用于调节τ蛋白表达的组合物的制作方法

用于调节
τ
蛋白表达的组合物
1.本技术是申请号为201480040726.6、申请日为2014年7月21日、发明名称为“用于调节τ蛋白表达的组合物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为pct/us2014/047486的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2013年7月19日、申请号为61/856,551的美国申请，申请日为2013年9月18日、申请号为61/879,621的美国申请，申请日为2013年10月1日、申请号为61/885,371的美国申请，申请日为2014年6月19日、申请号为62/014,486的美国申请的优先权。
2.序列表
3.本技术正连同呈电子格式的序列表一起申请。序列表是提供为2014年7月17日建立的大小为916kb的题为biol0227woseq_st 25.txt的文档。电子格式的序列表中的信息以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
4.提供用于降低τ蛋白mrna和蛋白质在动物中的表达的组合物和方法。此种方法适用于通过抑制τ蛋白在动物中的表达来治疗、预防或改善神经退化性疾病，包括τ蛋白病变、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease)、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫和dravet综合征(dravet’s syndrome)。
5.τ蛋白的主要功能在于结合且稳定化作为有丝分裂、胞质分裂和囊泡转运中涉及的重要细胞骨架结构组分的微管。τ蛋白见于多种组织中，但在神经元的轴索中特别丰富。在人类中，存在六种通过替代性拼接外显子2、3和10产生的τ蛋白同源异构体。在蛋白质的n末端处拼接外显子2和3导致包括0、1或2个含29个氨基酸的酸性域，并且分别称为0n、1n或2nτ蛋白。这些域对τ蛋白功能的影响并不完全明确，但可在与质膜的相互作用中起作用。在c末端处包括外显子10导致包括由外显子10编码的微管结合域。因为在τ蛋白中其他地方存在3个微管结合域，所以此τ蛋白同源异构体(包括有外显子10)称为4rτ蛋白，其中
‘
r’是指微管结合域的重复序列的数目。无外显子10的τ蛋白称为3rτ蛋白。因为更多微管结合域(4r相较于3r)会增加与微管的结合，所以4rτ蛋白假定会显著增加微管结合和装配。3r/4rτ蛋白的比率受发育调控，其中胎儿组织仅表达3rτ蛋白且成年人类组织表达近似相等含量的3r/4rτ蛋白。偏离3r/4rτ蛋白的正常比率为神经退化性ftdτ蛋白病变的特征。未知的是在成年动物中随后阶段改变3r/4rτ蛋白比率将如何影响τ蛋白发病机制。
6.丝氨酸
‑
苏氨酸指导的磷酸化调控τ蛋白的微管结合能力。过度磷酸化促进τ蛋白自微管脱离。已描述τ蛋白的其他转译后修饰；然而，这些修饰的意义为不明确的。τ蛋白的磷酸化也受发育调控，其中胎儿组织中的磷酸化较高且成人中的磷酸化低得多。神经退化性病症的一个特征为τ蛋白磷酸化异常增加。
7.微管网络涉及在细胞内为维持细胞的形态和操作转运机构所需的许多重要过程(包括结构完整性)中。因为τ蛋白结合微管会使微管稳定，所以τ蛋白可能为一些这些过程的关键介体并且破坏神经退化性疾病中的正常τ蛋白可破坏一些这些关键细胞过程。
8.τ蛋白可在神经退化性综合征中重要的一个早期指示为认识到τ蛋白为阿尔茨海默病中的神经纤维内含物的关键组分。实际上，神经纤维内含物为过度磷酸化τ蛋白的聚集体。连同含有β淀粉状蛋白的斑块一起，神经纤维内含物为阿尔茨海默病的标志且与认知损害显著相关。ad中的95％τ蛋白累积物见于神经元过程中且称为神经炎性营养不良。此微管相关蛋白质变得自微管脱离且形成蛋白质的累积物所凭借的过程以及此如何与神经元毒性相关并未被充分了解。
9.神经元τ蛋白内含物不仅为阿尔茨海默病，而且也是额颞叶痴呆(ftd)、psp和cbd的子组的病理学特征。τ蛋白与神经退化之间的关联是通过发现τ蛋白基因的突变会引起ftd的子组而得以巩固。这些遗传数据也已强调τ蛋白的3r:4r比率的重要性。引起ftd的许多τ蛋白突变导致τ蛋白拼接变化，其导致优先包括外显子10，并且因此导致4rτ蛋白增加。总体τ蛋白含量为正常的。τ蛋白同源异构体变化或氨基酸变化或两者变化是否导致神经退化仍然未知。最新数据表明psp也可与4r:3rτ蛋白比率增加相关。
10.为帮助了解τ蛋白比率对神经退化的影响，已使用包括τ蛋白启动子和外显子10的侧接内含子序列的袖珍基因产生基于一个拼接τ蛋白突变(n279k)的小鼠模型。如同在人类中一样，相较于表达wtτ蛋白的转基因，此等小鼠显示4rτ蛋白的含量增加，并且发展行为和运动异常以及聚集τ蛋白在脑和脊髓中累积。
11.蛋白质“τ蛋白”已与多种脑疾病相关联，这些疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、进行性核上麻痹、皮质基底神经节退化、拳击手型痴呆、与染色体相关联的帕金森氏症(parkinsonism)、lytico
‑
bodig病(lytico
‑
bodig disease)、缠结占优性痴呆(tangle
‑
predominant dementia)、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性泛脑炎、铅毒脑病、结节性硬化、哈勒沃登
‑
施帕茨病(hallervorden
‑
spatz disease)、皮克氏病(pick's disease)、嗜银颗粒疾病(argyrophilic grain disease)、皮质基底退化或额颞叶退化以及其他疾病。诸如ad的τ蛋白相关病症为老年人中最常见痴呆病因。ad影响全世界估计1500万人并且群体的40％超过85岁。ad的特征在于两种病理学标志：τ蛋白神经纤维内含物(nft)和β淀粉状蛋白(aβ)斑块。
12.当前缺乏可接受的用于治疗此种神经退化性疾病的选项。因此，本文的一个目标在于提供用于治疗此种疾病的方法。
13.发明概述
14.本文提供用于调节τ蛋白mrna和蛋白质表达的方法、化合物和组合物。在某些实施例中，可用于调节τ蛋白mrna和蛋白质表达的化合物为反义化合物。在某些实施例中，反义化合物为反义寡核苷酸。
15.在某些实施例中，可在细胞或组织中进行调节。在某些实施例中，细胞或组织处于动物体内。在某些实施例中，动物为人类。在某些实施例中，降低τ蛋白mrna含量。在某些实施例中，降低τ蛋白含量。这种降低可以时间依赖性方式或以剂量依赖性方式出现。
16.还提供可用于预防、治疗和改善疾病、病症和病状的方法、化合物和组合物。在某些实施例中，这种τ蛋白相关疾病、病症和病状为神经退化性疾病。在某些实施例中，这种神经退化性疾病、病症和病状包括τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫和dravet综合征。
17.这种疾病、病症和病状可共同具有一个或多个风险因素、病因或结果。发展神经退化性病症的某些风险因素和病因包括变老、具有个人或家族史、或遗传倾向性。与发展神经退化性病症相关的某些症状和结果包括但不限于：存在过度磷酸化τ蛋白、存在神经纤维内含物、神经功能降低、记忆力降低、运动功能降低、运动协调降低和错乱。
18.在某些实施例中，治疗方法包括向有需要的个体施用τ蛋白反义化合物。在某些实施例中，治疗方法包括向有需要的个体施用τ蛋白反义寡核苷酸。
19.本公开内容提供以下非限制性编号的实施方案：
20.实施方案1：一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有包含核碱基序列seq id no:20
‑
2443和seq id no:2478
‑
2483中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
21.实施方案2：一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有包含核碱基序列seq id no:2444
‑
2477和seq id no:2484
‑
2565中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
22.实施方案3：一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有包含核碱基序列seq id no:20
‑
2565中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
23.实施方案4：一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135980的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
24.实施方案5：一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135853
‑
135872的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
25.实施方案6：一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135929的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
26.实施方案7：一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135914的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
27.实施方案8：如实施方案4
‑
7所述的化合物，其中经修饰寡核苷酸的核碱基序列与seq id no:1至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
28.实施方案9：如任何先前实施方案所述的化合物，其由单股经修饰寡核苷酸组成。
29.实施方案10：如任何先前实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键为经修饰核苷间键。
30.实施方案11：如实施方案10所述的化合物，其中至少一个经修饰核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
31.实施方案12：如实施方案10所述的化合物，其中每个经修饰核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
32.实施方案13：如任何先前实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
33.实施方案14：如任何先前实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键为硫代磷酸酯键且至少一个核苷间键为磷酸二酯键。
34.实施方案15：如任何先前实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷包含经修饰的核碱基。
35.实施方案16：如实施方案15所述的化合物，其中经修饰的核碱基为5
‑
甲基胞嘧啶。
36.实施方案17：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸中至少一个核苷包含经修饰的糖。
37.实施方案18：如实施方案17所述的化合物，其中至少一个经修饰的糖为双环糖。
38.实施方案19：如实施方案18所述的化合物，其中双环糖在所述糖的2’位与4’位之间包含化学键4
’‑
ch2
‑
n(r)
‑
o
‑2’
桥，其中r独立地为h、c1
‑
c12烷基或保护基。
39.实施方案20：如实施方案18所述的化合物，其中双环糖包含4
’‑
ch2
‑
n(r)
‑
o
‑2’
桥，其中r独立地为h、c1
‑
c12烷基或保护基。
40.实施方案21：如实施方案17所述的化合物，其中至少一个经修饰的糖包含2
’‑
o
‑
甲氧基乙基。
41.实施方案22：如实施方案17所述的化合物，其中经修饰的糖包含2
’‑
o(ch2)2‑
och3基团。
42.实施方案23：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸包含：
43.由10个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
44.由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
45.由5个连接的核苷组成的3’翼段；
46.其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
47.实施方案24：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸包含：
48.由9个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
49.由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
50.由5个连接的核苷组成的3’翼段；
51.其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
