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1.本发明涉及一种包括seq id no:1所示的核苷酸序列的优化了植物中表达的重组鸢尾素基因,一种包括所述重组鸢尾素基因的用于制备鸢尾素蛋白以及用于预防或治疗代谢性疾病的方法。
2.本技术要求于2019年4月2日提交的韩国专利申请10
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2019
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0038211的优先权,其公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术:
3.肥胖症是一种由于热量摄入和消耗之间的不平衡而导致的代谢性疾病,因此是指脂肪组织因过度的热量摄入而异常增加症状。肥胖的原因包括遗传影响、西式饮食的环境影响、压力引起的心理影响等多种因素,但肥胖发生和发展的确切机制尚未明确。即使在韩国,随着脂肪摄入的迅速增加,肥胖的发生率也在不断上升。国家健康与营养调查(knhanes)发现,韩国饮食中的脂肪摄入比例从1990年的9.6%到2007年的19.5%,增加了一倍多,而动物脂肪摄入的增加是造成这种脂肪摄入增加的主要原因。2010年,韩国肥胖成人人数达到约1200万人,每三个人里就有一人。尤其是,身体质量指数在30或以上的重度肥胖者有161万人,在过去十年中迅速翻了一番。
4.肥胖不仅有其自身的问题,而且在患者的肥胖状态持续时会引起各种疾病和并发症,如高血压、高胰岛素血症、高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化、心血管疾病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症、关节炎等。因此,肥胖是非常危险的,因为它最终会缩短寿命。此外,由于肥胖和肥胖引起的并发症引起的社会经济成本是巨大的,因此全世界对肥胖的治疗非常感兴趣。然而,还没有有效的治疗剂来治疗由肥胖或脂肪过度堆积引起的代谢性疾病。
5.解偶联蛋白
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1(ucp1)是一种负责产生热量的基因,用于在棕色脂肪组织中产生热量。存在于线粒体膜中的ucp1是一种物质,通过使用氢离子产生热量,其允许能量作为热量被消耗掉,同时防止氢离子被用于合成atp。已知ucp1在动物的棕色脂肪细胞中表达并用于维持体温。通过ucp的热量产生自然会促进能量消耗。
6.据报道,从脂肪细胞分泌的脂联素显示出包括抗糖尿病作用的各种作用。也就是说,脂联素通过增加胰岛素对降低的血糖的敏感性来有效预防糖尿病。据报道,这种脂联素是一种蛋白质,其表达随着脂肪细胞的分化而增加。因此,一种在脂肪细胞分化过程中提高脂联素表达的物质可能在包括肥胖、糖尿病等的代谢疾病的预防和治疗中显示出有用的效果。
7.鸢尾素是一种由112个氨基酸组成的糖基化蛋白质激素,由fndc5的蛋白水解裂解形成。肌肉运动促进了fndc5的产生。在这种情况下,可以使用转录辅激活因子pgc1a将fndc5转化为pgc1a。鸢尾素由肌肉分泌,循环至脂肪组织,调节能量代谢。众所周知,鸢尾素促进了将白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织的过程。鸢尾素在肌肉组织中合成,存在于小
脑和细胞间神经末梢的浦肯野细胞中。
8.同时,已经生产和开发了用于预防上述疾病的蛋白质,但由于诸如蛋白质折叠、糖基化等问题,所述蛋白质主要使用动物细胞而不是细菌细胞来生产。然而,使用动物细胞生产蛋白质的方法的缺点在于,制备蛋白质并不容易,并且疫苗非常昂贵,因为扩大设施以大规模生产蛋白质需要大量资金。此外,使用动物细胞制备的蛋白质的缺点在于,蛋白质不易储存,并且蛋白质极有可能被可能感染动物的病毒污染。然而,植物有望可能稳定地生产廉价的蛋白质,因为与动物细胞不同,植物不太可能被可能感染动物的病毒污染,可以在培养区域安全时随时大量生产,并且蛋白质可以在植物中长期储存。
技术实现要素:
9.技术问题
10.本发明是为解决相关技术的问题而设计的,因此本发明的目的是提供一种能够利用植物有效生产并且对生理活性显示出高效的重组鸢尾素基因,一种使用所述重组鸢尾素基因来制备重组鸢尾素蛋白的方法,以及使用该蛋白预防或治疗代谢疾病的组合物。
11.然而,本发明的技术目的不限于上述技术目的,通过详细描述本发明的示例性实施方式,本文中未陈述的本发明的其他目的对于本领域普通技术人员将变得更加明显。
12.技术方案
13.本发明提供了一种在植物中优化表达的重组鸢尾素基因,其包括seq id no:1所示核苷酸序列。由seq id no:1所示核苷酸序列组成的重组鸢尾素基因的功能等同物属于本发明的范围。功能等同物是指由于碱基的添加、取代或缺失而与该核苷酸序列具有至少60%或更多、优选70%或更多、更优选80%或更多、最优选90%或更多的序列同源性的基因,因此具有与包括由seq id no:1表示的核苷酸序列的基因基本相同的活性。在这种情况下,重组鸢尾素蛋白的基因序列不受限制,只要它可以使用植物稳定生产。
14.此外,本发明提供包含重组鸢尾素基因的重组载体。
15.根据本发明的一个示例性实施方式,载体可以具有启动子基因和由seq id no:1表示的、以该序列顺序可操作地连接到其上的核苷酸序列。
16.根据本发明的另一个示例性实施方式,可以构建重组载体以表达植物来源的鸢尾素蛋白。
17.根据本发明的又一示例性实施方式,所述启动子包括花椰菜花叶病毒来源的35s启动子、花椰菜花叶病毒来源的19s rna启动子、植物来源的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、猿猴病毒40(sv40)启动子、呼吸道合胞病毒(rsv)启动子、延伸因子
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1α(ef
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1α)启动子、pemu启动子、mas启动子、组蛋白启动子、clp启动子,等等,但本发明不限于此。
18.根据本发明的又一示例性实施方式,重组表达载体还可包括编码伴侣结合蛋白(bip)的多核苷酸、编码由6个组氨酸组成的肽的基因等。
19.根据本发明的又一示例性实施方式,载体可以包括图1所示的裂解图。
