一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法与流程

一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法
技术领域
1.本发明涉及基因表达技术领域，尤其涉及一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法。


背景技术：

2.生物体内低浓度超氧阴离子自由基(o2‑
)是维持生命活动所必需的，其浓度过高时，可引起机体组织细胞氧化损伤，导致机体发生疾病，甚至死亡。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase；sod)是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与很多疾病的发生、发展密不可分。sod复合酶是唯一能清除细胞中自由基的酶，自由基是带有不成对电子、原子或离子，其化学性质活泼，有极高的氧化性能，以夺取核酸、氨基酸等生物分子的电子，使这些物质性质演化成毒性更强的羟自由基，可导致机体的多种疾病。研究表明，机体的衰老、病变及辐射伤害都同自由基的形式有关，故sod有抗衰老、抗辐射、消炎、抑制肿瘤和癌症的功能。研究还表明，sod对胃病、气管炎、皮肤病、烧伤、脚气等都有独特疗效，对醒酒、亢奋精神、抗疲劳、恢复体力、减肥也有很好的效果，目前在化妆品、食品、保健品、医药、酒类、饮料等行业也已开始使用sod，其发展前景十分广阔。
3.利用大肠杆菌生产蛋白质的主要优点在于易于培养，可降低生产成本；能够经过大量培养从而获得高产量的重组蛋白，但大肠杆菌的表达产物容易形成无生物学活性的包涵体，纯化后还需进行复性处理，影响了产物的回收率和活性。包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关。强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。
4.因此，在利用大肠杆菌生产蛋白时，如何在增加sod3可溶性表达的同时提高酶活性就显得尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法，实现拟南芥sod3可溶性表达及酶活性增强。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加fe
3
，培养sod3宿主细胞。
8.作为优选，所述培养基为lb液体培养基。
9.作为优选，所述培养基中fe
3
的浓度为500～1000μm，所述fe
3
添加时采用fecl3。
10.作为优选，所述培养的过程为：将sod3宿主细胞在23～27℃下培养至od600为0.38～0.42，加入iptg诱导剂，继续培养4～6h。
11.作为优选，所述sod3宿主细胞为含有原核表达载体的大肠杆菌bl21，所述iptg诱导剂在培养基中的浓度为0.15～0.25mm。
12.作为优选，所述原核表达载体为含有sod3基因的重组质粒。
13.作为优选，所述质粒为pet
‑
28a( )质粒。
14.作为优选，所述sod3基因提取自拟南芥。
15.作为优选，所述sod3基因通过上下游引物扩增得到，所述上游引物的序列如seq id no：1所示，所述下游引物的序列如seq id no：2所示。
16.本发明还提供了fe
3
在增加sod3可溶性表达及提高酶活性中的应用。
17.本发明提供了一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加fe
3
，培养sod3宿主细胞。结果表明通过在培养基中添加的铁离子，诱导sod3可溶性表达，虽然表达量没有显著增加，但酶活性提高7倍左右。采用本发明方法，可实现拟南芥sod3可溶性表达及酶活性增强，达到理想的sod3产量和活性。通过选择合适的表达载体和宿主细胞，且在培养基中添加fe
3
诱导培养，高效可溶性表达拟南芥sod3，同时酶活性显著提高，使大规模制备sod3成为可能，为后续的sod3使用提供物质基础。
附图说明
18.图1为拟南芥sod3重组质粒pet28a( )的pcr鉴定结果；
19.图2为拟南芥sod3重组质粒hind
ꢀⅲ
和xhoⅰ双酶切鉴定结果；
20.图3为37℃诱导重组sod3的sds
‑
page结果；
21.图4为25℃低温诱导重组sod3的sds
‑
page结果；
22.图5为25℃低温诱导转染重组sod3质粒细胞不同组分sds
‑
page结果；
23.图6为镍柱纯化的sod3的western blotting结果；
24.图7为不同浓度的fe
3
诱导sod3表达的sds
‑
page分析；
25.图8为sod3活性受不同浓度的fe
3
影响。
具体实施方式
26.本发明提供了一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加fe