52.实施方案25：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸包含：
53.由7个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
54.由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
55.由6个连接的核苷组成的3’翼段；
56.其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
57.实施方案26：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸包含：
58.由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
59.由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
60.由5个连接的核苷组成的3’翼段；
61.其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
62.实施方案27：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸包含：
63.由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
64.由4个连接的核苷组成的5’翼段；和
65.由6个连接的核苷组成的3’翼段；
66.其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
67.实施方案28：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸包含：
68.由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
69.由6个连接的核苷组成的5’翼段；和
70.由4个连接的核苷组成的3’翼段；
71.其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
72.实施方案29：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
73.实施方案30：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。
74.实施方案31：如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
75.实施方案32：一种组合物，其包含如任何先前实施方案所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂中至少一种。
76.实施方案33：一种方法，其包括向动物施用如任何先前实施方案所述的化合物或组合物。
77.实施方案34：如实施方案33所述的方法，其中动物为人类。
78.实施方案35：如实施方案33所述的方法，其中施用化合物预防、治疗、改善τ蛋白相关疾病、病症或病状或减缓其进展。
79.实施方案36：如实施方案35所述的方法，其中疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
80.实施方案37：如任何先前实施方案所述的化合物或组合物的用途，其是用于制造
用于治疗神经退化性病症的药剂。
81.实施方案38：一种化合物，其由isis 613099组成。
82.实施方案39：一种化合物，其由isis 613361组成。
83.实施方案40：一种化合物，其由isis 613370组成。
84.实施方案41：一种化合物，其由isis 623782组成。
85.实施方案42：一种化合物，其由isis 623996组成。
86.实施方案43：一种组合物，其包含如实施方案38
‑
42中任一项所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂中至少一种。
87.实施方案44：一种方法，其包括向动物施用如实施方案38
‑
43中任一项所述的化合物或组合物。
88.实施方案45：如实施方案44所述的方法，其中动物为人类。
89.实施方案46：如实施方案44所述的方法，其中施用化合物预防、治疗、改善τ蛋白相关疾病、病症或病状或减缓其进展。
90.实施方案47：如实施方案46所述的方法，其中疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
91.实施方案48：如实施方案38
‑
43中任一项所述的化合物或组合物的用途，其是用于制造用于治疗神经退化性病症的药剂。
92.详述
93.应了解，以上一般描述和以下详细描述仅具有例示性和说明性而不限制如所主张的本发明。在本文中，除非另外特定说明，否则单数的使用包括复数。除非另外陈述，否则如本文所用“或”的使用意指“和/或”。另外，除非另外陈述，否则如本文所用，使用“和”意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式，诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不具有限制性。并且，除非另外特定说明，否则诸如“组件”或“组件”的术语涵盖包含一个单元的组件和组件以及包含超过一个次单元的组件和组件。
94.本文所用的章节标题仅用于组织目的而不视为限制所述标的物。本公开中引用的所有文件或文件的部分(包括但不限于专利、专利申请案、公开专利申请案、文章、书籍、专著和genbank登录号以及可经由数据库(诸如国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi))获得的相关序列信息)和在本文中在整篇公开中提及的其他数据皆据此关于本文论述的文件部分明确地以引用的方式并入本文中以及以全文引用的方式并入本文中。
95.定义
96.除非提供特定定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和医药化学所用的命名和本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和医药化学的程序和技术为此项技术中熟知且常用的那些。可使用标准技术进行化学合成和化学分析。
97.除非另外指示，否则以下术语具有以下含义：
[0098]“2
’‑
o
‑
甲氧基乙基”(也为2
’‑
moe和2
’‑
och2ch2‑
och3和moe)是指呋喃糖环的2’位的o
‑
甲氧基
‑
乙基修饰。2
’‑
o
‑
甲氧基乙基修饰的糖为经修饰的糖。
[0099]“2
’‑
moe核苷”(也为2
’‑
o
‑
甲氧基乙基核苷)意指包含2
’‑
moe修饰的糖部分的核
苷。
[0100]“2’位上经取代的核苷”意指在呋喃糖基环的2’位上包含除h或oh以外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2’位上经取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。
[0101]“5
‑
甲基胞嘧啶”意指经连接至5位的甲基修饰的胞嘧啶。5
‑
甲基胞嘧啶为经修饰的核碱基。
[0102]“约”意指在值
±
7％范围内。例如，若说明“化合物将τ蛋白抑制至少约70％”，则表示63％至77％范围内的τ蛋白含量得到抑制。
[0103]“相伴施用”是指两种医药药剂以其两者的药理学作用在患者体内同时表达的任何方式共同施用。相伴施用不需要两种医药药剂于单一医药组合物中、以相同剂型或通过相同给药途径施用。两种医药药剂的作用本身无需同时表达。所述作用仅需重叠一段时间而无需共同延长。
[0104]“施用”意指向动物提供医药药剂，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自行施用。
[0105]“改善”是指减轻、减缓、终止或逆转病状或疾病严重性的至少一种指标。指标的严重性可通过熟知此项的技术人员已知的主观或客观测量来确定。
[0106]“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人类灵长类动物，包括但不限于猴和黑猩猩。
[0107]“抗体”是指特征在于与抗原以一些方式特异性反应的分子，其中抗体与抗原各自利用另一者来定义。抗体可指完全抗体分子或其任何片段或区域，诸如重链、轻链、fab区和fc区。
[0108]“反义活性”意指可归于反义化合物与其目标核酸杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为目标核酸或由目标核酸编码的蛋白质的量或表达减少。
[0109]“反义化合物”意指能够与目标核酸经由氢键键合进行杂交的寡聚化合物。反义化合物的实例包括单股和双股化合物，诸如反义寡核苷酸、sirna、shrna、ssrna和基于占位的化合物。
[0110]“反义抑制”意指在与目标核酸互补的反义化合物存在下目标核酸含量相较于在不存在反义化合物下的目标核酸含量有所减少。
[0111]“反义机制”为所有涉及化合物与目标核酸杂交的机制，其中杂交的结果或效应为标靶降解或标靶占有，伴随阻碍涉及例如转录或剪接的细胞机构。
[0112]“反义寡核苷酸”意指具有允许与目标核酸的相应区段杂交的核碱基序列的单股寡核苷酸。
[0113]“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核碱基与目标核酸中的相应核碱基进行准确碱基配对(即杂交)的能力，并且由相应核碱基的间的沃森
‑
克里克(watson
‑
crick)、霍氏(hoogsteen)或反霍氏氢键结合介导。
[0114]“双环糖”意指由两个原子桥连修饰的呋喃糖环。双环糖为经修饰的糖。
[0115]“双环核苷”(也称为bna)意指具有包含连接糖环的两个碳原子的桥，由此形成双环系统的糖部分的核苷。在某些实施方案中，桥连接糖环的4
’‑
碳和2
’‑
碳。
[0116]“帽结构”或“末端帽部分”意指已并入于反义化合物任一末端处的化学修饰。
[0117]“cet”或“限制性乙基”意指具有包含连接4
’‑
碳和2
’‑
碳的桥的糖部分的双环核苷，其中桥具有下式：4
’‑
ch(ch3)
‑
o
‑2’
。
[0118]“限制性乙基核苷”(也为cet核苷)意指包含含4
’‑
ch(ch3)
‑
o
‑2’
桥的双环糖部分的核苷。
[0119]“化学相异区”是指反义化合物中以某种方式在化学上不同于同一反义化合物的另一区的区域。例如，具有2
’‑
o
‑
甲氧基乙基核苷的区域在化学上与具有无2
’‑
o
‑
甲氧基乙基修饰的核苷的区域不同。
[0120]“嵌合反义化合物”意指具有至少2个化学相异区的反义化合物，每个位置具有多个次单元。
[0121]“共同施用”意指向个体使用两种或两种以上医药药剂。两种或两种以上医药药剂可在单个医药组合物中，或可在单独的医药组合物中。两种或两种以上医药药剂中每一个可经由相同或不同给药途径施用。共同施用涵盖同时或依序施用。
[0122]“互补性”意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。
[0123]“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为表示包括所述步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。
[0124]“连续核碱基”意谓彼此紧邻的核碱基。
[0125]“设计”或“经设计”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的寡聚化合物的方法。
[0126]“稀释剂”意指组合物中缺乏药理学活性，但为药学上必需或所需的成分。例如，在注射的药物中，稀释剂可为液体，例如盐水溶液。
[0127]“剂量”意指单次给药中或指定时段内提供的医药药剂的指定量。在某些实施方案中，可以一次、两次或两次以上快速浓注(bolus)、片剂或注射施用剂量。例如，在某些实施方案中，在需要皮下施用时，所需剂量需要不易由单次注射提供的体积，因此，可使用两次或两次以上注射来达成所需剂量。在某些实施方案中，医药药剂通过延长的时段或连续输注来施用。剂量可规定为每小时、每天、每周或每个月的医药药剂量。
[0128]“有效量”在调节活性或治疗或预防病状的上下文中意指向需要调节、治疗或防治的受试者以单次剂量或一系列剂量的一部分形式施用有效调节所述效应，或治疗或防治或改善病状的量的医药药剂。在个体中，有效量可视以下因素而变化：所治疗个体的健康和身体状况、所治疗个体的分类学群组、组合物的制剂、个体的医学病状的评估和其他相关因素。
[0129]“功效”意指产生所需作用的能力。
[0130]“表达”包括基因密码信息通过转化成细胞中存在且起作用的结构的所有功能。这种结构包括但不限于转录和转译的产物。
[0131]“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的每个核碱基在第二核酸中都具有互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸为反义化合物并且目标核酸为第二核酸。
[0132]“间隔体(gapmer)”意指具有多个有利于核糖核酸酶h裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中构成内部区域的核苷在化学上与构成外部区域的核苷不同。内部区域可称为“间隔区”且外部区域可称为“翼区”。
[0133]“间隔狭窄”意指嵌合反义化合物具有位于具有1至6个核苷的5’与3’翼段之间且紧密邻近于5’和3’翼段的具有9个或少于9个连续2
