液用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋去大部分二氯甲烷，并加入适量甲醇重结晶得到产物(即化合物2
‑
1)27.1g。收率83.4％。
[0224]
(b)化合物2
‑
2的合成：参考实施例1.1中合成化合物1
‑
3的方法进行合成，得到18.8g产物(化合物2
‑
2)，产率81.7％。
[0225]
(c)化合物2
‑
3的合成：参考实施例1.1中合成化合物1
‑
10的方法进行合成，得到5.4g产物(化合物2
‑
3)，产率85.5％。
[0226]
(d)化合物cpd2的合成：参考实施例1.1中合成化合物cpd6的方法进行合成，得到0.5g产物，产率38.4％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.64(s,3h),0.82
‑
0.83(m,6h),0.87
‑
0.88(m,3h),0.97(s,4h),1.09
‑
1.53(m,20h),1.79
‑
1.99(m,6h),3.35(s,3h),3.43
‑
3.81(m,200h),4.46
‑
4.48(m,2h),4.92(s,1h),5.33(s,1h),6.88
‑
6.90(m,1h),7.00(s,1h),7.42
‑
7.48(m,3h),7.70
‑
7.71(m,2h),8.15(d,j＝8.4hz,2h),8.63(s,1h).
[0227]
实施例1.3化合物4(cpd 4)的合成
[0228]
步骤一：
[0229][0230]
步骤二：
[0231][0232][0233]
(a)化合物3
‑
1的合成：将10g(0.072mol)的对硝基酚、19.9g(0.144mol)的碳酸钾和18g(0.108mol)的溴乙酸乙酯溶于200ml乙腈中，然后将反应液加热至回流反应过夜。反应结束后旋去大部分乙腈，加入1000ml的乙酸乙酯萃取，然后用水洗涤3
‑
5次，饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋去大部分乙酸乙酯，然后加入石油醚重结晶得到产物(即化合物3
‑
1)15.5g。收率96.0％
[0234]
(b)化合物3
‑
2的合成：将9g(0.04mol)的化合物3
‑
1溶于100ml甲醇中，并加入10％的钯碳(0.9g)，使用氢气作为还原剂室温反应过夜。反应结束后抽滤除去钯碳，旋干滤液后加入石油醚洗涤3
‑
5次得到产物(即化合物3
‑
2)7.1g。收率91.7％
[0235]
(c)化合物3
‑
3的合成：将7g(0.036mol)的化合物3
‑
2溶于100ml甲醇中，然后加入1.6g(0.040mol)的氢氧化钠固体，然后将反应液室温剧烈搅拌30分钟。反应结束后加入少量饱和氯化铵溶液中和氢氧化钠，此时会析出大量固体，然后将反应液抽滤，所得到的固体用乙酸乙酯洗涤后得到产物(即化合物3
‑
3)4.5g。收率74.5％
[0236]
(d)化合物3
‑
4的合成：将1.0g(1.397mmol)的化合物3
‑
2、0.2g(1.270mmol)的化合物1
‑
6、1.0g已活化的3ao分子筛加入40ml无水甲醇中，然后将反应液加热至回流反应36小时。反应结束后除去分子筛并旋去部分甲醇，待其冷却后会析出大量固体。然后抽滤得到固体，所的固体用甲醇洗涤三次得到产物(即化合物3
‑
4)0.5g。收率51.3％。
[0237]
(e)化合物4(cpd4)的合成：将475.8mg(0.550mmol)的化合物3
‑
4、122.0mg(1.0mmol)的4
‑
二甲氨基吡啶、1.0g(0.5mmol)的甲氧基聚乙二醇胺溶于20ml无水二氯甲烷中，然后冰水浴下向此混合液中加入412.0mg(2.0mmol)的二环己基碳二亚胺，并室温反应过夜。反应结束后，将反应液过滤，除去反应生成的少量沉淀，并将滤液浓缩后加入适量乙醚，此时会析出大量絮状沉淀，将此混合液离心后去除上清液，沉淀再用乙醚洗涤3
‑
5次后得到产物(即cpd4)0.8g。收率57.4％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.65(s,3h),0.84
‑
0.86(m,6h),0.89
‑
0.90(m,3h),0.98(s,4h),1.05
‑
1.60(m,20h),1.82
‑
1.85(m,10h),2.17
‑
2.22(m,1h),2.32
‑
2.36(m,1h),3.37(s,3h),3.45
‑
3.63(m,227h),4.01
‑
4.04(m,2h),4.50(s,2h),5.32
‑
5.33(m,1h),6.94
‑
7.21(m,5h),7.48
‑
7.53(m,4h),7.76(d,j＝7.2hz,3h),8.36(d,j＝8.4hz,1h),8.79(s,1h).