20.根据本发明的又一示例性实施方式,载体还可包括选自由伴侣结合蛋白(bip)基因和标签基因组成的组中的编码一种或多种的基因。
21.此外,本发明提供了用该载体转化的转化体。
22.根据本发明的一个示例性实施方式,转化体可优选包括:微生物,如大肠杆菌、芽孢杆菌属、沙门氏菌属、酵母菌等;昆虫细胞;动物细胞,包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、马、牛等的细胞;根癌农杆菌;植物等。更优选地,转化体可以包括:粮食作物,包括水稻、小麦、大麦、玉米、豆类、马铃薯、小麦、红豆、燕麦和高粱;蔬菜作物,包括拟南芥、韩国白菜、萝卜、红辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、卷心菜、甜瓜、南瓜、大葱、洋葱、胡萝卜;特殊作物,包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、油菜;果树,包括苹果树、梨树、枣树、桃树、葡萄树、柑橘树、柿树、李树、杏树、香蕉树;开花植物,包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合和郁金香。然而,活生物体不受限制,只要它们可以用本发明的载体转化即可。
23.根据本发明的一个示例性实施方式,转化体可以是植物或植物细胞,但本发明不限于此。
24.此外,本发明提供了一种重组鸢尾素蛋白的生产方法,包括:(a)培养转化体;(b)从转化体或培养液中分离并纯化重组鸢尾素蛋白。优选地,转化体可以是细胞本身、植物或包含该细胞的培养物,并且培养液可以优选是在培养细胞后从中去除细胞的培养液。然而,培养液不受限制,只要它包含本发明的重组蛋白即可。
25.根据本发明的一个示例性实施方式,步骤(b)的纯化可以使用水溶性组分进行,但本发明不限于此。
26.此外,本发明提供一种用于预防或治疗代谢性疾病的药物组合物,其包含通过该方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白作为活性成分。
27.此外,本发明提供一种用于预防或改善代谢疾病的食物组合物,其包含通过该方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白作为活性成分。
28.此外,本发明提供了一种代谢性疾病的预防或治疗方法,包括:将通过该方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白给药于受试者。
29.此外,本发明提供了通过该方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白用于预防或治疗代谢疾病的用途。
30.此外,本发明提供了通过所述方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白用于制备治疗代谢疾病的药物的用途。
31.根据本发明的一个示例性实施方式,所述代谢疾病可优选包括肥胖症、糖尿病、高血压、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、脂肪肝、动脉粥样硬化等,但本发明不限于此。
32.根据本发明的另一示例性实施方式,重组鸢尾素蛋白可以包括选自由糖基化重组鸢尾素蛋白和非糖基化重组鸢尾素蛋白组成的组中的一种或多种,但本发明不限于此。
33.根据本发明的又一示例性实施方式,重组鸢尾素蛋白可包括seq id no:4所示的氨基酸序列,但本发明不限于此。
34.此外,本发明提供了一种用于诱导棕色脂肪细胞分化的组合物,其包括通过该方法产生的植物来源的重组鸢尾素蛋白。
35.进一步地,本发明提供了一种诱导白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化的方法,所述方法包括:用上述方法产生的植物来源的重组鸢尾素蛋白处理白色脂肪细胞。
36.有益效果
37.本发明的重组鸢尾素蛋白可以在植物中有效表达,并且由于重组鸢尾素蛋白具有
高水溶性,因此易于分离和纯化。此外,由于本发明的重组鸢尾素蛋白具有诱导ucp1和脂联素表达增加的效果,因此预期本发明的重组鸢尾素蛋白可有效用于治疗代谢性疾病。
附图说明
38.图1是示出根据本发明的一个实施方式的用于在植物中表达鸢尾素的基因的排列的图。
39.图2是示出根据本发明的一个实施方式通过蛋白质印迹确认植物中鸢尾素表达的结果的图。
40.图3为示出根据本发明一实施方式的植物来源重组鸢尾素的分离和纯化结果的图。
41.图4为示出根据本发明一实施方式确认是否重组鸢尾素经内切糖苷酶h处理而糖基化的结果的图。
42.图5示出根据本发明的一个实施方式在重组鸢尾素蛋白刺激细胞后,通过蛋白质印迹法测定3t3
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l1脂肪细胞中ucp
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1蛋白的数量变化的结果。
43.图6示出了根据本发明的一个实施方式在用重组鸢尾素蛋白刺激细胞后,通过蛋白质印迹法测定3t3
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l1脂肪细胞中脂联素蛋白的数量变化的结果。(*p<0.05与对照)。
具体实施方式
44.在本发明中证实,当使用由seq id no:1组成的鸢尾素基因时,甚至在植物中具有高生理活性的鸢尾素蛋白也可以被有效地生产和分离,并且还可以保持与现有的鸢尾素蛋白相同的生理活性。因此,由于鸢尾素蛋白可稳定且有效地大量生产,本发明的鸢尾素蛋白有望提供廉价且稳定的鸢尾素蛋白。
45.在本说明书中,术语“重组鸢尾素基因”可以指包含由seq id no:1表示的核苷酸序列的鸢尾素基因,优选由seq id no:1表示的核苷酸序列组成的鸢尾素基因。另外,基因变体属于本发明的范围。具体地,该基因可以包括与由seq id no:1表示的核苷酸序列具有70%或更多、更优选80%或更多、最优选90%或更多的序列同源性的核苷酸序列。例如,该基因可以包括具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%序列同源性的多核苷酸。