’‑
脱氧核糖核苷的间隔段。
[0134]“间隔加宽”意指嵌合反义化合物具有位于具有1至6个核苷的5’与3’翼段之间且紧密邻近于5’和3’翼段的具有12个或超过12个连续2
’‑
脱氧核糖核苷的间隔段。
[0135]“杂交”意指互补核酸分子粘接。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和标靶核酸。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸和核酸标靶。
[0136]“鉴定患有τ蛋白相关疾病的动物”意指鉴定已诊断有τ蛋白相关疾病或倾向于发展τ蛋白相关疾病的动物。倾向于发展τ蛋白相关疾病的个体包括具有发展τ蛋白相关疾病的一个或多个风险因素的个体，所述风险因素包括变老、具有个人或家族史、或一种或多种τ蛋白相关疾病的遗传倾向性。这种鉴定可通过任何方法，包括评估个体的医疗史以及标准临床测试或评估(诸如遗传测试)来达成。
[0137]“紧密邻近”意指紧邻组件之间不存在介入组件。
[0138]“个体”意指选用于治疗或疗法的人类或非人类动物。
[0139]“抑制τ蛋白”意指降低τ蛋白mrna和/或蛋白质的含量或表达。在某些实施方案中，相较于在不存在τ蛋白反义化合物(诸如反义寡核苷酸)下τ蛋白mrna和/或蛋白质的表达含量，τ蛋白mrna和/或蛋白质含量在靶向τ蛋白的反义化合物(包括靶向τ蛋白的反义寡核苷酸)存在下得到抑制。
[0140]“抑制表达或活性”是指降低或阻断表达或活性且未必指示完全消除表达或活性。
[0141]“核苷间键”是指核苷之间的化学键。
[0142]“连接的核苷”意指由核苷间键连接到一起的相邻核苷。
[0143]“锁核酸”或“lna”或“lna核苷”意指在核苷糖单元的4’位与2’位之间具有连接两个碳原子，从而形成双环糖的桥基的核酸单体。双环糖的实例包括但不限于a)α
‑
l
‑
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)lna；(b)β
‑
d
‑
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)lna；(c)亚乙基氧基(4
’‑
(ch2)2‑
o
‑2’
)lna；(d)氨基氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑
n(r)
‑2’
)lna；和(e)氧氨基(4
’‑
ch2‑
n(r)
‑
o
‑2’
)lna，如下文所描绘。
[0144][0145]
如本文所用的lna化合物包括但不限于在糖的4’位与2’位之间具有至少一个桥基的化合物，其中每个桥基独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的连接基团：
‑
[c(r1)(r2)]
n
‑
、
‑
c(r1)＝c(r2)
‑
、
‑
c(r1)＝n
‑
、
‑
c(＝nr1)
‑
、
‑
c(＝o)
‑
、
‑
c(＝s)
‑
、
‑
o
‑
、
‑
si(r1)2‑
、
‑
s(＝o)
x
‑
和
‑
n(r1)
‑
；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；每个r1和r2独立地为h、保护基、羟基、c1‑
c
12
烷基、取代的c1‑
c
12
烷基、c2‑
c
12
烯基、取代的c2‑
c
12
烯基、c2‑
c
12
炔基、取代的c2‑
c
12
炔基、c5‑
c
20
芳基、取代的c5‑
c
20
芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、c5‑
c7脂环基、取代的c5‑
c7脂环基、卤素、oj1、nj1j2、sj1、n3、cooj1、酰基(c(＝o)
‑
h)、取代的酰基、cn、磺酰基(s(＝o)2‑
j1)或亚磺酰基(s(＝o)
‑
j1)；并且每个j1和j2独立地为h、c1‑
c
12
烷基、取代的c1‑
c
12
烷基、c2‑
c
12
烯基、取代的c2‑
c
12
烯基、c2‑
c
12
炔基、取代的c2‑
c
12
炔基、c5‑
c
20
芳基、取代的c5‑
c
20
芳基、酰基(c(＝o)
‑
h)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、c1‑
c
12
氨基烷基、取代的
c1‑
c
12
氨基烷基或保护基。
[0146]
lna的定义内所涵盖的4
’‑2’
桥连基团的实例包括但不限于下式中的一者：
‑
[c(r1)(r2)]
n
‑
、
‑
[c(r1)(r2)]
n
‑
o
‑
、
‑
c(r1r2)
‑
n(r1)
‑
o
‑
或
–
c(r1r2)
‑
o
‑
n(r1)
‑
。此外，lna定义中所涵盖的其他桥连基团为4
’‑
ch2‑2’
、4
’‑
(ch2)2‑2’
、4
’‑
(ch2)3‑2’
、4
’‑
ch2‑
o
‑2’
、4
’‑
(ch2)2‑
o
‑2’
、4
’‑
ch2‑
o
‑
n(r1)
‑2’
和4
’‑
ch2‑
n(r1)
‑
o
‑2’‑
桥，其中每个r1和r2独立地为h、保护基或c1‑
c
12
烷基。
[0147]
根据本发明的lna的定义内也包括如下lna，其中核糖基糖环的2
’‑
羟基连接至糖环的4’碳原子，从而形成亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)桥而形成双环糖部分。桥基也可为连接2’氧原子与4’碳原子的亚甲基(
‑
ch2‑
)，对于其使用术语亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)lna。此外，在于此位置上具有亚乙基桥连基团的双环糖部分的情况下，使用术语亚乙基氧基(4
’‑
ch2ch2‑
o
‑2’
)lna。在如本文所用的lna的定义内也涵盖α
‑
l
‑
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)，其为亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)lna的异构体。
[0148]“失配”或“非互补核碱基”是指第一核酸的核碱基不能与第二或目标核酸的相应核碱基配对的情况。
[0149]“经修饰的核苷间键”是指与天然存在的核苷间键(即磷酸二酯核苷间键)相比存在取代或任何变化。
[0150]“经修饰核的碱基”意指任何除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶以外的核碱基。“未经修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。
[0151]“经修饰的核苷”意指独立地具有经修饰的糖部分和/或经修饰的核碱基的核苷。
[0152]“经修饰核苷酸”意指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷间键和/或经修饰的核碱基的核苷酸。
[0153]“经修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个经修饰的核苷间键、经修饰的糖和/或经修饰的核碱基的寡核苷酸。
[0154]“经修饰的糖”意指与天然糖部分相比存在取代和/或任何变化。
[0155]“单体”意指寡聚物的单个单元。单体包括但不限于天然存在或经修饰的核苷和核苷酸。
[0156]“基序”意指反义化合物中未经修饰的和经修饰的核苷的型态。
[0157]“天然糖部分”意指dna(2
’‑
h)或rna(2
’‑
oh)中存在的糖部分。
[0158]“天然存在的核苷间键”意指3’至5’磷酸二酯键。
[0159]“非互补核碱基”是指一对彼此不形成氢键或以其他方式有利于杂交的核碱基。
[0160]“核酸”是指由单体核苷酸构成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、单股核酸、双股核酸、小干扰核糖核酸(sirna)和微小rna(mirna)。
[0161]“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
[0162]“核碱基互补性”是指核碱基能够与另一核碱基进行碱基配对。例如，在dna中，腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)互补。例如，在rna中，腺嘌呤(a)与尿嘧啶(u)互补。在某些实施方案中，互补核碱基是指反义化合物中能够与其目标核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果反义化合物的某一位置上的核碱基能够与目标核酸的某一位置上的核碱基进行氢键键合，则在核碱基对处寡核苷酸与目标核酸之间的氢键键合位置视作具有互补性。
[0163]“核碱基序列”意指连续核碱基的次序，而与任何糖、键和/或核碱基修饰无关。
[0164]“核苷”意指核碱基连接至糖。
[0165]“核苷模拟物”包括用于在寡聚化合物的一个或多个位置上置换糖或糖和碱基且未必替换键的那些结构，诸如具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢哌喃基、双环或三环糖模拟物，例如非呋喃糖糖单元的核苷仿真物。核苷酸模拟物包括用于在寡聚化合物的一个或多个位置上置换核苷和键的那些结构，诸如像肽核酸或吗啉代(由
‑
n(h)
‑
c(＝o)
‑
o
‑
或其他非磷酸二酯键连接的吗啉代)。糖替代物与略微较广泛的术语核苷模拟物相一致，但仅意欲指示置换糖单元(呋喃糖环)。本文提供的四氢哌喃基环说明糖替代物的实例，其中呋喃糖糖基已被四氢哌喃基环系统置换。“模拟物”是指取代糖、核碱基和/或核苷间键的基团。一般而言，使用模拟物替代糖或糖
‑
核苷间键组合，并且维持核碱基以与所选标靶杂交。
[0166]“核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基的核苷。
[0167]“脱靶效应”是指与调节除预定目标核酸以外的基因的rna或蛋白表达有关的不必要或有害的生物效应。
[0168]“寡聚化合物”或“寡聚物”意指具有连接的单体次单元且能够与核酸分子的至少一个区域杂交的聚合物。
[0169]“寡核苷酸”意指具有各自可彼此独立地经修饰的或未经修饰的连接的核苷的聚合物。
[0170]“非经肠施用”意指通过注射(例如快速浓注)或输注施用。非经肠施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
[0171]“肽”意指由至少两个氨基酸由酰胺键连接而形成的分子。在无限制的情况下，如本文所用的肽是指多肽和蛋白质。
[0172]“医药药剂”意指当向个体施用时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向τ蛋白的反义寡核苷酸为医药药剂。
[0173]“药物组合物”意指适于向受试者施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含反义寡核苷酸和无菌水溶液。
[0174]“药学上可接受的衍生物”涵盖本文所述的化合物的药学上可接受的盐、结合物、前药或异构体。
[0175]“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理学上和药学上可接受的盐，即保持母体寡核苷酸的所需生物活性且不赋予其不合需要的毒理学作用的盐。
[0176]“硫代磷酸酯键”意指核苷之间的键，其中磷酸二酯键是通过一个非桥连氧原子经硫原子置换而修饰。硫代磷酸酯键为经修饰的核苷间键。
[0177]“部分”意指核酸中确定数目的连续(即连接)核碱基。在某些实施方案中，部分为目标核酸中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分为反义化合物中确定数目的连续核碱基。
[0178]“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指延迟或预先阻止疾病、病症或病状发作或产生达数分钟至数天，数周至数月，或无限期的时段。
[0179]“前药”意指以非活性形式制备且在身体或其细胞内在内源酶或其他化学物质和/或条件作用下转化成活性形式(即药物)的治疗剂。
[0180]“防治有效量”是指医药药剂向动物提供防治或预防效益的量。
[0181]“区”定义为目标核酸中具有至少一个可识别结构、功能或特征的部分。
[0182]“核糖核苷酸”意指在核苷酸的糖部分的2’位上具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可被任何多种取代基修饰。
[0183]“盐”意指反义化合物的生理学上和药学上可接受的盐，即保持母体寡核苷酸的所需生物活性且不赋予其不合需要的毒理学作用的盐。
[0184]“区段”定义为目标核酸内区的较小部分或子部分。
[0185]
本文所教导的反义寡核苷酸的“缩短”或“截短”型式有一个、两个或两个以上核苷缺失。
[0186]“副作用”意指除所需作用以外的可归因于治疗的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括不限于注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝中毒、肾中毒、中枢神经系统异常和肌病。
[0187]“单股寡核苷酸”意指未与互补股杂交的寡核苷酸。
[0188]
如本文所用的“位点”定义为目标核酸内的独特核碱基位置。
[0189]“减缓进展”意指减少疾病发展。
