一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法与流程

一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法
【技术领域】
1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法。


背景技术：

2.花青素是一种天然的食用色素，具有安全，无毒的特点。花青素虽然广泛地存在于天然植物中，但依赖天然植物提取花青素具有局限性。目前花青素植物提取的主要来源于葡萄酒行业的葡萄皮。原花青素可作为天然的食源性防腐剂主要来源是松树皮和葡萄籽。在食品加工和保健品等行业对花青素和原花青素的需求日益增加，原有的来源途径不足以满足市场需求。因此，在“低碳经济”的条件下，必须寻求更广泛的材料来生产葡萄生物活性物质。利用植物细胞培养技术离体培养植物细胞，获得次生代谢产物高产细胞系；改进培养条件和技术；设计适合植物细胞培养的发酵罐等的研究是目前植物生物技术领域工业化生产次生代谢产物的研究热点。次生代谢产物是植物的主要活性成分，根据不完全统计已经从植物细胞培养中分离出了600种以上次生代谢产物，其中一部分次生代谢含量超过或等同于原植株的含量。利用本实验室已建立的高产花青素和原花青素的刺葡萄松散型红色愈伤组织，进一步建立刺葡萄愈伤组织高产花青素悬浮培养体系，能够快速高效的生产天然花青素等次生代谢产物，加快葡萄次生代谢物提取的发展。为进行葡萄细胞工业化生产花青素提供理论基础和技术平台。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题，在于提供一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法，利用该发明可快速、高效、短周期的生产葡萄天然生物活性物质，为花青素等天然生物活性物质工厂化的快速生产开辟新途径。
4.本发明是这样实现的：
5.一种高产花青素刺葡萄悬浮细胞系建立的方法，包括如下步骤：
6.(1)材料与预处理：以长期继代保存的紫红色刺葡萄愈伤组织细胞系为材料，挑选紫红色均匀的、生长状态一致的刺葡萄愈伤组织，于同一种继代固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养3代，使刺葡萄愈伤组织生长状态达到同步化，愈伤组织团松散、紫红色均匀、绝大部分细胞呈圆形；
7.(2)悬浮培养促发：在固体培养基上进行对数细胞同步增殖培养的第4代刺葡萄愈伤组织，培养至18天，于超净工作台中，取新鲜、松散易碎的红色愈伤组织，放入装有液体培养基的三角瓶中，用镊子轻轻夹散愈伤组织团，于25℃，光照强度2000～3000lux，光照时间12h/天的条件下，摇床转速120rpm，振荡培养；
8.(3)细胞悬浮培养的建立：取经悬浮促发获得的分散性较好的刺葡萄悬浮细胞，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，接种到新的液体培养基中培养10天后，进行继代培养，获得细胞悬浮液种子细胞；
9.(4)悬浮细胞继代增殖：将获得的刺葡萄细胞悬浮液种子细胞，每隔10天按步骤(3)操作方式继代增殖；
10.(5)悬浮细胞延时培养与花青素生产：将增殖培养后的刺葡萄悬浮细胞进行延时培养，即将增殖后的细胞继续培养至20天，达到悬浮细胞生长的稳定期，此时细胞中花青素含量也达到稳定期；
11.(6)悬浮细胞系长期保持：采用对数中期细胞隔代交替继代培养，按步骤(3)操作方式，选择对数生长期中期即培养10天的刺葡萄悬浮细胞进行继代，并在1号液体培养基和2号液体培养基中采取隔代交替继代培养，即可长期继代保持刺葡萄悬浮细胞系；
12.所述1号液体培养基为ms基本培养基附加1.0mg/l2,4
‑
d、30g/l蔗糖的培养基，ph调整至6.0；所述2号液体培养基为ms基本培养基附加附加1.0mg/l2,4