46.在本说明书中,术语“表达载体”是指可以表达由插入载体的异质核酸编码的肽或蛋白质的载体。优选地,表达载体是指构建用于表达重组鸢尾素蛋白的载体。术语“载体”是指用于在体外、离体或体内将碱基引入和/或递送到宿主细胞中的任何介质,并且可以是可以与另一个dna片段结合以诱导结合片段复制的复制子。这里,术语“复制子”是指在体内充当dna复制的自主单位的任何遗传单位(例如,质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒等),即,可以通过它自己的调节而复制。本发明的重组表达载体可以优选地包括作为与rna聚合酶结合的转录起始因子的启动子、用于调节转录的任何操纵基因序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译的终止的序列、终止子等。更优选地,本发明的重组表达载体可以包括用于增加蛋白质合成量的m17的5'utr区基因、用于将靶蛋白转运到内质网中的bip基因、用于容易分离重组蛋白的标签基因等,并且更优选地,可以进一步包括选择标
记基因,例如用于选择转化体的耐抗生素基因等。
[0047]“bip基因”是用于将表达的重组蛋白转运到内质网的bip序列的一部分,优选为包含seq id no:2所示核苷酸序列的基因,最优选为由seq id no:2组成的基因。在这种情况下,bip基因可以包括与由seq id no:2所示的核苷酸序列具有80%或更多、更优选90%或更多、更优选95%或更多的序列同源性的核苷酸序列。关于多核苷酸的术语“序列同源性百分比”是通过将比较区域与最佳对齐序列进行比较来确定的。在比较区域中,与参考序列(不包括添加或缺失)相比,多核苷酸序列的一部分可以进一步包括添加或缺失(即,缺口)以实现序列的最佳对齐。“bip基因”用于将表达的重组蛋白转运至内质网,其在植物细胞中表达后裂解。
[0048]
术语“标签基因”可以优选使用由1至10个组氨酸组成的肽片段,即组氨酸标签(his
‑
tag)。最优选地,标签基因可以是附有由6个组氨酸组成的肽片段的基因,并由seq id no:3表示的核苷酸序列表示。因此,组氨酸残基被最广泛地用作需要在重组蛋白表达后纯化所需的标签,并且应该具有高特异性,并且对目标蛋白的结构的影响尽可能小。优选地,标签基因可以由具有1至10个连续组氨酸的肽组成。在这种情况下,由于标签基因体尺寸小,对原有的蛋白质结构影响不大,所以标签基因的方便之处在于,在重组蛋白产生后,其不被单独裂解。标签可以附着在目标蛋白的n端(前)和/或c端(后),这取决于载体的类型,并且选择目标蛋白的前部或后部取决于什么对蛋白质的结构有影响。
[0049]
作为一个例子,选择标记基因可以包括抗除草剂基因,例如草甘膦或草丁膦;耐抗生素基因,例如卡那霉素、g418、博来霉素、潮霉素、氯霉素等;aada基因等。作为一个实施例,启动子可以包括pemu启动子、mas启动子、组蛋白启动子、clp启动子、花椰菜花叶病毒来源的35s启动子、花椰菜花叶病毒来源的19s rna启动子、植物来源的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、猿猴病毒40(sv40)启动子、呼吸道合胞病毒(rsv)启动子、延伸因子
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1α(ef
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1α)启动子等。作为一个例子,终止子包括胭脂碱合酶(nos)终止子、水稻淀粉酶ramy1a终止子、菜豆素终止子、根癌农杆菌的章鱼碱基因终止子、大肠杆菌rrnb1/b2终止子等,但实施例仅用于说明目的,本发明不限于此。
[0050]
在本说明书中,“载体”可以包括图1所示的结构图,但本发明不限于此。
[0051]
在本说明书中,“载体”优选为包含seq id no:8所示氨基酸序列的基因,最优选可由seq id no:8所示氨基酸序列组成,或包含与seq id no:8的序列具有80%或更多、更优选90%或更多、最优选95%或更多的序列同源性的氨基酸序列。
[0052]
此外,载体的氨基酸序列可由seq id no:7表示的基因序列编码,但本发明不限于此。具体地,该基因可以包括与seq id no:7表示的核苷酸序列具有90%或更多、更优选95%或更多、最优选98%或更多的序列同源性的核苷酸序列。相对于多核苷酸的“序列同源性百分比”是通过将比较区域与最佳对齐序列进行比较来确定的。在比较区域中,与参考序列(不包括添加或缺失)相比,多核苷酸序列的一部分可以进一步包括添加或缺失(即,缺口)以实现序列的最佳对齐。
[0053]
在本说明书中,术语“转化”一般是指通过注入dna来改变遗传性状的过程,术语“转化体(即转基因生物)”是指使用分子遗传方法通过注入外源基因制备的活生物体。优选地,转化体是用本发明的重组表达载体转化的活生物体,活生物体没有限制,只要是活的就可以,例如微生物、真核细胞、昆虫、动物、植物等。优选地,活生物体包括大肠杆菌、沙门氏
菌属、芽孢杆菌属、酵母、动物细胞、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、马、牛、根癌农杆菌、植物等等,但本发明不限于此。
[0054]
在本说明书中,植物可以用作“植物”而没有任何限制,只要它们能够大量生产蛋白质。更具体地,植物可选自由烟草、拟南芥、玉米、水稻、大豆、菜籽、苜蓿、向日葵、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯、生菜和红辣椒组成的组。优选地,植物可以是烟草。在本发明中,烟草为烟草属植物,烟草的种类没有特别限制,只要能够过量表达蛋白质即可。在这种情况下,可以通过根据转化方法和大量生产蛋白质的目的选择合适的品种来实施本发明。例如,nicotiana bethamiana l.、nicotiana tabacum cv.xanthi等品种可以使用。
[0055]
在本说明书中,转化体可以是植物或植物细胞,但本发明不限于此。
[0056]
转化体可以使用各种方法制备,例如转化、转染、农杆菌介导的转化法、粒子枪轰击法、超声法、电穿孔法、聚乙二醇(peg)介导的转化法等。在这种情况下,方法不受限制,只要它们可以用于注射本发明的载体即可。
[0057]
在本说明书中,术语“溶解度”是指目标蛋白质或肽为了施用于人体可在合适的溶剂中溶解的程度。具体地,溶解度可以指在特定温度下溶质相对于给定溶剂的饱和度。溶解度可以通过确定溶质的饱和浓度来测量。例如,将过量的溶质加入到溶剂中,搅拌并过滤。然后,可使用uv光谱、hplc等测量溶质的浓度,但本发明不限于此。较高的溶解度更有利于重组蛋白的分离和纯化,也有利于维持重组蛋白的生理或药理活性,因为它抑制了重组蛋白的聚集。
[0058]