[0190]“可特异性杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸与目标核酸之间具有足够的互补度以在需要特异性结合的条件下，即在活体内分析和治疗性处理的状况下于生理条件下诱导所需作用，而对非目标核酸展现极小的影响或无影响。
[0191]“严格杂交条件”或“严格条件”是指寡聚化合物与其目标序列杂交，但与极少数目的其他序列杂交的条件。
[0192]“受试者”意指选用于治疗或疗法的人类或非人类动物。
[0193]“标靶”是指需要调节的蛋白质。
[0194]“目标基因”是指编码标靶的基因。
[0195]“靶向(targeting)”或“靶向(targeted)”意指设计和选择将与目标核酸特异性杂交且诱导所需作用的反义化合物的方法。
[0196]“目标核酸”、“目标rna”和“目标rna转录物”以及“核酸标靶”皆意指能够由反义化合物靶向的核酸。
[0197]“目标区”意指目标核酸中由一种或多种反义化合物所靶向的部分。
[0198]“目标段”意指目标核酸中由反义化合物所靶向的核苷酸序列。“5’目标位点”是指目标段的5’最末端核苷酸。“3’目标位点”是指目标段的3’最末端核苷酸。
[0199]“τ蛋白”意指哺乳动物微管相关蛋白质τ蛋白(mapt)，包括人类微管相关蛋白质τ蛋白(mapt)。
[0200]“τ蛋白相关疾病”意指与任何τ蛋白核酸或其表达产物相关的任何疾病。此种疾病可包括神经退化性疾病。这种神经退化性疾病可包括τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫和dravet综合征。
[0201]“τ蛋白mrna”意指编码τ蛋白的dna序列的任何信使rna表达产物。
[0202]“τ蛋白核酸”意指编码τ蛋白的任何核酸。例如，在某些实施方案中，τ蛋白核酸包括编码τ蛋白的dna序列、自编码τ蛋白的dna(包括包含内含子和外显子的基因组dna)转录
的rna序列、和编码τ蛋白的mrna序列。“τ蛋白mrna”意指编码τ蛋白的mrna。
[0203]“τ蛋白”意指τ蛋白核酸的多肽表达产物。
[0204]“治疗有效量”意指医药药剂向个体提供治疗效益的量。
[0205]“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指施用组合物以改变或改善疾病或病状。
[0206]“未经修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。
[0207]“未经修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间键构成的核苷酸。在某些实施方案中，未经修饰的核苷酸为rna核苷酸(即β
‑
d
‑
核糖核苷)或dna核苷酸(即β
‑
d
‑
脱氧核糖核苷)。
[0208]“翼段”意指多个经修饰的以赋予寡核苷酸以诸如抑制活性增强、对目标核酸的结合亲和力增强或对由活体内核酸酶引起的降解具有抗性的特性的核苷。
[0209]
某些实施方案
[0210]
某些实施方案提供用于抑制τ蛋白mrna和蛋白质表达的方法、化合物和组合物。某些实施方案提供用于降低τ蛋白mrna和蛋白质含量的方法、化合物和组合物。
[0211]
某些实施方案提供靶向τ蛋白核酸的反义化合物。在某些实施方案中，τ蛋白核酸为以下genbank登录号中所阐述的序列：genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短(作为seq id no:1并入本文中)；genbank登录号nm_001123066.3(作为seq id no:2并入本文中)；genbank登录号nm_016841.4，跳过外显子3、4、6、8、10和12的变异mrna序列(作为seq id no:3并入本文中)；genbank登录号nt_010783.14，自核苷酸2624000至2761000截短(作为seq id no:4并入本文中)；genbank登录号dr002467.1(作为seq id no:5并入本文中)；genbank登录号nm_001203251.1(作为seq id no:6并入本文中)；和genbank登录号nm_016835.4(作为seq id no:7并入本文中)。
[0212]
某些实施方案提供用于治疗、预防或改善有需要的个体的与τ蛋白相关的疾病、病症和病状的方法。还涵盖用于制备用于治疗、预防或改善与τ蛋白相关的疾病、病症或病状的药剂的方法。τ蛋白相关疾病、病症和病状包括神经退化性疾病。在某些实施方案中，τ蛋白相关疾病包括τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0213]
某些实施方案提供包含经修饰的寡核苷酸的化合物，经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含核碱基序列seq id no:20
‑
2443和seq id no:2478
‑
2483中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0214]
某些实施方案提供包含经修饰的寡核苷酸的化合物，经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含核碱基序列seq id no:2444
‑
2477和seq id no:2484
‑
2565中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0215]
某些实施方案提供包含经修饰的寡核苷酸的化合物，经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含核碱基序列seq id no:20
‑
2565中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20
个连续核碱基的核碱基序列。
[0216]
某些实施方案提供包含经修饰的寡核苷酸的化合物，经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135980的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0217]
某些实施方案提供包含经修饰的寡核苷酸的化合物，经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135853
‑
135872的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0218]
某些实施方案提供包含经修饰的寡核苷酸的化合物，经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135929的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0219]
某些实施方案提供包含经修饰的寡核苷酸的化合物，经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135914的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0220]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸的核碱基序列与seq id no:1至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
[0221]
在某些实施方案中，化合物为单股经修饰的寡核苷酸。
[0222]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸中至少一个核苷间键为经修饰的核苷间键。
[0223]
在某些实施方案中，至少一个经修饰的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
[0224]
在某些实施方案中，每个经修饰的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
[0225]
在某些实施方案中，至少一个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0226]
在某些实施方案中，至少一个核苷间键为硫代磷酸酯键并且至少一个核苷间键为磷酸二酯键。
[0227]
在某些实施方案中，至少一个核苷包含经修饰的核碱基。
[0228]
在某些实施方案中，经修饰的核碱基为5
‑
甲基胞嘧啶。
[0229]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸中至少一个核苷包含经修饰的糖。
[0230]
在某些实施方案中，至少一个经修饰的糖为双环糖。
[0231]
在某些实施方案中，双环糖在糖的2’位与4’位之间包含化学键4
’‑
ch2
‑
n(r)
‑
o
‑2’
桥，其中r独立地为h、c1
‑
c12烷基或保护基。
[0232]
在某些实施方案中，双环糖包含4
’‑
ch2
‑
n(r)
‑
o
‑2’
桥，其中r独立地为h、c1
‑
c12烷基或保护基。
[0233]
在某些实施方案中，至少一个经修饰的糖包含2
’‑
o
‑
甲氧基乙基。
[0234]
在某些实施方案中，经修饰的糖包含2
’‑
o(ch2)2‑
och3基团。
[0235]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：
[0236]
由10个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0237]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0238]
由5个连接的核苷组成的3’翼段；
[0239]
其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0240]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：
[0241]
由9个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0242]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0243]
由5个连接的核苷组成的3’翼段；
[0244]
其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0245]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：
[0246]
由7个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0247]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0248]
由6个连接的核苷组成的3’翼段；
[0249]
其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0250]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：
[0251]
由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0252]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0253]
由5个连接的核苷组成的3’翼段；
[0254]
其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0255]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：
[0256]
由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0257]
由4个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0258]
由6个连接的核苷组成的3’翼段；
[0259]
其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0260]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸包含：
[0261]
由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0262]
由6个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0263]
由4个连接的核苷组成的3’翼段；
[0264]
其中间隔段位于5’翼段与3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0265]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
[0266]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。
[0267]
在某些实施方案中，经修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
[0268]