‑
d、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖的培养基，ph调整至6.0。
13.进一步地，当步骤(2)进行促发培养时，需间隔快速振摇，即接种后的刺葡萄细胞悬浮液，每隔6～8个小时，将培养瓶从摇床取出，用手快速摇动，将沾粘在瓶壁上的细胞洗涤入液体培养基，每天重复该操作3～4次，如此反复，直至悬浮促发的完成。
14.进一步地，所述步骤(3)的具体操作如下：从摇床中取出培养瓶至超净工作台中，用手快速摇匀，利用灭菌的移液器移取种子细胞悬浮液，转入8倍体积的新鲜的液体培养基中进行培养，期间确保较大的细胞团不被转移；悬浮细胞经4天培养进入对数生长期，培养至10天进入对数生长期中期，此时悬浮细胞分散、细胞小且呈圆形、细胞质浓密、细胞生长旺盛，即为刺葡萄细胞悬浮液种子细胞；如此重复培养4～5代，即可获得细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞。
15.进一步地，所述步骤(6)中对数细胞隔代交替继代培养方式如下：将处于对数生长期中期的刺葡萄悬浮细胞，按悬浮细胞液体积：新鲜的液体培养基体积＝1:8的比例，接种到1号液体培养基中继代培养2～3代，然后转入2号液体培养基中继代培养1代，如此返复，即可长期继代保持刺葡萄悬浮细胞系。
16.进一步地，步骤(1)所述固体培养基为ms基本培养基附加1.0mg/l2,4
‑
d、30g/l蔗糖、6.0g/l琼脂粉的培养基，ph调整至6.0；
17.所述液体培养基为ms基本培养基附加1.0mg/l2,4
‑
d、30g/l蔗糖的培养基，ph调整至6.0。
18.本发明具有如下优点：
19.1.刺葡萄悬浮细胞生产花青素周期短、生长迅速、花青素产量高，培养20天的生物量是起始接种量的9.56倍，细胞花青素含量可达146.62μg/g(fw)；2、建立的悬浮细胞系在长期(培养70代)生产原花青素等生物活性物质较为稳定；3、无时间限制，可进行周年不间断生产；4、刺葡萄悬浮细胞系增殖效率高，可实现指数级增殖，可在生物发酵罐中进行规模化工厂化生产天然花青素。
【具体实施方式】
20.下面将结具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的
条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
21.一、刺葡萄愈伤组织细胞系的选取与处理
22.1、刺葡萄悬浮细胞系的建立是以长期继代保持的紫红色刺葡萄愈伤组织为材料。
23.2、在超净工作台中，挑选紫红色均匀的、生长状态一致且旺盛生长的刺葡萄愈伤组织，于同一继代固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养。
24.3、在进行刺葡萄愈伤组织对数细胞同步增殖培养时，继代接种愈伤组织所培养天数设3个时间，分别为15天、18天和20天。不同继代时间的试验结果表明，以15天为继代周期，刺葡萄愈伤组织处于缓慢生长期后期，此时愈伤组织生物量小，细胞较脆弱，镊子的外力夹取，细胞容易受伤而褐变，影响后期的培养；以18天为继代周期，刺葡萄愈伤组织进入快速生长的对数生长期起始阶段，此时细胞生长同步化较好，细胞生长旺盛；以20天为继代周期，此时细胞生长处于对数生长期阶段，此时细胞生长旺盛，但细胞同步化程度下降，不利于后续悬浮细胞系的建立。以上的试验结果说明，在进行刺葡萄愈伤组织同步化增殖培养时，以继代培养18天的愈伤组织为最佳。
25.4、按上述的方法，以18天为继代周期，在固体培养基中进行对数细胞同步增殖培养3代，可使刺葡萄愈伤组织生长状态达到高度同步化，培养获得的刺葡萄愈伤组织团呈现松散、紫红色均匀、绝大部分细胞呈圆形。
26.5、试验所用的固体培养基为ms基本培养基附加1.0mg/l 2,4
‑