[0238]
实施例1.4cpd1的合成
[0239]
参考实施例1.1与实施例1.2的方法进行合成。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.64(s,
3h),0.83
‑
0.85(m,6h),0.88
‑
0.89(m,3h),0.98(s,4h),1.05
‑
1.53(m,22h),1.60
‑
1.75(m,6h),1.80
‑
1.98(m,8h),2.85
‑
2.90(m,1h),3.37(s,3h),3.46
‑
3.81(m,219h),4.49
‑
4.56(m,1h),5.05
‑
5.12(m,2h),6.39(s,1h),7.33(s,1h),7.75(s,3h),7.75(s,1h),8.65(s,1h).
[0240]
实施例1.5cpd3的合成
[0241]
参考实施例1.1的方法进行合成。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.65(s,3h),0.83
‑
0.85(m,6h),0.89(d,j＝6.8hz,3h),0.97(s,4h),1.05
‑
1.53(m,20h),1.77
‑
1.99(m,6h),2.17(s,4h),2.32
‑
2.36(m,1h),3.10
‑
3.14(m,1h),3.36(s,3h),3.45
‑
3.67(m,183h),4.02(t,j＝6.4hz,2h),5.31
‑
5.32(m,1h),6.96
‑
6.99(m,2h),7.05(d,j＝2.0hz,1h),7.22
‑
7.26(m,3h),7.47
‑
7.54(m,3h),7.75
‑
7.77(m,2h),7.86(d,j＝8.4hz,2h),8.35(d,j＝8.8hz,1h),8.77(s,1h).
[0242]
实施例1.6cpd5的合成
[0243]
参考实施例1.3的方法进行合成。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.64(s,3h),0.84(d,j＝6.4hz,6h),0.88(d,j＝6.4hz,3h),0.97(s,4h),1.09
‑
1.59(m,21h),1.81
‑
1.99(m,6h),2.17
‑
2.35(m,5h),3.08
‑
3.13(m,1h),3.35(s,3h),3.43
‑
3.79(m,213h),4.02(t,j＝6.4hz,2h),5.31
‑
5.32(m,1h),6.96
‑
7.07(m,6h),7.25(s,3h),7.46
‑
7.53(m,3h),7.76
‑
7.81(m,3h),8.36(d,j＝8.8hz,1h),8.80(s,1h).
[0244]
本发明的化合物及其结构如表1所示
[0245]
表1细胞内吞释放响应的化合物
[0246]
[0247][0248]
对比例1cpd7合成
[0249]
本发明合成了具有ph响应基团的但无法实现细胞内基因有效转染的化合物cpd7。
[0250][0251]
cpd7合成路线如下：
[0252][0253]
cpd7验证：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.62(s,3h),0.81
‑
0.82(m,6h),0.86
‑
0.87(m,3h),0.95(s,54h),1.07
‑
1.55(m,23h),1.78
‑
1.85(m,5h),2.28(s,3h),2.42(s,3h),3.15(s,2h),3.33(s,3h),3.43
‑
3.66(m,187h),4.43(s,1h),4.75(s,1h),5.26
‑
5.31(m,2h),5.66(s,1h),8.00(s,1h).
[0254]
对比例2
[0255]
本发明合成的对比例2(cpd8)
[0256][0257]
cpd8的合成参考实施案例1.11h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.65(s,3h),0.83
‑
0.85(m,6h),0.89(d,j＝6.4hz,3h),0.97(s,4h),1.04
‑
1.60(m,25h),1.79
‑
1.85(m,4h),1.92
‑
1.99(m,2h),2.14(s,1h),3.08
‑
3.14(m,1h),3.35(s,3h),3.36
‑
3.62(m,193h),3.99(t,j＝6.8hz,2h),5.31
‑
5.32(m,1h),6.50(s,1h),6.89
‑
6.91(m,1h),6.99
‑
7.00(m,1h),7.38
‑
7.46(m,3h),7.68(d,j＝8.4hz,1h),7.87
‑
7.89(dd,1h).