本发明的“重组鸢尾素蛋白”包括seq id no:4所示的氨基酸序列,优选由seq id no:4所示的氨基酸序列组成。根据本发明的一个实施方式,在用包含本发明的重组鸢尾素基因的载体转化的植物中产生的重组鸢尾素蛋白可优选包括选自由糖基化重组鸢尾素蛋白和非糖基化重组鸢尾素蛋白组成的组中的一种或多种,以及更优选地,可以包括糖基化重组鸢尾素蛋白和非糖基化重组鸢尾素蛋白,但本发明不限于此。
[0059]
本发明所用的术语“糖基化”是蛋白质在细胞(真核生物)中翻译后的过程,分为n
‑
糖基化和o
‑
糖基化,根据蛋白质附着的官能团而区分。这里,将糖(如乳糖等)附着在细胞中产生的蛋白质上的过程通常称为“糖基化”。当糖链通过糖基化过程与蛋白质连接时,蛋白质经历“折叠”过程,以形成三维结构,赋予蛋白质稳定性,使蛋白质的形状得以保持,长时间无需任何解折叠。另外,附着在蛋白质上的糖链被转移到细胞膜上并成为细胞膜蛋白质,也可能具有与抗原相同的作用。如上所述,糖基化蛋白质被称为糖蛋白,并且糖蛋白的代表性实施例是在免疫应答等中起重要作用的抗体。用于预测蛋白质是否糖基化的程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/)使用本发明中使用的seq id no:8的载体的氨基酸序列进行操作。结果,预测n
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糖基化发生在天冬酰胺(n)16或61处。
[0060]
因此,本发明中使用的重组鸢尾素蛋白可以包括选自由糖基化重组鸢尾素蛋白和非糖基化重组鸢尾素蛋白组成的组中的一种或多种。在糖基化重组鸢尾素蛋白的这种情况下,n
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糖基化发生在seq id no:4所示的重组鸢尾素蛋白的天冬酰胺(n)8和/或53处,但本发明不限于此。因此,重组鸢尾素蛋白可以在与本发明具有等效效果的范围内进行修饰。
[0061]
根据本发明的另一方面,本发明提供了一种预防或治疗代谢疾病的药物组合物和一种用于改善代谢疾病的食物组合物,它们都包含重组鸢尾素蛋白。
[0062]
根据本发明的又一方面,本发明提供了一种用于诱导棕色脂肪细胞分化的组合
物,其包括重组鸢尾素蛋白。
[0063]
根据本发明的又一方面,本发明提供了一种用于预防或治疗代谢性疾病的方法,包括:将上述方法产生的植物来源的重组鸢尾素蛋白给药于受试者。
[0064]
根据本发明的又一方面,本发明提供了通过上述方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白用于预防或治疗代谢疾病的用途。
[0065]
此外,本发明提供了通过上述方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白用于制备治疗代谢疾病的药物的用途。
[0066]
根据本发明的一个示例性实施方式,代谢疾病可优选包括肥胖症、糖尿病、高血压、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、脂肪肝、动脉粥样硬化等,但本发明不限于此。
[0067]
此外,本发明提供了一种用于诱导棕色脂肪细胞分化的组合物,其包括通过该方法生产的植物来源的重组鸢尾素蛋白。
[0068]
进一步地,本发明提供了一种诱导白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化的方法,包括:用上述方法产生的植物来源的重组鸢尾素蛋白处理白色脂肪细胞。
[0069]
在本说明书中,术语“代谢性疾病”是指由于能量摄入过多、激素失衡等各种原因,能量代谢在体内异常地发生时,由脂肪过度合成或堆积而引起的疾病。具体地,代谢疾病可以是肥胖症、糖尿病、高血压、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、脂肪肝或动脉粥样硬化。
[0070]
在本发明中,重组鸢尾素蛋白增加了细胞中解偶联蛋白(ucp1)的表达,从而通过将白色脂肪细胞转化为棕色脂肪细胞(已知这是鸢尾素的功能)来有效治疗代谢疾病,例如肥胖症、糖尿病等。
[0071]
在本发明中,重组鸢尾素蛋白提高了细胞内脂联素的表达,因此可有效治疗代谢性疾病,例如改善胰岛素抵抗等。
[0072]
在本发明中,与白色脂肪细胞不同,术语“棕色脂肪细胞(ba)”是指氧化分解脂肪酸以将其能量释放为热量的细胞。这是因为棕色脂肪细胞特异性表达的线粒体内膜蛋白(解偶联蛋白1;ucp1)解偶联氧化磷酸化。在啮齿动物如小鼠中,ba细胞存在于肩胛间区域、后颈部、纵隔、肾脏等周围。此外,从ucp1敲除小鼠的解释可知,ba细胞抑制肥胖和异常的葡萄糖耐受性。
[0073]
本发明组合物中的鸢尾素可以原样使用,或者可以盐的形式使用,优选药学上可接受的盐。在本发明中,术语“药学上可接受的盐”包括源自药学上可接受的无机或有机酸或碱的盐。
[0074]
合适的酸的实施例可包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、葡糖酸、萘
‑2‑
磺酸、苯磺酸等。酸加成盐可以使用常规方法制备,例如通过将化合物溶解在过量的酸性水溶液中并用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈)沉淀所得盐。此外,酸加成盐可以通过在水中加热相同摩尔量的化合物和酸或醇,然后通过蒸发或吸收来干燥混合物以及过滤沉淀的盐来制备。
[0075]
由合适的碱衍生的盐可以包括碱金属如钠、钾等,碱土金属如镁等,铵等,但本发明不限于此。碱金属盐或碱土金属盐例如可以通过将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物
或碱土金属氢氧化物的溶液中,过滤不溶的复合盐,蒸发并干燥滤液来获得。在这种情况下,特别是作为金属盐制备钠盐、钾盐或钙盐在药学上是合适的。此外,可以通过使碱金属或碱土金属盐与合适的银盐(例如硝酸银)反应来获得对应于金属盐的银盐。
[0076]
本发明的组合物中鸢尾素的含量可以根据疾病的症状、症状的进展程度、患者的病情等进行适当调整。例如,基于组合物的总重量,鸢尾素的含量可以在0.0001至99.9wt%或0.001至50wt%的范围内,但本发明不限于此。含量比是基于除去溶剂的干燥产物的量的值。
[0077]
根据本发明的鸢尾素的药学有效量为0.001至300mg/天/kg体重,优选0.01至200mg/天/kg体重。然而,鸢尾素的药学有效量可根据各种因素适当变化,例如疾病和疾病的严重程度,患者的年龄、体重、健康状况和性别,给药途径,治疗期等。
[0078]