d、30g/l蔗糖、6.0g/l琼脂粉的培养基，ph调整至6.0左右。
27.二、刺葡萄悬浮细胞培养的启动与促发
28.1、在固体培养基上将进行对数细胞同步增殖培养的第3代刺葡萄愈伤组织培养至18天。
29.2、在超净工作台中，用镊子夹取紫红色均匀的愈伤组织分别接入装有40ml液体培养基的150ml三角瓶中。愈伤组织接种量设3个梯度，分别为1团(2～2.5g)、2团(4～5g)和3团(6～7.5g)。
30.3、用镊子轻轻夹散愈伤组织团，然后迅速将三角瓶置于摇床中，振荡培养。
31.4、不同接种量对刺葡萄悬浮细胞培养启动影响的试验表明，采用1团愈伤组织的接种量，很难在短时间内使细胞悬浮液达到所需要的细胞生物量，不利于悬浮细胞系的启动；采用3团以上愈伤组织的接种量，培养的悬浮细胞增殖速度很快，短时间内消耗大量养分，且愈伤组织容易团块化，不利于愈伤组织团分散，很难产生细胞高度分散的悬浮细胞系；采用2团愈伤组织的接种量，在较短时间内就能获得分散度高的刺葡萄悬浮细胞系。因此，在进行刺葡萄愈伤组织启动和促发培养时，细胞接种量以2团(4～5g)为宜。
32.5、促发培养时，需间隔快速振摇，使刺葡萄愈伤组织能在较短时间内产生足够数量的分散性好的悬浮细胞系。间隔快速振摇是促发悬浮培养的关键，具体做法：接种后的刺葡萄细胞悬浮液，每隔6～8个小时，将培养瓶从摇床取出，用手快速摇动，将沾粘在瓶壁上的细胞洗涤入液体培养基，每天重复该操作3～4次，如此反复，直至悬浮促发的完成。如此，可在较短时间内就能获得分散度高的刺葡萄悬浮细胞系。
33.6、试验所用的液体培养基为ms基本培养基附加1.0mg/l 2,4
‑
d、30g/l蔗糖的培养基，ph调整至6.0左右。培养条件为，于25℃，光照强度2000～3000lux，光照时间12h/d的条件下，摇床转速120rpm，培养10天。
34.三、细胞悬浮培养的建立
35.1、取经悬浮促发培养，获得的分散性较好的刺葡萄悬浮细胞系，接种到新的液体培养基中培养10天，获得细胞悬浮液种子细胞。
36.2、从摇床中取出培养瓶至超净工作台中，用手快速摇匀，利用灭菌的移液器移取10ml种子细胞悬浮液，转入新的液体培养基中进行培养，期间确保较大的细胞团不被转移。
37.3、如此重复培养4～5代，即可获得细胞高度分散、生长状态一致、紫红色均匀的刺葡萄悬浮培养细胞。该悬浮细胞经4天培养即可进入对数生长期；10天处于对数生长期中期，此时悬浮细胞分散、细胞小且呈圆形、细胞质浓密、细胞生长旺盛；20天后进入生长稳定期。在进行悬浮细胞继代时，以选择培养10天的悬浮细胞为最佳。
38.4、悬浮细胞生长量测定：取来源相同混匀的5ml细胞悬浮液转入150ml三角瓶盛40ml液体培养基中，在上述培养条件下进行培养。每隔2天取样一次，每次取样3瓶，取样至20天。分别将取样细胞真空抽滤，用重蒸水冲洗3次，洗去残留的培养基，抽滤后称量得到细胞鲜重。根据实验数据绘制细胞鲜重生长曲线，培养20天的悬浮细胞生长呈s型，0～4天为生长延滞期，4～20天为对数生长期，20天后进入生长稳定期。
39.四、悬浮细胞继代增殖培养
40.1、将获得的刺葡萄悬浮细胞，每隔10天按细胞悬浮培养建立的接种方式，即可进行增殖培养。
41.2、指数级增殖：母瓶刺葡萄细胞悬浮液平均分装至新鲜培养基中，1瓶刺葡萄悬浮细胞母液可以分装成4瓶，按4
n
进行指数级继代增殖，例如增殖10代，理论上可达4
10
＝1048576瓶，增殖效果巨大。
42.3、增殖效果：每瓶细胞悬浮液按40ml计算，培养10代的刺葡萄细胞产量为1048576瓶
×
40ml/瓶＝41943040ml，即可产生41943.04l刺葡萄悬浮细胞液，增殖效果巨大。
43.4、若采用生物发酵罐进行规模化培养，增殖效果将进一步增大。
44.5、与刺葡萄活体材料相比，刺葡萄从萌芽开始至果实成熟需180天左右，且一年仅一季，而刺葡萄悬浮细胞继代增殖的周期只需要10天(继代增殖是10天进行一次，花青素生产是培养20天)，生长时间仅为活体植株果实生长的1/18，极大的缩短了培养时间，并且可进行周年培养。