某些实施方案提供包含本文所述的任何化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂中至少一种的组合物。
[0269]
某些实施方案提供包括向动物施用本文所述的任何化合物或组合物的方法。
[0270]
在某些实施例中，动物为人类。
[0271]
在某些实施方案中，施用化合物预防、治疗、改善τ蛋白相关疾病、病症或病状或减缓其进展。
[0272]
在某些实施方案中，疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0273]
某些实施方案提供本文所述的任何化合物或组合物用于制造用于治疗神经退化性病症的药剂的用途。
[0274]
某些实施方案提供根据下式(ia)的化合物：
[0275][0276]
或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，提供包含具有下式(ia)的化合物的药物组合物。
[0277]
某些实施方案提供根据下式(iia)的化合物：
[0278][0279]
或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，提供包含具有下式(iia)的化合物的药物组合物。
[0280]
某些实施方案提供根据下式(iiia)的化合物：
[0281][0282]
或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，提供包含具有下式(iiia)的化合物的药物组合物。
[0283]
某些实施方案提供根据下式(iva)的化合物：
[0284][0285]
或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，提供包含具有下式(iva)的化合物的药物组合物。
[0286]
某些实施方案提供根据下式(va)的化合物：
[0287][0288]
或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，提供包含具有下式(va)的化合物的药物组合物。
[0289]
反义化合物
[0290]
寡聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸和sirna。寡聚化合物相对于目标核酸可为“反义”，意指能够经由氢键合与目标核酸杂交。
[0291]
在某些实施方案中，反义化合物具有在按5’至3’方向书写时包含其所靶向的目标核酸的目标段的反向互补序列的核碱基序列。在某些这种实施方案中，反义寡核苷酸具有在按5’至3’方向书写时包含其所靶向的目标核酸的目标段的反向互补序列的核碱基序列。
[0292]
在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物的长度为12至30个次单元。在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物的长度为12至25个次单元。在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物的长度为12至22个次单元。在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物的长度为14至20个次单元。在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物的长度为15至25个次单元。在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物的长度为18至22个次单元。在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物的长度为19至21个次单元。在某些实施方案中，反义化合物的长度为8至80、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至30、18至50、19至30、19至50、或20至30个连接的次单元。
和bcl
‑
xl两者表达的能力。此外，此寡核苷酸展现有效的活体内抗肿瘤活性。
[0298]
maher和dolnick(nuc.acid.res.16:3341
‑
3358,1988)分别测试一系列具有14个核碱基的串联反义寡核苷酸以及包含所述串联反义寡核苷酸中的两者或三者的序列的具有28个和42个核碱基的反义寡核苷酸在家兔网状红血球分析中阻止人类dhfr转译的能力。3个具有14个核碱基的反义寡核苷酸各自单独能够抑制转译，但程度相较于具有28个或42个核碱基的反义寡核苷酸而言较适中。
[0299]
反义化合物基序
[0300]
在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物具有排列成一定型态或基序的经化学修饰的次单元，以赋予反义化合物以诸如抑制活性增强、对目标核酸的结合亲和力增强或对由活体内核酸酶引起的降解具有抗性的特性。
[0301]
嵌合反义化合物通常含有至少一个经修饰的以赋予增强的核酸酶降解抗性、增加的细胞吸收、增强的对目标核酸的结合亲和力和/或增强的抑制活性的区。嵌合反义化合物的第二区可任选地用作细胞核酸内切酶核糖核酸酶h的受质，所述酶裂解rna:dna双螺旋体的rna股。
[0302]
具有间隔体基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在间隔体中，具有多个有利于核糖核酸酶h裂解的核苷酸的内部区域位于具有多个在化学上与内部区域的核苷不同的核苷酸的外部区域之间。在具有间隔体基序的反义寡核苷酸的情况下，间隔段一般用作核酸内切酶裂解的受质，而翼段包含经修饰的核苷。在某些实施方案中，间隔体的区由构成各相异区的糖部分的类型来区分。用于区分间隔体的区的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β
‑
d
‑
核糖核苷、β
‑
d
‑
脱氧核糖核苷、2’位上经修饰的核苷(这种2’位上经修饰的核苷可尤其包括2
’‑
moe和2
’‑
o
‑
ch3)，以及双环糖修饰的核苷(这种双环糖修饰的核苷可包括具有4
’‑
(ch2)n
‑
o
‑2’
桥(其中n＝1或n＝2)和4
’‑
ch2‑
o
‑
ch2‑2’
的核苷)。在某些实施方案中，翼区可包括若干经修饰的糖部分，包括例如2
’‑
moe。在某些实施方案中，翼区可包括若干经修饰的和未经修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼区可包括2
’‑
moe核苷和2
’‑
脱氧核苷的各种组合。
[0303]
每个相异区可包含均一糖部分、变化或交替的糖部分。翼区
‑
间隔区
‑
翼区基序常描述为“x
‑
y
‑
z”，其中“x”表示5’翼区的长度，“y”表示间隔区的长度，且“z”表示3’翼区的长度。“x”和“z”可包含均一、变化或交替的糖部分。在某些实施方案中，“x”和“y”可包括一个或多个2
’‑
脱氧核苷。“y”可包含2
’‑
脱氧核苷。如本文所用的描述为“x
‑
y
‑
z”的间隔体具有一定构型以使间隔区经定位而与5’翼区和3’翼区中的每一者紧邻。因此，在5’翼区与间隔区之间，或间隔区与3’翼区之间不存在介入的核苷酸。本文所述的任何反义化合物可具有间隔体基序。在某些实施方案中，“x”与“z”相同；在其他实施方案中，它们不同。
[0304]
在某些实施方案中，本文提供的间隔体包括例如具有基序5
‑
10
‑
5的20聚体。
[0305]
在某些实施方案中，本文提供的间隔体包括例如具有基序5
‑9‑
5的19聚体。
[0306]
在某些实施方案中，本文提供的间隔体包括例如具有基序5
‑8‑
5的18聚体。
[0307]
在某些实施方案中，本文提供的间隔体包括例如具有基序4
‑8‑
6的18聚体。
[0308]
在某些实施方案中，本文提供的间隔体包括例如具有基序6
‑8‑
4的18聚体。
[0309]
在某些实施方案中，本文提供的间隔体包括例如具有基序5
‑7‑
6的18聚体。
[0310]
目标核酸、目标区和核苷酸序列
[0311]
编码τ蛋白的核苷酸序列包括不限于以下：genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短(作为seq id no:1并入本文中)；genbank登录号nm_001123066.3(作为seq id no:2并入本文中)；genbank登录号nm_016841.4，跳过外显子3、4、6、8、10和12的变异mrna序列(作为seq id no:3并入本文中)；genbank登录号nt_010783.14，自核苷酸2624000至2761000截短(作为seq id no:4并入本文中)；genbank登录号dr002467.1(作为seq id no:5并入本文中)；genbank登录号nm_001203251.1(作为seq id no:6并入本文中)；和genbank登录号nm_016835.4(作为seq id no:7并入本文中)。
[0312]
应了解，本文中所含的实例中的每个seq id no中所述的序列与糖部分、核苷间键或核碱基的任何修饰无关。因而，由seq id no定义的反义化合物可独立地包含糖部分、核苷间键或核碱基的一处或多处修饰。由isis编号(isis no)所述的反义化合物指示核碱基序列与基序的组合。
[0313]
在某些实施方案中，目标区为目标核酸的结构明确的区。例如，目标区可涵盖3’utr、5’utr、外显子、内含子、外显子/内含子接合点、编码区、转译起始区、转译终止区或其他明确的核酸区。τ蛋白的结构明确的区可由来自序列数据库(诸如ncbi)的登录号获得，并且这种信息以引用方式并入本文中。在某些实施方案中，目标区可涵盖自目标区内的一个目标段的5’目标位点至同一目标区内的另一目标段的3’目标位点的序列。
[0314]
靶向包括确定至少一个与反义化合物杂交，从而出现所需作用的目标段。在某些实施方案中，所需作用为mrna目标核酸含量降低。在某些实施方案中，所需作用为通过目标核酸编码的蛋白质含量降低或与目标核酸有关的表型改变。
[0315]
目标区可含有一个或多个目标段。目标区内的多个目标段可重叠。或者，它们可不相重叠。在某些实施方案中，目标区内的目标段相隔至多约300个核苷酸。在某些实施方案中，目标区内的目标段相隔目标核酸上一定数目的核苷酸，数目为、为约、为至多、为至多约250个、200个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个或10个核苷酸，或为由前述任何两个值所界定的范围。在某些实施方案中，目标区内的目标段相隔目标核酸上至多或至多约5个核苷酸。在某些实施方案中，目标段为连续的。涵盖由具有为本文所列的5’目标位点或3’目标位点中任一者的起始核酸的范围所界定的目标区。
[0316]
合适的目标段可存在于5’utr、编码区、3’utr、内含子、外显子或外显子/内含子接合点内。含有起始密码子或终止密码子的目标段也是合适的目标段。合适的目标段可尤其排除某一结构明确的区，诸如起始密码子或终止密码子。
[0317]
确定合适的目标段可包括将目标核酸的序列与整个基因组中的其他序列比较。例如，可使用blast算法来识别不同核酸当中具有相似性的区域。此比较可防止选择可能以非特异性方式与除所选目标核酸以外的序列(即非目标或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
[0318]
反义化合物在活性目标区内的活性(例如如由目标核酸含量降低百分比所定义)可能不同。在某些实施方案中，τ蛋白mrna含量降低可指示对τ蛋白表达的抑制作用。τ蛋白含量降低也可指示对目标mrna表达的抑制作用。过度磷酸化τ蛋白阳性染色细胞的百分比的降低指示对τ蛋白表达的抑制作用。此外，表型变化指示对τ蛋白表达的抑制作用。神经功能改进指示对τ蛋白表达的抑制作用。记忆和运动功能改进指示对τ蛋白表达的抑制作用。神经纤维内含物的降低指示对τ蛋白表达的抑制作用。
[0319]
杂交
[0320]
在一些实施方案中，本文公开的反义化合物与τ蛋白核酸之间发生杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键键合(例如沃森
‑
克里克、霍氏或反霍氏氢键键合)。
[0321]
杂交可在不同条件下进行。严格条件具有序列依赖性且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
[0322]
确定序列是否可与目标核酸特异性杂交的方法在本领域中为熟知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与τ蛋白核酸特异性杂交。
[0323]
互补性
[0324]
当反义化合物中足够数目的核碱基可与目标核酸中相应核碱基进行氢键键合，从而出现所需作用(例如对目标核酸(诸如τ蛋白核酸)的反义抑制作用)时，反义化合物与目标核酸彼此互补。
[0325]
可容许反义化合物与τ蛋白核酸之间的非互补性核碱基，前提条件为反义化合物仍能够与目标核酸特异性杂交。此外，反义化合物可在τ蛋白核酸的一个或多个区段上杂交，因此介入或相邻区段不涉及杂交事件(例如环结构、失配或发夹结构)。
[0326]
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与τ蛋白核酸、目标区、目标段或其指定部分具有或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性。反义化合物与目标核酸的互补性百分比可使用常规方法测定。
[0327]