[0258]
测试例1降解速率
[0259]
模拟本发明所合成的化合物在体外条件下的降解速率，本发明考察所合成的不同结构化合物在不同缓冲体系条件、不同时间点的降解率。
[0260]
分别称取一定量不同化合物(cpd1
‑
5和cpd7
‑
8)，分别加入一定量缓冲液(ph＝5/7.4的nah2po3/na2hpo3缓冲盐)，使其终浓度为10mg/ml，置于振荡器，在37℃，转速r＝350rpm/min条件下，分别振荡2h、8h。然后将反应液转移到冻干容器内进行真空冷冻干燥。
[0261]
冻干24h结束后，每组加入0.5ml氘代氯仿，复溶冻干物，转移至1.5ml尖底离心管中，以转速r＝15000r/min，离心5min，吸取上层液体，转移至核磁管中，氢谱定量降解率，结果如图1a和1b所示。
[0262]
从图1a和1b中看出，cpd1、cpd2、cpd7化合物在ph＝5时，均于2h内完全降解，推断其在细胞溶酶体内酸性环境(ph＝5左右)中可以实现迅速降解，从而暴露出阳离子脂质复合物的正电荷，有效释放核酸。cpd3、cpd4、cpd5在ph＝5时，即使在8h尚未达到完全降解，推断其在内环境中很有可能无法及时暴露阳离子脂质复合物的正电荷，因而无法实现核酸的有效释放。
[0263]
化合物cpd1、cpd7在ph＝7.4时，cpd1、cpd7于2h已经降解>60％，而cpd2只降解<
10％，考虑给药时修饰化合物浓度较低，cpd1很有可能在未进入细胞内时已经完全降解，实现不了亲水性基团遮蔽阳离子正电荷的作用，也无法实现核酸的高效转染。
[0264]
因此，根据体外降解实验结果，可以看出本发明的化合物尤其是化合物cpd2在模拟体液条件的实验条件(ph＝7.4)下相对稳定，但在模拟如肿瘤微环境或细胞溶酶体条件的实验条件(ph＝5左右)下会降解，最有实现细胞内高效基因转染的潜力。
[0265]
测试例2转染实验
[0266]
2.1复合物的制备
[0267]
(1)阳离子空白脂质体的制备：取适量dotap/chol氯仿储备液于25ml茄形瓶中，使得dotap/chol摩尔比为1:1，总脂质浓度为2mg/ml，总脂质4mg，于旋转蒸发仪减压旋蒸30min，n2吹干残留氯仿，加入2ml的10mm的hepes缓冲盐溶液，超声30min，即得阳离子空白脂质体。马尔文激光粒度仪测定其粒径为153.2nm，多分散系数为0.212，电位为50.4mv。
[0268]
(2)阳离子脂质/核酸复合物的制备：取100微升上述阳离子空白脂质体，取适量pgl3(luciferase)质粒储备液，稀释至100微升，使n/p比为4/1，迅速混合均匀，于37℃恒温孵育0.5h，即得阳离子脂质/核酸复合物。马尔文激光粒度仪测定其粒径为180.6nm，多分散系数为0.159，电位为45.9mv。
[0269]
(3)ph响应阳离子脂质/核酸复合物或peg修饰的阳离子脂质/核酸复合物的制备：取适量制备好的阳离子脂质/核酸复合物，按照摩尔比为dotap:chol:后插脂质(即cpd.2或cpd.8)＝1:1:1的比例后插脂质，将后插脂质溶液与阳离子脂质/核酸复合物溶液迅速混匀，于37℃恒温孵育0.5h。后插脂质组别分别为阴性对照组cpd8，实验组cpd.2，后插条件为37℃，0.5h。马尔文激光粒度仪测定，粒径均小于250nm，pdi小于0.3，电位阴性组为20.0mv，实验组为21.2mv。
[0270]
2.2细胞转染实验
[0271]
培养非小细胞肺癌细胞a549至其长至培养瓶85％左右，消化细胞计数，以1
×
104个细胞/孔的密度将细胞种植于96孔板中，于37℃恒温培养箱，0.5％co2培养18
‑
24h，以每孔375ng的dna量给药，每组三个复孔，且分别以1640培养基及含有20％fbs的1640培养基稀释给药，4h后弃去培养基，用1
×
pbs洗涤，更换为含有10％fbs的1640培养基继续培养至24h。弃去培养基，用1
×
pbs洗涤，每孔加入30微升的细胞裂解液，充分裂解后，每孔取出20微升加入流式管中，测定前临时加入等量的荧光素酶底物混匀，于照度计检测荧光强度，结果如图2所示。
[0272]
从图2中看出，无血清(1640)给药时，cpd8修饰的阴性对照组(dotap cpd8)的转染<1000，与未给药组(untreated组)一致，则认为未转染；无修饰阳离子脂质组(dotap组，即2.1中制备的阳离子脂质/核酸复合物)转染为1
×
106，cpd2修饰的脂质复合物组(dotap cpd2组)转染结果为4
×
106，dotap cpd2组转染结果是dotap组的4倍左右。
[0273]
20％fbs是为了模拟体内体液循环的内环境，当20％fbs给药时，阴性对照组dotap cpd8组仍未转染，而无修饰阳离子dotap组转染效率大幅度降低，只有6
×
103，但是cpd2修饰的脂质复合物dotap cpd2组转染结果为1.2
×
105，dotap cpd2组转染结果是dotap组的20倍左右。
[0274]
因此，结合无血清1640转染和模拟体内环境的20％fbs转染可见采用本发明的化合物(cpd2)对阳离子脂质复合物进行修饰实现了体内环境(ph＝7.4)相对稳定，而细胞内
环境(ph＝5)时迅速降解，从而达到体内有效转染的效果。
[0275]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。