45.五、悬浮细胞延时培养与花青素生产
46.1、延时培养：将增殖后的悬浮细胞不进行继代增殖，而是继续培养至20天，达到悬浮细胞生长的稳定期，此时，悬浮细胞生长量已基本上达到最大，若继续培养，细胞将会因为培养基养分的大量消耗和细胞本身代谢积累的有害物质而会迅速老化，不利于花青素的生产。
47.2、花青素生产：培养20天的悬浮细胞呈现较大、有部分分化的细胞、液泡大，同时细胞的生物量最大，刺葡萄细胞悬浮液平均每毫升含刺葡萄细胞0.153g，是起始悬浮细胞液重量(0.016g)的9.56倍左右。
48.3、刺葡萄悬浮细胞花青素检测：培养20天的刺葡萄细胞，经检测花青素含量达到146.62μg/g(fw)，可见刺葡萄悬浮细胞生产花青素的潜能巨大。
49.六、刺葡萄悬浮细胞系的长期保持
50.1、取刺葡萄种子悬浮细胞(处于对数生长初始期的悬浮细胞)，分别采用单一培养
基、两种培养基交替、两种培养基隔代交替连续继代保持。结果表明，刺葡萄悬浮细胞在单一培养基中连续继代保持18代以上，细胞的变异增多，花青素变异系数c.v为17.9％，大于15％，产花青素的能力会下降，必须重新获取种子悬浮细胞；刺葡萄悬浮细胞在两种培养基中交替继代保持，细胞连续继代保持30代，细胞的变异也随之增加，花青素变异系数c.v为18.3％，大于15％，花青素产量下降，必须重新获取种子悬浮细胞；而采用两种培养基隔代交替继代保持，悬浮细胞培养70代后，变异细胞才逐渐增多，花青素变异系数c.v为20.6％，大于15％，花青素产量下降。试验表明，要在液体培养基中较长时间继代保持刺葡萄种子悬浮细胞系，以采用两种培养基隔代交替继代为最佳。
51.2、两种培养基隔代交替连续保持的方式：将处于对数生长起始阶段的刺葡萄悬浮细胞，在1号培养基中继代培养2～3代，然后转入2号培养基中继代培养1代，如此返复，即可长期继代保持刺葡萄悬浮细胞系。
52.3、试验所用的培养基为：1号液体培养基ms基本培养基附加1.0mg/l2,4
‑
d、30g/l蔗糖的培养基，ph调整至6.0左右；2号培养基为ms基本培养基附加1.0mg/l2,4
‑
d、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖的培养基，ph调整至6.0左右。
53.综上，1.本发明步骤(1)采用对数细胞同步增殖培养方式，将刺葡萄愈伤组织原有的常规继代时间20天，缩短为18天，即将刺葡萄愈伤组织接种后培养至18天，固体培养基中培养18天时刺葡萄愈伤组织细胞生长正处于对数生长起始阶段，细胞生长同步化高，取适量的愈伤组织接种到新鲜的ms固体培养基中，能使刺葡萄愈伤组织细胞在较短的时间内进入高度的生长同步化，有利于刺葡萄细胞悬浮培养的启动和悬浮细胞系的建立；步骤(2)所述的间隔快速振摇，是促发悬浮培养的关键，可使刺葡萄愈伤组织能在较短时间内产生足够数量的分散性好的悬浮细胞系。
54.2.本发明的刺葡萄细胞悬浮培养体系，具有细胞形状及细胞团大小一致；细胞分散性好；生长迅速；重复性好；易于控制等优点。
55.3.与刺葡萄活体材料相比，刺葡萄从萌芽开始至果实成熟需180天左右，且一年仅一季，而刺葡萄悬浮细胞从接种到细胞生长稳定期只要20天左右，生长时间仅为活体植株果实生长的1/9，并且可进行周年培养；同时，刺葡萄果实中的花青素存在于果皮中，在现实中很难分离，而刺葡萄细胞培养本身就能生产花青素，不存在不同组织材料分离的情况，花青素提取十分方便。
56.4.通过本发明刺葡萄紫红色细胞悬浮培养可以短时、高效的获得大量的花青素等天然活性物质；该悬浮细胞系培养20天就能产生大量的花青素。本发明能够为工厂化快速生产花青素等葡萄天然活性物质提供一个新的途径。
57.虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。