例如，反义化合物中反义化合物的20个核碱基中有18个核碱基与目标区互补并且因此特异性杂交将表示90％互补性。在此实例中，其余非互补核碱基可与互补核碱基丛集或交替且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因而，长度为18个核碱基并且具有4(四)个非互补核碱基并且所述非互补核碱基由与目标核酸完全互补的两个区侧接的反义化合物与目标核酸将具有77.8％总体互补性并且因而属于本发明范畴内。反义化合物与目标核酸的区的互补性百分比可常规地使用本领域已知的blast程序(基本局部比对搜寻工具(basic local alignment search tool))和powerblast程序来测定(altschul等人,j.mol.biol.,1990,215,403 410；zhang和madden,genome res.,1997,7,649 656)。同源性、序列一致性或互补性百分比可通过例如使用smith和waterman(adv.appl.math.,1981,2,482 489)的算法的gap程序(威斯康星序列分析套件(wisconsin sequence analysis package)，用于unix的版本8，genetics computer group,university research park,madison wis.)使用预设设置来测定。
[0328]
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与目标核酸或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与τ蛋白核酸或其目标区或目标段或目标序列完全互补。如本文所用的“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基都能够与目标核酸的相应核碱基进行准确碱基配对。例如，具有20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的目标序列完全互补，只要目标核酸中有具有20个核碱基的相应部分与反义化合物完全互补即可。完全互补也可对于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。例如，具有30个核碱基的反义化合物中具有20个核碱基的部分可与长度为400个核碱基的目标序列“完全互补”。具有30个核碱基的寡核苷酸中具有20个核碱基的部分在目标序列具有含20个核碱基，其中每个核碱基与反义化合物中具有20个核碱基的部分互补的相应部分的情况下与目标
序列完全互补。同时，整个具有30个核碱基的反义化合物与目标序列可能完全互补或未必完全互补，根据反义化合物的其余10个核碱基是否也与目标序列互补而定。
[0329]
非互补核碱基的位置可处于反义化合物的5’端或3’端处。或者，非互补核碱基或核碱基可处于反义化合物的内部位置上。当存在两个或两个以上非互补核碱基时，其可为连续(即连接)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于间隔体反义寡核苷酸的翼段中。
[0330]
在某些实施方案中，长度为或为至多11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基的反义化合物相对于目标核酸(诸如τ蛋白核酸)或其指定部分包含至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
[0331]
在某些实施方案中，长度为或为至多11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基的反义化合物相对于目标核酸(诸如τ蛋白核酸)或其指定部分包含至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
[0332]
本文提供的反义化合物也包括与目标核酸的一部分互补的反义化合物。如本文所用的“部分”是指目标核酸的区或区段内确定数目的连续(即连接)核碱基。“部分”也可指反义化合物中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少9个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少11个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与目标段中具有至少15个核碱基的部分互补。也涵盖与目标段中具有至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个(或由这些值中的任何两者所界定的范围)核碱基的部分互补的反义化合物。
[0333]
一致性
[0334]
本文提供的反义化合物也可与特定核苷酸序列seq id no或由特定isis编号表示的化合物或其部分具有确定的一致性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同核碱基配对能力，则其与本文公开的序列一致。例如，在所公开的dna序列中含有尿嘧啶而非胸苷的rna将视作与dna序列一致，因为尿嘧啶和胸苷均与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述的反义化合物的缩短和延长型式以及相对于本文提供的反义化合物具有不一致碱基的化合物。不一致碱基可彼此相邻或散布于整个反义化合物中。反义化合物的一致性百分比是根据相对于与其比较的序列具有一致碱基配对的碱基的数目来计算。
[0335]
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或seq id no或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。
[0336]
在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与目标核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与目标核酸的等长部分相比较。
[0337]
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与目标核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与目标核酸的等长部分相比较。
[0338]
修饰
[0339]
核苷为碱基
‑
糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸为进一步包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可连接至糖的2’、3’或5’羟基部分。寡核苷酸通过相邻核苷彼此的共价键形成线性聚合寡核苷酸而形成。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常视作形成寡核苷酸的核苷间键。
[0340]
反义化合物的修饰涵盖核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。经修饰的反义化合物常因具有诸如像以下的所需特性而优于原生形式：细胞吸收增强、对核酸标靶的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增强或抑制活性增强。
[0341]
经化学修饰的核苷也可用于增强缩短或截短型反义寡核苷酸对其目标核酸的结合亲和力。因此，通常可以具有这种经化学修饰的核苷的较短反义化合物获得类似结果。
[0342]
经修饰的核苷间键
[0343]
rna和dna的天然存在的核苷间键为3’至5’磷酸二酯键。相较于具有天然存在的核苷间键的反义化合物，具有一个或多个经修饰的(即非天然存在)的核苷间键的反义化合物常会因具有所需特性(诸如像细胞吸收增强、对目标核酸的亲和力增强和在核酸酶存在下的稳定性增强)而被优先选择。
[0344]
具有经修饰的核苷间键的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键以及不具有磷原子的核苷间键。代表性含磷核苷间键包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷键和不含磷键的方法是熟知的。
[0345]
在某些实施方案中，靶向τ蛋白核酸的反义化合物包含一个或多个经修饰的核苷间键。在某些实施方案中，经修饰的核苷间键分散在整个反义化合物中。在某些实施方案中，经修饰的核苷间键为硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
[0346]
经修饰的糖部分
[0347]
反义化合物可任选地含有其中糖基已经修饰的一个或多个核苷。这种糖经修饰的核苷可赋予反义化合物以增强的核酸酶稳定性、增强的结合亲和力或一些其他有利生物特性。在某些实施方案中，核苷包含经化学修饰的呋喃核糖环部分。经化学修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5’和2’取代基；非偕位环原子桥连形成双环核酸(bna)；核糖基环氧原子经s、n(r)或c(r1)(r2)(r、r1和r2各自独立地为h、c1‑
c
12
烷基或保护基)置换；以及其组合。经化学修饰的糖的实例包括2
’‑
f
‑5’‑
甲基取代的核苷(关于其他所公开的5’,2’位上经双取代的核苷，参见08年8月21日公开的pct国际申请案wo 2008/101157)；或核糖基环氧原子经s置换且2’位上经进一步取代(参见2005年6月16日公开的公开美国专利申请案us2005
‑
0130923)；或bna的5’位上的取代(参见07年11月22日公开的pct国际申请案wo 2007/134181，其中lna经例如5
’‑
甲基或5
’‑
乙烯基取代)。
[0348]
具有经修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5
’‑
乙烯基、5
’‑
甲基(r型或s型)、4
’‑
s、2
’‑
f、2
’‑
och3、2
’‑
och2ch3、2
’‑
och2ch2f和2
’‑
o(ch2)2och3取代基的核苷。2’位上
的取代基也可选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、o
‑
烷基、o
‑
c1‑
c
10
烷基、ocf3、och2f、o(ch2)2sch3、o(ch2)2‑
o
‑
n(r
m
)(r
n
)、o
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
n(r
m
)(r
n
)和o
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
n(r
l
)
‑
(ch2)2‑
n(r
m
)(r
n
)，其中每个r
l
、r
m
和r
n
独立地为h或经取代或未经取代的c1‑
c
10
烷基。
[0349]
如本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的经修饰的核苷。双环核苷的实例包括不限于在4’与2’核糖基环原子之间包含桥基的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个包含4’至2’桥的双环核苷。这种4’至2’桥接双环核苷的实例包括但不限于下式中的一者：4
’‑
(ch2)
‑
o
‑2’
(lna)；4
’‑
(ch2)
‑
s
‑2’
；4
’‑
(ch2)2‑
o
‑2’
(ena)；4
’‑
ch(ch3)
‑
o
‑2’
和4
’‑
ch(ch2och3)
‑
o
‑2’
(及其类似物，参见2008年7月15日颁布的美国专利7,399,845)；4
’‑
c(ch3)(ch3)
‑
o
‑2’
(及其类似物，参见2009年1月8日公开的公开国际申请案wo/2009/006478)；4
’‑
ch2‑
n(och3)
‑2’
(及其类似物,参见2008年12月11日公开的公开国际申请案wo/2008/150729)；4
’‑
ch2‑
o
‑
n(ch3)
‑2’
(参见2004年9月2日公开的公开美国专利申请案us2004
‑
0171570)；4
’‑
ch2‑
n(r)
‑
o
‑2’
，其中r为h、c1‑
c
12
烷基或保护基(参见2008年9月23日颁布的美国专利7,427,672)；4
’‑
ch2‑
c(h)(ch3)
‑2’
(参见chattopadhyaya等人,j.org.chem.,2009,74,118
‑
134)；和4
’‑
ch2‑
c(＝ch2)
‑2’
(及其类似物,参见2008年12月8日公开的公开国际申请案wo 2008/154401)。
[0350]
与双环核苷相关的其他报道也可见于公开文献中(参见例如：singh等人，chem.commun.,1998,4,455
‑
456；koshkin等人，tetrahedron,1998,54,3607
‑
3630；wahlestedt等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2000,97,5633
‑
5638；kumar等人，bioorg.med.chem.lett.,1998,8,2219
‑
2222singh等人，j.org.chem.,1998,63,10035
‑
10039；srivastava等人，j.am.chem.soc.,2007,129(26)8362
‑