根据本发明的药物组合物还可包括通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。例如,赋形剂可包括选自由稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、保湿剂、薄膜包衣材料和控释添加剂组成的组中的一种或多种。
[0079]
本发明的药物组合物可制成外用制剂的形式,例如粉剂、颗粒剂、缓释颗粒剂、肠溶颗粒剂、液体剂、滴眼剂、酏剂、乳剂、悬液、酒、锭剂、香水、柠檬水、片剂、缓释片剂、肠溶片剂、舌下片剂、硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、肠溶胶囊、药丸、酊剂、软提取物、干提取物、流体提取物、注射剂、胶囊、灌注液、膏药、洗剂、糊剂、喷雾剂、吸入剂、贴剂、无菌注射液、气溶胶等,并根据每种常规方法使用。外用制剂可以具有例如霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、膏剂、洗剂、搽剂、糊剂、巴布剂等制剂。
[0080]
可包含在根据本发明的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
[0081]
当配制时,组合物可以使用常用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等)来制备。
[0082]
辅料(如玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、牛奶糖、白糖、葡萄糖、果糖、d
‑
甘露醇、沉淀碳酸钙、合成硅酸铝、磷酸氢钙、硫酸钙、氯化钠、碳酸氢钠、纯化羊毛脂、微晶纤维素、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、高岭土、尿素、胶体硅胶、羟丙基淀粉、羟丙基甲基纤维素1928、2208、2906、2910、丙二醇、酪蛋白、乳酸钙、羧甲基淀粉钠等)、粘合剂(如明胶、阿拉伯树胶、乙醇、琼脂粉、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、葡萄糖、纯净水、酪蛋白钠、甘油、硬脂酸、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素钠、甲基纤维素、微晶纤维素、糊精、羟基纤维素、羟丙基淀粉、羟甲基纤维素、精制虫胶、糊化淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等)可用作本发明的片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、丸剂和锭剂的添加剂。此外,可以使用崩解剂(如羟丙基甲基纤维素、玉米淀粉、琼脂粉、甲基纤维素、膨润土、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙、柠檬酸钙、十二烷基硫酸钠、硅酸酐、1
‑
羟丙基纤维素、右旋糖酐、离子交换树脂、聚醋酸乙烯酯、甲醛处理的酪蛋白和明胶、海藻酸、直链淀粉、瓜尔胶、碳酸氢钠、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙、胶化淀粉、阿拉伯树胶、支链淀粉、果胶、聚磷酸钠、乙基纤维素、白糖、硅酸铝镁、d
‑
山梨糖醇溶液、硬质硅酸酐等)和润滑剂(例如硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸、氢化植物油、滑石粉、
石松粉、高岭土、凡士林、硬脂酸钠、可可脂、水杨酸钠、水杨酸镁、聚乙二醇4000、6000、液体石蜡、氢化大豆油(lubri蜡)、硬脂酸铝、硬脂酸锌、十二烷基硫酸钠、氧化镁、聚乙二醇、合成硅酸铝、硅酸酐、高级脂肪酸、高级醇、硅油、石蜡油、聚乙二醇脂肪酸酯、淀粉、氯化钠、乙酸钠、油酸钠、d/l
‑
亮氨酸、硬质硅酸酐等)。
[0083]
水、稀盐酸、稀硫酸、柠檬酸钠、蔗糖单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(吐温酯)、聚氧乙烯单烷基醚、羊毛脂醚、羊毛脂酯、乙酸、盐酸、氢氧化铵、碳酸铵、氢氧化钾、氢氧化钠、醇溶谷蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠等可用作根据本发明的液体制剂的添加剂。
[0084]
白糖、其他糖、甜味剂等的溶液可用作根据本发明的糖浆。必要时可以使用香料、着色剂、防腐剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂、增稠剂等。
[0085]
在根据本发明的乳液中使用纯化水。必要时可以使用乳化剂、防腐剂、稳定剂、香料等。
[0086]
阿拉伯胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、海藻酸钠、羟丙基甲基纤维素1828、2906、2910等悬浮剂可用于本发明的悬浮液。必要时可以使用表面活性剂、防腐剂、稳定剂、着色剂和香料。
[0087]
本发明的注射液可以包括:溶剂,例如注射用蒸馏水、0.9%氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖 氯化钠注射液、peg、乳酸林格注射液、乙醇、丙二醇、不挥发油(芝麻油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油)、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、苯甲酸苄酯等;溶解助剂,例如苯甲酸钠、水杨酸钠、醋酸钠、尿素、尿烷、单乙基乙酰胺、苯基丁氮酮、丙二醇、吐温、烟酰胺、六胺、二甲基乙酰胺等;等渗剂,例如弱酸及其盐(乙酸和乙酸钠)、弱碱及其盐(氨和乙酸铵)、有机化合物、蛋白质、白蛋白、蛋白胨、树胶等;缓冲剂,如氯化钠等;稳定剂,例如亚硫酸氢钠(nahso3)二氧化碳气体、焦亚硫酸钠(na2s2o3)、亚硫酸钠(na2so3)、氮气(n2)、乙二胺四乙酸等;抗氧化剂,例如硫氢化钠(0.1%)、甲醛合次硫酸钠、硫脲、乙二胺四乙酸二钠、丙酮合亚硫酸氢钠等;镇痛剂,例如苯甲醇、氯丁醇、盐酸普鲁卡因、葡萄糖、葡萄糖酸钙等;悬浮剂,例如cmc钠、海藻酸钠、吐温80、单硬脂酸铝等。
[0088]