3
，培养sod3宿主细胞。
27.在本发明中，所述培养基优选为lb液体培养基。
28.在本发明中，所述培养基中fe
3
的浓度优选为500～1000μm，进一步优选为600～900μm，再进一步优选为750μm。
29.在本发明中，所述fe
3
添加时优选采用fecl3。
30.在本发明中，所述培养的过程为：将sod3宿主细胞在23～27℃下培养至od600为0.38～0.42，加入iptg诱导剂，继续培养4～6h。
31.在本发明中，所述培养的温度优选为24～26℃，进一步优选为25℃。
32.在本发明中，所述od600优选为0.4。
33.在本发明中，加入iptg诱导剂后培养的时间优选为5h。
34.在本发明中，所述sod3宿主细胞优选为含有原核表达载体的大肠杆菌bl21。
35.在本发明中，所述iptg诱导剂在培养基中的浓度优选为0.15～0.25mm，进一步优
选为0.18～0.22mm，再进一步优选为0.2mm。
36.在本发明中，所述原核表达载体优选为含有sod3基因的重组质粒。
37.在本发明中，所述质粒优选为pet
‑
28a( )质粒。
38.在本发明中，所述sod3基因优选提取自拟南芥。
39.在本发明中，所述sod3基因优选通过上下游引物扩增得到。
40.在本发明中，所述上游引物的序列如seq id no：1所示，所述下游引物的序列如seqidno：2所示。
41.本发明还提供了fe
3
在增加sod3可溶性表达及提高酶活性中的应用
42.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
43.实施例1重组质粒构建
44.从genbankdatabase中检索得到编码的拟南芥sod3的基因序列(genbank,np_194240.1)。根据检索到的sod的基因序列设计一对特异性引物sod
‑
f与sod
‑
r。sod
‑
f中引入hindш位点，sod
‑
r中引入xhoi位点，如下用横线标出。引物由生物技术公司合成。
45.上游引物sod3
‑
f：5’cccaagcttgcatggctgcttcaagtgctgtc3’，
46.下游引物sod3
‑
r：5’ccgctcgagttaagcagaagcagcctt3’。
47.以拟南芥的基因组(cdna)作为模板，以sod3
‑
f、sod3
‑
r引物进行pcr扩增。回收pcr产物，并与克隆载体pmd18
‑
t连接，构建了重组质粒pmd18
‑
t/sod3。
48.实施例2酶切鉴定
49.重组质粒pmd18
‑
t/sod3和空质粒pet28a( )经限制性内切酶hindш和xhoι消化，两者的消化产物经t4dna连接酶的作用进行连接，目的基因sod3最终被克隆到表达载体pet
‑
28a( )上，连接产物转化dh5α涂板37℃过夜培养，挑取单克隆在含卡纳抗性的液体lb培养基中37℃过夜培养约16h后提质粒。提取质粒用hindш和xhoi双酶切和测序进行验证，验证正确的质粒为表达载体质粒sod3
‑
pet28a( )。
50.实施例3重组蛋白可溶性表达
51.含重组质粒的表达菌株在大肠杆菌细胞中诱导表达。验证正确的sod3
‑
pet28a( )质粒转化bl21(de3)中，涂板37℃过夜培养，挑取单克隆在含卡纳抗性的液体lb培养基中37℃过夜培养16～18h后，按照1％的体积比分别转接到30、100、500、750、1000um的fe
3
的100ml的培养基中扩大培养，25℃下摇至od600约为0.4。取出培养菌液，先取出1ml菌液作为0h的对照，剩余菌液在冰上静置20min后，lb培养基中再加入终浓度为0.2mm的iptg诱导剂，25℃下200rpm条件继续培养。5h后于4℃低温离心机4500g离心15min后弃上清，收集菌体，菌体用50mm ph8.0的tris
‑
hcl缓冲液洗涤两次去除残留的lb培养基。
52.实施例4细胞破碎及蛋白收集
53.收集菌体在超声波细胞破碎仪上进行超声破碎，每100ml培养基收集的菌体最终悬浮成总体积为2.5ml，其中各组分的体积为：100mm pmsf 25μl、50mm ph8.0 tris
‑
hcl 2.475ml。工作参数设置为：破碎功率130w，破碎时间10s，间隔时间10s，超声破碎总时间40min，整个反应在冰水浴条件下进行。超声结束后，样品在低温离心机内4℃，19000g离心20min，移出上清液至新的ep管中，再将上清离心一次，保证上清和沉淀分离彻底。
54.实施例5镍柱(ni
‑
resin)亲和纯化
55.纯化过程在4℃层析冷柜中进行，在10ml空柱子中加入约2ml的ni
‑
resin，首先用5倍柱体积的超纯水过柱三次以清洗树脂，再用10倍柱体积的ni
‑
resin平衡buffer(50mmtris
‑
hcl，150mm nacl，ph8.0)过柱，用于平衡树脂。将柱子下方出口关闭，并将准备好的蛋白样品加入到柱体中，与树脂充分接触，上方盖上盖并轻轻混合，在4℃条件下混合2h，每隔一段时间混匀一次。打开下方出口，收集流出液并标记为镍柱流过液。柱中加入5～10倍柱体积的ni