8379；elayadi等人，curr.opinion invest.drugs,2001,2,558
‑
561；braasch等人，chem.biol.,2001,8,1
‑
7；和orum等人，curr.opinion mol.ther.,2001,3,239
‑
243；美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,399,845；7,547,684；和7,696,345；美国专利公开号us2008
‑
0039618；us2009
‑
0012281；美国专利序列号60/989,574；61/026,995；61/026,998；61/056,564；61/086,231；61/097,787；和61/099,844；公开pct国际申请wo 1994/014226；wo 2004/106356；wo 2005/021570；wo 2007/134181；wo 2008/150729；wo 2008/154401；和wo 2009/006478。每个上述双环核苷可经制备而具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α
‑
l
‑
呋喃核糖和β
‑
d
‑
呋喃核糖(参见1999年3月25日公开为wo 99/14226的pct国际申请pct/dk98/00393)。
[0351]
在某些实施方案中，bna核苷的双环糖部分包括但不限于在戊呋喃糖基糖部分的4’位与2’位之间具有至少一个桥基的化合物，其中这种桥基独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的连接基团：
‑
[c(r
a
)(r
b
)]
n
‑
、
‑
c(r
a
)＝c(r
b
)
‑
、
‑
c(r
a
)＝n
‑
、
‑
c(＝o)
‑
、
‑
c(＝nr
a
)
‑
、
‑
c(＝s)
‑
、
‑
o
‑
、
‑
si(r
a
)2‑
、
‑
s(＝o)
x
‑
和
‑
n(r
a
)
‑
；
[0352]
其中：
[0353]
x为0、1或2；
[0354]
n为1、2、3或4；
[0355]
每个r
a
和r
b
独立地为h、保护基、羟基、c1‑
c
12
烷基、取代的c1‑
c
12
烷基、c2‑
c
12
烯基、取代的c2‑
c
12
烯基、c2‑
c
12
炔基、取代的c2‑
c
12
炔基、c5‑
c
20
芳基、取代的c5‑
c
20
芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、c5‑
c7脂环基、取代的c5‑
c7脂环基、卤素、oj1、nj1j2、sj1、
n3、cooj1、酰基(c(＝o)
‑
h)、取代的酰基、cn、磺酰基(s(＝o)2‑
j1)或亚磺酰基(s(＝o)
‑
j1)；并且
[0356]
每个j1和j2独立地为h、c1‑
c
12
烷基、取代的c1‑
c
12
烷基、c2‑
c
12
烯基、取代的c2‑
c
12
烯基、c2‑
c
12
炔基、取代的c2‑
c
12
炔基、c5‑
c
20
芳基、取代的c5‑
c
20
芳基、酰基(c(＝o)
‑
h)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、c1‑
c
12
氨基烷基、取代的c1‑
c
12
氨基烷基或保护基。
[0357]
在某些实施方案中，双环糖部分的桥基为
‑
[c(r
a
)(r
b
)]
n
‑
、
‑
[c(r
a
)(r
b
)]
n
‑
o
‑
、
‑
c(r
a
r
b
)
‑
n(r)
‑
o
‑
或
‑
c(r
a
r
b
)
‑
o
‑
n(r)
‑
。在某些实施方案中，桥基为4
’‑
ch2‑2’
、4
’‑
(ch2)2‑2’
、4
’‑
(ch2)3‑2’
、4
’‑
ch2‑
o
‑2’
、4
’‑
(ch2)2‑
o
‑2’
、4
’‑
ch2‑
o
‑
n(r)
‑2’
和4
’‑
ch2‑
n(r)
‑
o
‑2’‑
，其中每个r独立地为h、保护基或c1‑
c
12
烷基。
[0358]
在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型定义。例如，包含4
’‑2’‑
亚甲基
‑
氧基桥基的核苷可呈α
‑
l构型或β
‑
d构型。α
‑
l
‑
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)bna先前已并入展示反义活性的反义寡核苷酸中(frieden等人,nucleic acids research,2003,21,6365
‑
6372)。
[0359]
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(a)α
‑
l
‑
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)bna；(b)β
‑
d
‑
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)bna；(c)亚乙基氧基(4
’‑
(ch2)2‑
o
‑2’
)bna；(d)氨基氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑
n(r)
‑2’
)bna；(e)氧氨基(4
’‑
ch2‑
n(r)
‑
o
‑2’
)bna；和(f)甲基(亚甲氧基)(4
’‑
ch(ch3)
‑
o
‑2’
)bna；(g)亚甲基
‑
硫基(4
’‑
ch2‑
s
‑2’
)bna；(h)亚甲基
‑
氨基(4
’‑
ch2‑
n(r)
‑2’
)bna；(i)甲基碳环(4
’‑
ch2‑
ch(ch3)
‑2’
)bna；和(j)亚丙基碳环(4
’‑
(ch2)3‑2’
)bna，如下文所描绘。
[0360][0361]
其中bx为碱基部分并且r独立地为h、保护基或c1‑
c
12
烷基。
[0362]
在某些实施方案中，提供具有式i的双环核苷：
[0363][0364]
其中：
[0365]
bx为杂环碱基部分；
[0366]
‑
q
a
‑
q
b
‑
q
c
‑
为
‑
ch2‑
n(r
c
)
‑
ch2‑
、
‑
c(＝o)
‑
n(r
c
)
‑
ch2‑
、
‑
ch2‑
o
‑
n(r
c
)
‑
、
‑
ch2‑
n(r
c
)
‑
o
‑
或
‑
n(r
c
)
‑
o
‑
ch2；
[0367]
r
c
为c1‑
c
12
烷基或氨基保护基；并且
[0368]
t
a
和t
b
各自独立地为h、羟基保护基、结合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接基。
[0369]
在某些实施方案中，提供具有式ii的双环核苷：
[0370][0371]
其中：
[0372]
bx为杂环碱基部分；
[0373]
t
a
和t
b
各自独立地为h、羟基保护基、结合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接基；
[0374]
z
a
为c1‑
c6烷基、c2‑
c6烯基、c2‑
c6炔基、取代的c1‑
c6烷基、取代的c2‑
c6烯基、取代的c2‑
c6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇或取代的硫基。
[0375]
在一个实施方案中，每个取代的基团独立地经独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、侧氧基、羟基、oj
c
、nj
c
j
d
、sj
c
、n3、oc(＝x)j
c
和nj
e
c(＝x)nj
c
j
d
，其中每个j
c
、j
d
和j
e
独立地为h、c1‑
c6烷基或取代的c1‑
c6烷基并且x为o或nj
c
。
[0376]
在某些实施方案中，提供具有式iii的双环核苷：
[0377][0378]
其中：
[0379]
bx为杂环碱基部分；
[0380]
t
a
和t
b
各自独立地为h、羟基保护基、结合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接基；
[0381]
z
b
为c1‑
c6烷基、c2‑
c6烯基、c2‑
c6炔基、取代的c1‑
c6烷基、取代的c2‑
c6烯基、取代的c2‑
c6炔基或取代的酰基(c(＝o)
‑
)。
[0382]
在某些实施方案中，提供具有式iv的双环核苷：
[0383][0384]
其中：
[0385]
bx为杂环碱基部分；
[0386]
t
a
和t
b
各自独立地为h、羟基保护基、结合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接基；
[0387]
r
d
为c1‑
c6烷基、取代的c1‑
c6烷基、c2‑
c6烯基、取代的c2‑
c6烯基、c2‑
c6炔基或取代的c2‑
c6炔基；
[0388]
每个q
a
、q
b
、q
c
和q
d
独立地为h、卤素、c1‑
c6烷基、取代的c1‑
c6烷基、c2‑
c6烯基、取代的c2‑
c6烯基、c2‑
c6炔基或取代的c2‑
c6炔基、c1‑
c6烷氧基、取代的c1‑
c6烷氧基、酰基、取代的酰基、c1‑
c6氨基烷基或取代的c1‑
c6氨基烷基；
[0389]
在某些实施方案中，提供具有式v的双环核苷：
[0390][0391]
其中：
[0392]
bx为杂环碱基部分；
[0393]
t
a
和t
b
各自独立地为h、羟基保护基、结合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接基；
[0394]
q
a
、q
b
、q
e
和q
f
各自独立地为氢、卤素、c1‑
c
12
烷基、取代的c1‑
c
12
烷基、c2‑
c
12
烯基、取代的c2‑
c
12
烯基、c2‑
c
12
炔基、取代的c2‑
c
12
炔基、c1‑
c
12
烷氧基、取代的c1‑
c
12
烷氧基、oj
j
、sj
j
、soj
j
、so2j
j
、nj
j
j
k
、n3、cn、c(＝o)oj
j
、c(＝o)nj
j
j
k
、c(＝o)j
j
、o
‑
c(＝o)nj
j
j
k
、n(h)c(＝nh)nj
j
j
k
、n(h)c(＝o)nj
j
j
k
或n(h)c(＝s)nj
j
j
k
；
[0395]
或q
e
连同q
f
一起为＝c(q
g
)(q
h
)；
[0396]
q
g
和q
h
各自独立地为h、卤素、c1‑
c
12
烷基或取代的c1‑
c
12
烷基。
[0397]
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)bna单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5
‑
甲基
‑
胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备以及其寡聚及核酸识别特性已有所描述(koshkin等人,tetrahedron,1998,54,3607
‑
3630)。bna及其制备也描述于wo 98/39352和wo 99/14226中。
[0398]
亚甲氧基(4
’‑
ch2‑
o
‑2’
)bna和2
’‑
硫基
‑
bna的类似物也已经制备(kumar等人,
bioorg.med.chem.lett.,1998,8,2219
‑
2222)。构成作为核酸聚合酶的受质的寡脱氧核糖核苷酸双螺旋体的锁核苷类似物的制备也已有所描述(wengel等人,wo 99/14226)。此外，2
’‑
氨基
‑
bna(一种新颖的构形受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成在本领域中已有所描述(singh等人,j.org.chem.,1998,63,10035
‑
10039)。另外，2
’‑
氨基
‑
bna和2
’‑
甲基氨基
‑
bna已经制备并且其与互补rna和dna股的双螺旋体的热稳定性先前已有所报导。
[0399]
在某些实施方案中，提供具有式vi的双环核苷：
[0400][0401]
其中：
[0402]
bx为杂环碱基部分；
[0403]
t
a
和t
b
各自独立地为h、羟基保护基、结合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接基；
[0404]
每个q
i
、q
j
、q
k
和q
l
独立地为h、卤素、c1‑
c
12
烷基、取代的c1‑
c
12
烷基、c2‑
c
12
烯基、取代的c2‑
c
12
烯基、c2‑
c
12
炔基、取代的c2‑
c
12
炔基、c1‑
c
12
烷氧基、取代的c1‑
c
12
烷氧基、oj
j
、sj
j
、soj
j
、so2j
j
、nj
j
j
k
、n3、cn、c(＝o)oj
j
、c(＝o)nj
j
j
k
、c(＝o)j
j
、o
‑
c(＝o)nj
j
j
k
、n(h)c(＝nh)nj
j
j
k
、n(h)c(＝o)nj
j
j
k
或n(h)c(＝s)nj
j
j
k
；并且
[0405]
q
i
连同q
j
或q
l
连同q
k
一起为＝c(q
g
)(q
h
)，其中q
g
和q
h
各自独立地为h、卤素、c1‑
c
12
烷基或取代的c1‑
c
12
烷基。
[0406]
一种具有4
’‑
(ch2)3‑2’
桥和烯基类似物(即桥基4
’‑
ch＝ch
‑
ch2‑2’
)的碳环双环核苷已有所描述(freier等人,nucleic acids research,1997,25(22),4429
‑