基质,例如可可脂、羊毛脂、witepsol、聚乙二醇、甘油明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸和油酸的混合物、subanal、棉籽油、花生油、棕榈油、可可脂 胆固醇、卵磷脂、lanette蜡、单硬脂酸甘油酯、吐温或span、imhausen、莫诺纶(丙二醇单硬脂酸酯)、甘油、固相动物脂肪、buytyrum tego
‑
g、cebes pharma 16、hexaride base 95、cotomar、hydrokote sp、s
‑
70
‑
xxa、s
‑
70
‑
xx75(s
‑
70
‑
xx95)、hydrokote 25、hydrokote 711、idropostal、massa estrarium a,as,b,c,d,e,i,t,massa
‑
mf、masuppol、masuppol
‑
15、neosuppostal
‑
n、paramound
–
b、supposiro(osi,osix,a,b,c,d,h,l)、iv型栓剂基质(ab,b,a,bc,bbg,e,bgf,c,d,299)、suppostal(n,es)、wecoby(w、r、s、m、fs)、tegester甘油三酯基质(tg
‑
95,ma,57)等,可用于根据本发明的栓剂。
[0089]
用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等。这种固体制剂通过将至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等)与提取物混合来制备。此外,除了简单的赋形剂之外,还使用润滑剂,如硬脂酸镁、滑石等。
[0090]
用于口服给药的液体制剂包括混悬剂、口服液、乳剂、糖浆等。除了常用的简单稀释剂如水、液体石蜡等外,液体制剂还可以包括各种赋形剂,例如润湿剂、甜味剂、香料、防
腐剂等。
[0091]
肠胃外给药制剂包括无菌水溶液、非水溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射酯(如油酸乙酯)等可用作非水溶剂和悬浮剂。
[0092]
本发明的药物组合物以药学有效量给药。在本发明中,术语“药学有效量”是指在适用于医学治疗的合理收益/风险比下足以治疗疾病的量,有效剂量的水平可根据患者的疾病的类型和严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药持续时间、给药途径和分泌速度、治疗周期、包括同时使用的药物在内的因素以及其他医学领域众所周知的因素确定。
[0093]
本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂联合给药。在这种情况下,药物组合物可以与常规治疗剂依次或同时给药,并且可以单剂量或多剂量给药。考虑到上述所有因素,重要的是施用一定量的药物组合物,其可以以最小量实现最大效果而没有任何副作用。在这种情况下,本发明所属领域的技术人员可以容易地确定药物组合物的量。
[0094]
本发明的药物组合物可以通过多种给药途径给予受试者。可以预期所有给药方式,并且药物组合物可以例如通过口服、皮下注射、腹膜内给药、静脉内注射、肌内注射、椎旁(硬膜内)注射、舌下给药、颊部给药、经直肠给药、宫颈插入、眼内给药、耳内给药、鼻内给药、吸入、经口或鼻喷雾、经皮给药、皮肤给药等。
[0095]
在本发明的药物组合物中,给药方式可以根据作为活性成分的药物的种类,结合各种相关因素(例如所治疗的疾病、给药途径、年龄、性别、患者的体重、疾病的严重程度等)而确定。
[0096]
在本说明书中,术语“受试者(个体)”是指可以施用本发明的重组鸢尾素蛋白的目标。更具体地,受试者可以包括哺乳动物,例如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛等,但本发明不限于此。
[0097]
在本发明中,术语“给药”是指使用任何合适的方法向受试者提供预定量的本发明的组合物的过程。
[0098]
为了本发明的目的,术语“预防”是指通过施用本发明的组合物抑制或延迟代谢疾病发作的所有类型的作用,并且术语“治疗”是指用于抑制代谢疾病的发作或复发,缓解代谢疾病的症状,减少疾病的直接或间接病理结果,减缓疾病的进展速度,减轻、改善或缓解疾病状况的所有类型的作用,或指预后的改善。在本发明中,术语“改善”是指通过施用本发明的组合物来至少降低参数(例如与待治疗的病症相关的症状)的程度的所有类型的作用。
[0099]
本发明的食物组合物包括所有类型的功能性食品、营养补充剂、保健食品、保健功能食品和食品添加剂等。食物组合物的类型可以根据相关领域已知的常规方法制备成各种形式。
[0100]
例如,本发明的鸢尾素可以制成茶、果汁和饮料的形式,作为保健食品饮用,或者造粒、胶囊化和粉末化,然后咽下。此外,本发明的鸢尾素可以与已知对代谢疾病有效果的材料或活性成分混合,并以组合物的形式制备。例如,除了鸢尾素成分之外,本发明的食物组合物还可以包含微量矿物质、维生素、脂质、糖类和除了鸢尾素成分之外的其他已知对代谢性疾病具有治疗效果的成分。矿物质可包括生长所需的营养成分,例如钙、铁等,维生素可包括维生素c、维生素e、维生素b1、维生素b2、维生素b6等。脂质可包括烷氧基甘油、卵磷脂等,而糖类可包括低聚果糖等。
[0101]
此外,可通过将本发明的鸢尾素添加到饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例如罐装水果、瓶装水果、果酱、橘子酱等)、鱼、肉及其加工食品(如火腿、香肠、咸牛肉等)、面包和面条(如乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、太妃糖、乳制品(例如黄油、奶酪等)、食用植物脂肪和油、人造黄油、植物蛋白、甑煮食品、冷冻食品、各种调味品(例如发酵豆瓣酱、酱油、酱汁等)等中来制备功能性食品。
[0102]
此外,本发明的鸢尾素可以制成粉末或浓缩物的形式,然后以食品添加剂的形式使用。
[0103]
相对于食物组合物的总重量,本发明的食物组合物中鸢尾素的含量优选为食品总重量的0.01
‑
100wt%,优选0.1
‑
50wt%。
[0104]
考虑到本发明的功能,本发明所使用的术语已被选择为尽可能广泛使用的通用术语,但这可能会根据本领域技术人员的意图或先例、新技术的出现等而有所不同。此外,在某些情况下,还有申请人任意选择的术语,其含义将在本发明的说明书中详细说明。因此,本发明中所使用的术语应根据术语的含义和贯穿本发明的内容(而不是简单的术语名称)来定义。
[0105]
在本发明的整个说明书中,当任何部分被称为“包括”任何组分时,这意味着它可以进一步包括其他组分,而不是排除其他组分,除非另有说明。此外,在本发明的整个说明书中使用的术语“大约”、“基本上”等是在制造时的数值上或非常接近制造时的数值而使用,在指示的含义中固有的材料公差是为了帮助理解本发明。准确或绝对的数字用于帮助防止不道德的侵权者进行不正当使用。