‑
resin wash buffer(50mm tris
‑
hcl，300mm nacl，20mm imidazole，ph8.0)过柱，收集流出液并标记为清洗液。在柱中加入2～3倍柱体积的不同咪唑浓度的elution buffer i(50mmtris
‑
hcl，300mm nacl，50mm imidazole，ph8.0)和elution buffer ii(50mmtris
‑
hcl，300mm nacl，100mm imidazole，ph8.0)，将结合在树脂上的目的蛋白洗脱下来，分别收集流出液，标记对应浓度下的洗脱情况。将收集液各取出80μl，每管加入20μl的5
×
sds loading buffer(含β
‑
巯基乙醇)，加热煮沸10min后，用于sds
‑
page电泳检测，看蛋白纯化情况。
56.实施例6western bloting鉴定
57.将纯化的蛋白分别以10ul的量上样，以10％sds
‑
page胶电泳，电泳结束后将凝胶转膜至pvdf膜，转膜时间1h将pvdf膜置于含5％脱脂奶粉的pbs封闭液，4℃封闭过夜，pbst洗膜3次，每次10min以鼠抗his标签单克隆抗体为一抗(1：5000)，孵育2h，pbst洗膜3次，每次l0min，以hrp标记的羊抗兔igg抗体为二抗(1：5000)，孵育2h，pbst洗膜3次，每次l0min，观察结果。
58.实施例7蛋白生物学活性检测
59.采用sod活性检测试剂盒，购自碧云天生物技术公司，根据试剂盒的说明书进行检测。试剂盒采用经典的氮蓝四唑(nbt)显色法。通过试剂盒通过黄嘌呤(xanthine)及黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)反应系统产生超氧阴离子(o2
‑
)，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜(formazan)，后者在560nm处有强吸收。而sod可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析就可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。
60.实验结果：
61.1、重组质粒的鉴定结果如图1和图2所示，图1中m为dl 2000dna标记；1为拟南芥叶片cdna的pcr扩增产物。图2中m1为1kbdna标记；m2为dl 2000dna标记；1～4为挑取的sod3
‑
pet28a( )四个不同菌落双酶切电泳图。
62.2、37℃诱导重组sod3的sds
‑
page和western blotting结果如图3所示。其中，1、2为空载体(pet28a( ))诱导0和5小时表达的全菌蛋白。3、4为空载体(pet28a( ))诱导5小时沉淀和上清。5、6、7为sod3
‑
pet28a诱导5小时上清、沉淀和全菌蛋白。
63.3、25℃低温诱导重组sod3的sds
‑
page和western blotting结果如图4～6所示。图4中1、2为空载体(pet28a( ))诱导0和5小时表达的全菌蛋白；3、4为空载体(pet28a( ))诱导5小时沉淀和上清；5、6为sod3
‑
pet28a( )诱导0和5小时表达的全菌蛋白；7、8为sod3
‑
pet28a诱导5小时沉淀和上清。图5中1为sod3细胞超声离心裂粗液；2为镍柱纯化后的hsod3粗酶剩余物；3为溶解液i(50mm tris，ph8.0，300mm nacl，50mm咪唑)洗脱镍柱收集液；4为溶解液ii(50mm tris，ph8.0，300mm nacl，100mm咪唑)洗脱镍柱收集液；5为透析纯化hsod3。图6为镍柱纯化的sod3的western blotting，m为pageruler plus欲染蛋白标记。
64.4、不同浓度的fe
3
诱导sod3的sds
‑
page分析结果如图7所示。m为蛋白质分子量标记；ep为质粒pet
‑
28a( )。
65.5、sod3活性受不同浓度的fe
3
影响如图8所示。x轴代表不同浓度的离子，y轴表示酶活，对照被定义为1。数据表示为中值的来自三个独立实验的平均值(sd)，**表示p<0.01。
66.由以上实施例可知，本发明提供了一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加fe
3
，培养sod3宿主细胞。结果表明通过在培养基中添加的铁离子，诱导sod3可溶性表达，虽然表达量没有显著增加，但酶活性提高7倍左右。采用本发明方法，可实现拟南芥sod3可溶性表达及酶活性增强，达到理想的sod3产量和活性，为后续的sod3使用提供物质基础。
67.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。