[0106]
发明方式
[0107]
在下文中,呈现本发明的优选实施方式以帮助理解本发明。但是,应当理解,以下实施方式以举例说明的方式给出,仅为了更容易地理解本发明,并不用于限制本发明。
[0108]
实施例
[0109]
实施例1:用于在植物中表达的重组鸢尾素载体的制备
[0110]
如图1所示,构建了用于在植物中表达鸢尾素的重组植物表达载体。更具体地,获得关于人鸢尾素激素的遗传信息,使用其表达在本氏烟草中优化的序列(seq id no:1)合成基因。伴侣结合蛋白(bip)(编码信号肽的多核苷酸)(seq id no:2)、编码六个连续组氨酸的多核苷酸(seq id no:3)和编码鸢尾素的多核苷酸依次连接在camv35s启动子基因和pcambia1300载体的nos终止子之间,以构建鸢尾素植物表达载体。
[0111]
实施例2:重组鸢尾素蛋白表达的确认
[0112]
2.1:植物表达载体的瞬时表达
[0113]
使用电穿孔将实施例1中制备的植物表达载体转化为农杆菌菌株lba4404。将5ml转化的农杆菌在5ml酵母提取物蛋白胨(yep)液体培养基(10g酵母提取物、10g蛋白胨、5g nacl、50mg/l卡那霉素和25mg/l利福平)中在28℃下振荡培养6小时,将1ml原代培养液接种在50ml新鲜yep培养基中,然后在28℃下振荡培养6小时。将如此培养的农杆菌离心(在7,000rpm和4℃下持续5分钟)以收集细胞,并将细胞以1.0的光密度(o.d.)重新悬浮在渗透缓冲液(10mm mes(ph 5.7),10mm mgcl2、200μm乙酰丁香酮)中,波长为600nm。使用取下注射针头的注射器,利用将农杆菌悬浮液注射到本氏烟草的叶子背面的方法使农杆菌悬浮液进行农杆菌渗透。
[0114]
2.2:确认重组鸢尾素在植物中的表达
[0115]
从实施例2.1中制备的植物叶中提取蛋白质,并离心。此后,通过蛋白质印迹法确认溶液中包含的水溶性组分(s)中的蛋白质和颗粒(p)组分中的蛋白质。更具体地,将30μl的每种组分与sds样品缓冲液混合,然后加热。然后,通过在10%sds
‑
page凝胶上电泳按大小分离蛋白质,将分离的蛋白质转移到pvdf膜上,然后用5%脱脂牛奶封闭。随后,将与6个组氨酸残基反应的抗体结合到膜上,按照厂商提供的方法用ecl溶液处理,从而确认重组鸢尾素的表达。结果示于图2。
[0116]
如图2所示,证实植物中表达的重组鸢尾素存在于水溶性组分中,同时制备了三种不同大小的鸢尾素。
[0117]
由上述结果可知,本发明的鸢尾素表达载体可以有效地在植物中表达重组鸢尾素蛋白,使用该载体制备的鸢尾素由于溶解度高,易于分离和纯化,并且,由于重组蛋白的聚集被抑制,重组蛋白的生理或药理活性得到有效维持。
[0118]
实施例3:重组鸢尾素的分离和纯化
[0119]
将200ml蛋白质提取溶液(50mm磷酸钠(ph 8.0)、300mm nacl、20mm咪唑、0.1%triton x
‑
100和1x蛋白酶抑制剂)添加到40g实施例2.1中制备的本氏烟草中,并使用搅拌机将组织均质化。此后,均质的组织在13000rpm和4℃下离心20分钟以收集蛋白质提取物。
[0120]
为了分离和纯化表达的鸢尾素,使用填充有ni
‑
nta琼脂糖树脂的柱对表达的鸢尾素进行亲和层析。用5ml树脂填充柱子,然后用50ml洗涤液(50mm磷酸钠(ph 8.0)、300mm nacl、20mm咪唑)平衡。将收集的蛋白质提取物装载到柱上,然后用100ml洗涤液洗涤树脂。然后,用洗脱溶液(50mm磷酸钠(ph 8.0)、300mm nacl、300mm咪唑)洗脱重组蛋白。将含有重组蛋白的洗脱液通过10kd大小的过滤器更换为生理盐水(pbs)溶液,浓缩得到分离纯化的重组鸢尾素。使用sds
‑
page对分离和纯化的蛋白质进行电泳,然后通过考马斯染色确认(图3)。
[0121]
如图3所示,确认了大小约为13kd等的三种重组鸢尾素蛋白被纯化。
[0122]
与现有蛋白质相比,本发明的重组蛋白质易于纯化,没有任何大的差异。基于这些结果,确认没有问题,即当蛋白质在植物中表达时,没有发现由糖结构修饰引起的生产效率降低的问题。结果证实,根据本发明的蛋白质在植物中很好地产生。
[0123]
实施例4:通过内切糖苷酶h处理确认重组鸢尾素的糖基化
[0124]
为了检查分离和纯化的鸢尾素在植物中是否被糖基化,使用内切糖苷酶h进行了去n
‑
糖基化测定。更具体地,将10x变性缓冲液(5%sds,0.4m dtt)加入到1μg实施例3中制备的重组鸢尾素中,然后在100℃加热10分钟。加入柠檬酸钠(ph 5.5)缓冲液,使缓冲液终浓度为50mm,加入50u内切糖苷酶h,37℃反应1小时。对于不含内切糖苷酶h的对照反应,加入等体积的水代替内切糖苷酶h。反应完成后,使用sds
‑
page对蛋白质进行电泳,并通过考马斯染色观察根据去
‑
n
‑
糖基化的重组鸢尾素的分子量的改变(图4)。
[0125]
如图4所示,当鸢尾素用内切糖苷酶h处理时,观察到一种尺寸的鸢尾素,因为鸢尾素的聚糖被切割,表明表达的鸢尾素在植物中被糖基化。
[0126]
实施例5:植物源鸢尾素蛋白生理活性的确认
[0127]
3t3
‑
l1前脂肪细胞在细胞培养液中于37℃培养,该培养液是通过利用10%fbs、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充dulbecco改良的伊格尔培养基(dmem)获得的,使
用了加湿的co2培养箱(5%co2/95%空气)。通过用补充有10%fbs、5μg/ml胰岛素、0.25mm地塞米松、0.5mm 1甲基
‑3‑
异丁基黄嘌呤的dmem替换培养液,脂肪细胞达到100%汇合(汇合后,第0天)后两天,脂肪细胞分化。两天后,将培养液更换为补充有10%fbs、5μg/ml胰岛素的dmem。两天后,培养液再次更换为补充有10%fbs的dmem。结果,脂肪细胞总共分化了10天,然后用于本实验。为了测试对脂肪分化的影响,从分化诱导开始之日起,每隔两天用实施例3中制备的植物来源的鸢尾素处理脂肪细胞,持续4天。
[0128]
用实施例3中制备的重组鸢尾素蛋白以10mg/ml的浓度处理分化的脂肪细胞。48小时后,从脂肪细胞中提取表达的蛋白质,然后进行蛋白质印迹。
[0129]
为了分析3t3
‑
l1细胞中的蛋白质,用ripa裂解缓冲液处理细胞,然后以13000rpm离心15分钟以在上清液中分离全部蛋白质。分离的蛋白质在laemmli样品缓冲液中混合,然后使用sds
‑
page通过电泳分离。此后,将蛋白质转移到聚二氟乙烯(pvdf)膜上。转移后的pvdf膜用5%脱脂牛奶处理以封闭非特异性蛋白,用初级抗体在4℃培养过夜,然后用二级抗体在室温培养1小时。最后用ecl溶液处理培养的细胞,分析las
‑
4000中蛋白质的表达水平。本文使用的抗体购自cell signaling technology(danvers,ma,usa)和santa cruz biotechnology(santa cruz,ca,ua)。
[0130]
结果,如图5所示,在用鸢尾素处理后,观察到解偶联蛋白1(ucp1)的细胞内表达增加。ucp 1是一种基于白色脂肪转化为棕色脂肪的生物标志物。因此,这些结果表明植物来源的鸢尾素原样保持脂肪细胞褐变(browning)活性。
[0131]
此外,如图6所示,在细胞用鸢尾素处理后观察到从细胞分泌的脂联素增加。脂联素是脂肪细胞分泌的代表性脂肪因子之一,已知通过改善全身代谢(例如通过改善胰岛素抗性)具有抗糖尿病和抗肥胖作用。因此,这意味着源自植物的鸢尾素具有通过控制脂肪因子来调节全身代谢的功能。
[0132]
由上述结果可以看出,本发明的重组鸢尾素蛋白可以在植物中有效表达,并且由于重组鸢尾素蛋白具有高溶解度,因此易于分离和纯化。还可以看出,本发明的重组鸢尾素蛋白可以有效地用于治疗代谢性疾病,因为重组鸢尾素蛋白具有诱导ucp1和脂联素表达增加的作用。
[0133]
在下文中,将参考其制备实施例描述根据本发明的药物组合物和食物组合物。然而,应当理解,以下制备实施例仅用于说明的目的,并不旨在限制本发明的范围。
[0134]
制备实施例1:药物组合物的制备
[0135]
1.1:粉末的制备
[0136]
重组鸢尾素蛋白
ꢀꢀ
20毫克
[0137]
牛奶糖
ꢀꢀ
100毫克
[0138]
滑石
ꢀꢀ
10毫克
[0139]
将各组分混合,装入密封袋中制成粉末。
[0140]
1.2:片剂的制备
[0141]
重组鸢尾素蛋白
ꢀꢀ
20毫克
[0142]
玉米淀粉
ꢀꢀ
100毫克
[0143]
牛奶糖
ꢀꢀ
100毫克
[0144]
硬脂酸镁
ꢀꢀ
2毫克
[0145]
根据制备片剂的常规方法将各组分混合,并将所得混合物压片以制备片剂。
[0146]
1.3:胶囊的制备
[0147]
重组鸢尾素蛋白
ꢀꢀ
20毫克
[0148]
结晶纤维素
ꢀꢀ
3毫克
[0149]
乳糖
ꢀꢀ
14.8毫克
[0150]
硬脂酸镁
ꢀꢀ
0.2毫克
[0151]
根据制备胶囊的常规方法将所述组分混合,并填充在明胶胶囊中以制备胶囊。
[0152]
1.4:注射剂的制备
[0153]
重组鸢尾素蛋白
ꢀꢀ
20毫克
[0154]
甘露醇
ꢀꢀ
180毫克
[0155]
注射用无菌蒸馏水
ꢀꢀ
2974毫克
[0156]
na2hpo42h2o
ꢀꢀ
26毫克
[0157]
根据制备注射剂的常规方法通过每安瓿(2ml)添加组分含量来制备注射剂。
[0158]
1.5:液体的制备
[0159]
重组鸢尾素蛋白
ꢀꢀ
20毫克
[0160]
异构化葡萄糖浆
ꢀꢀ
10克
[0161]
甘露醇
ꢀꢀ
5克
[0162]
纯净水
ꢀꢀ
余量
[0163]
按照常规的液体制备方法制备液体,将各组分加入并溶解在纯净水中,加入适量柠檬香精,将上述组分混合,加入纯净水调节所得混合物的总量至100ml,将混合物装入棕色小瓶中,然后对混合物进行灭菌。
[0164]
制备实施例2:保健食品的制备
[0165]
重组鸢尾素蛋白
ꢀꢀ
100毫克
[0166]
维生素混合物
ꢀꢀ
适量
[0167]
维生素a醋酸盐
ꢀꢀ
70μg
[0168]
维生素e
ꢀꢀ
1.0毫克
[0169]
维生素b1
ꢀꢀ
0.13毫克
[0170]
维生素b2
ꢀꢀ
0.15毫克
[0171]
维生素b6
ꢀꢀ
0.5毫克
[0172]
维生素b12
ꢀꢀ
0.2微克
[0173]
维生素c
ꢀꢀ
10毫克
[0174]
生物素
ꢀꢀ
10微克
[0175]
烟酰胺
ꢀꢀ
1.7毫克
[0176]
叶酸
ꢀꢀ
50微克
[0177]
泛酸钙
ꢀꢀ
0.5毫克
[0178]
矿物混合物
ꢀꢀ
适量
[0179]
硫酸亚铁
ꢀꢀ
1.75毫克
[0180]
氧化锌
ꢀꢀ
0.82毫克
[0181]
碳酸镁
ꢀꢀ
25.3毫克
[0182]
磷酸二氢钾
ꢀꢀ
15毫克
[0183]
磷酸氢钙
ꢀꢀ
55毫克
[0184]
柠檬酸钾
ꢀꢀ
90毫克
[0185]
碳酸钙
ꢀꢀ
100毫克
[0186]
氯化镁
ꢀꢀ
24.8毫克
[0187]
维生素和矿物质混合物的组成比例通过混合相对更适合保健食品的成分来确定,但是维生素和矿物质混合物的混合比例可以任意修改。将各组分混合,并将所得混合物根据制备保健食品的常规方法制备成颗粒。然后,可以根据常规方法将颗粒用于制备保健食品组合物。
[0188]
制备实施例3:保健饮料的制备
[0189]
重组鸢尾素蛋白
ꢀꢀ
100毫克
[0190]
维生素c
ꢀꢀ
15克
[0191]
维生素e(粉末)
ꢀꢀ
100克
[0192]
乳酸亚铁
ꢀꢀ
19.75克
[0193]
氧化锌
ꢀꢀ
3.5克
[0194]
烟酰胺
ꢀꢀ
3.5克
[0195]
维生素a
ꢀꢀ
0.2克
[0196]
维生素b1
ꢀꢀ
0.25克
[0197]
维生素b2
ꢀꢀ
0.3克
[0198]
水
ꢀꢀ
余量
[0199]
将各组分混合并在85℃搅拌下加热约1小时,然后根据制备保健饮料的常规方法将制备的溶液过滤并填充到2l无菌容器中。此后,将容器密封、消毒,然后冷冻。然后,容器中的溶液用于制备本发明的保健饮料组合物。成分的组成比例是通过混合相对更适合受欢迎的饮料的成分来确定的,但维生素和矿物质混合物的混合比例可以根据地区和国家的喜好(例如需求的等级,需求国家、使用目的等)来任意改变。
[0200]
本发明的以上描述仅通过说明的方式给出。因此,本发明所属领域的技术人员将理解,在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下,本发明可以以其他具体形式实施。因此,应当理解,上述实施方式仅用于说明目的,并不用于限制所有方面。
[0201]
工业实用性
[0202]
本发明的重组鸢尾素蛋白可以在植物中有效表达,并且由于重组鸢尾素蛋白具有高水溶性,因此可以容易地分离和纯化。此外,由于重组鸢尾素蛋白具有诱导ucp1和脂联素表达增加的作用,因此预期本发明的重组鸢尾素蛋白可有效地用于治疗代谢性疾病。因此,本发明的重组鸢尾素蛋白可在工业上应用。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。