4443；和albaek等人,j.org.chem.,2006,71,7731
‑
7740)。碳环双环核苷的合成和制备以及其寡聚和生物化学研究也已有所描述(srivastava等人,j.am.chem.soc.2007,129(26),8362
‑
8379)。
[0407]
如本文所用的“4
’‑2’
双环核苷”或“4’至2’双环核苷”是指包含含有连接呋喃糖环的2个碳原子(即连接糖环的2’碳原子和4’碳原子)的桥的呋喃糖环的双环核苷。
[0408]
如本文所用的“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的经修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置上被修饰的或被取代。
[0409]
如本文所用的“2’位上经修饰的糖”意指在2’位上经修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，这种修饰包括选自以下的取代基：包括但不限于卤基、取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的硫烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的烯丙基以及取代和未取代的炔基。在某些实施方案中，2’位修饰选自包括但不限于以下的取代基：o[(ch2)
n
o]
m
ch3、o(ch2)
n
nh2、o(ch2)
n
ch3、o(ch2)
n
f、o(ch2)
n
onh2、och2c(＝o)n(h)ch3和o(ch2)
n
on[(ch2)
n
ch3]2，其中n和m为1至约10。其他2
’‑
取代基也可选自：c1‑
c
12
烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o
‑
烷芳基或o
‑
芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、f、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷氨基、取代的硅烷基、rna裂解基团、报导基团、嵌入剂、改良药物动力学特性的基团、或改良反义化合物的药效学特性的基团以及其他具有类似特性的取代基。在某些实施方案中，经修饰的核苷
包含2
’‑
moe侧链(baker等人,j.biol.chem.,1997,272,11944
‑
12000)。这种2
’‑
moe取代已描述为相较于未经修饰的核苷和其他经修饰的核苷(诸如2
’‑
o
‑
甲基、o
‑
丙基及o
‑
氨基丙基)使得结合亲和力有所改良。具有2
’‑
moe取代基的寡核苷酸也已展示为基因表达的反义抑制剂且具有有希望用于活体内使用的特征(martin,helv.chim.acta,1995,78,486
‑
504；altmann等人,chimia,1996,50,168
‑
176；altmann等人,biochem.soc.trans.,1996,24,630
‑
637；和altmann等人,nucleosides nucleotides,1997,16,917
‑
926)。
[0410]
如本文所用的“经修饰的四氢哌喃核苷”或“经修饰的thp核苷”意指具有取代普通核苷中的戊呋喃糖基残基的六元四氢哌喃“糖”(糖替代物)的核苷。经修饰的thp核苷包括但不限于在本领域中称为己醣醇核酸(hna)、anitol核酸(ana)、甘露醇核酸(mna)(参见leumann,bioorg.med.chem.,2002,10,841
‑
854)、氟hna(f
‑
hna)者或那些具有式vii的化合物：
[0411][0412]
其中独立地对于所述至少一种式vii的四氢哌喃核苷类似物中的每一者：
[0413]
bx为杂环碱基部分；
[0414]
t
a
和t
b
各自独立地为将四氢哌喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间键基团，或t
a
和t
b
中的一者为将四氢哌喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间键基团并且t
a
和t
b
中的另一者为h、羟基保护基、连接的结合基团或5’或3’端基；
[0415]
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为h、c1‑
c6烷基、取代的c1‑
c6烷基、c2‑
c6烯基、取代的c2‑
c6烯基、c2‑
c6炔基或取代的c2‑
c6炔基；并且每个r1和r2选自氢、羟基、卤素、取代或未取代的烷氧基、nj1j2、sj1、n3、oc(＝x)j1、oc(＝x)nj1j2、nj3c(＝x)nj1j2和cn，其中x为o、s或nj1，并且每个j1、j2和j3独立地为h或c1‑
c6烷基。
[0416]
在某些实施方案中，提供式vii的经修饰的thp核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自为h。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一者不为h。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一者为甲基。在某些实施方案中，提供式vii的thp核苷，其中r1和r2中的一者为氟。在某些实施方案中，r1为氟且r2为h；r1为甲氧基且r2为h，和r1为h且r2为甲氧基乙氧基。
[0417]
如本文所用的“2’位上经修饰的”或“2’位上经取代”是指包含在2’位上包含除h或oh以外的取代基的糖的核苷。2’位上经修饰的核苷包括但不限于连接糖环的两个碳原子的桥基连接糖环的2’碳与另一碳的双环核苷以及具有诸如以下的非桥连2’取代基的核苷：烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、o
‑
烯丙基、o
‑
c1‑
c
10
烷基、
‑
ocf3、o
‑
(ch2)2‑
o
‑
ch3、2
’‑
o(ch2)2sch3、o
‑
(ch2)2‑
o
‑
n(r
m
)(r
n
)或o
‑
ch2‑
c(＝o)
‑
n(r
m
)(r
n
)，其中每个r
m
和r
n
独立地为h或取代或未取代的c1‑
c
10
烷基。2’位上经修饰的核苷可进一步例如在糖的其他位置上和/或在核碱基上包含其他修饰。
[0418]
如本文所用的“2
’‑
f”是指包含在2’位上包含氟基的糖的核苷。
[0419]
如本文所用的“2
’‑
ome”或“2
’‑
och
3”或“2
’‑
o
‑
甲基”各自指包含在糖环的2’位上
包含
‑
och3基团的糖的核苷。
[0420]
如本文所用的“moe”或“2
’‑
moe”或“2
’‑
och2ch2och
3”或“2
’‑
o
‑
甲氧基乙基”各自是指包含在糖环的2’位上包含
‑
och2ch2och3基团的糖的核苷。
[0421]
如本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一个或多个是经修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(rna)和/或脱氧核糖核苷(dna)。
[0422]
许多其他双环和三环糖替代物环系统在本领域中也是已知的，其可用于修饰并入反义化合物中的核苷(参见例如评述文章：leumann,bioorg.med.chem.,2002,10,841
‑
854)。
[0423]
可对这种环系统进行各种另外的取代以增强活性。
[0424]
制备经修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。
[0425]
在具有经修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、经修饰的或其组合)维持可与适当核酸标靶杂交。
[0426]
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有经修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，经修饰的糖部分为2
’‑
moe。在某些实施方案中，2
’‑
moe修饰的核苷排列于间隔体基序中。在某些实施方案中，经修饰的糖部分为具有(4
’‑
ch(ch3)
‑
o
‑2’
)桥连基团的双环核苷。在某些实施方案中，经(4
’‑
ch(ch3)
‑
o
‑2’
)修饰的核苷排列于整个间隔体基序翼区中。
[0427]
组合物和配制药物组合物的方法
[0428]
反义寡核苷酸可与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。组合物和配制药物组合物的方法取决于许多准则，包括但不限于施用途径、疾病程度或所施用的剂量。
[0429]
靶向τ蛋白核酸的反义化合物可通过将反义化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载剂组合而用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)。pbs为适用于非经肠递送的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施方案中，在本文所述的方法中使用包含靶向τ蛋白核酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为pbs。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸。
[0430]
包含反义化合物的药物组合物涵盖在施用动物(包括人类)时能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残余物的任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐，或任何其他寡核苷酸。因此，例如，本公开还描述了反义化合物的药学上可接受的盐、前药、这种前药的药学上可接受的盐，和其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
[0431]
前药可包括在反义化合物的一端或两端上并入可由体内内源性核酸酶裂解而形成活性反义化合物的另外的核苷。
[0432]
结合的反义化合物
[0433]
反义化合物可共价连接至一个或多个增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的部分或结合物。典型结合基团包括胆固醇部分和脂质部分。另外的结合基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明(rhodamine)、香豆素和染料。
[0434]
反义化合物也可经修饰而具有一个或多个稳定化基团，所述一个或多个稳定化基团一般连接至反义化合物的一端或两端以增强诸如像核酸酶稳定性的特性。在稳定化基团中包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免遭核酸外切酶降解，并且可有助于递送和/或定位于细胞内。帽可存在于5’端(5’帽)或3’端(3’帽)上，或可存在于两端上。帽结构在本领域中为熟知的并且包括例如反转脱氧无碱基帽。另外可用于对反义化合物的一端或两端进行封端以赋予核酸酶稳定性的3’和5’稳定化基团包括2003年1月16日公开的wo03/004602中所公开的那些。
[0435]
细胞培养和反义化合物处理
[0436]
可在多种细胞类型中活体外测试反义化合物对τ蛋白核酸的含量、活性或表达的作用。用于这种分析的细胞类型可获自商业供应商(例如american type culture collection,manassus,va；zen
‑
bio公司，research triangle park,nc；clonetics公司，walkersville,md)并且根据供货商的说明书使用市售可得的试剂(例如invitrogen life technologies,carlsbad,ca)培养。说明性细胞类型包括但不限于hepg2细胞、hep3b细胞和初级肝细胞。
[0437]
活体外测试反义寡核苷酸
[0438]
本文描述用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可经适当修改以用于用其他反义化合物进行的处理。
[0439]
可当细胞在培养中达到约60％至80％汇合度时，用反义寡核苷酸处理细胞。
[0440]
一种常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子型脂质转染试剂脂质体(lipofectin)(invitrogen,carlsbad,ca)。可将反义寡核苷酸与脂质体在opti
‑
mem 1(invitrogen,carlsbad,ca)中混合以达成反义寡核苷酸的所需最终浓度和可在每100nm反义寡核苷酸2至12ug/ml范围内的脂质体浓度。
[0441]
另一用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括脂染胺(lipofectamine)(invitrogen,carlsbad,ca)。可将反义寡核苷酸与脂染胺在opti
‑
mem 1血清减少型培养基(invitrogen,carlsbad,ca)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度和可在每100nm反义寡核苷酸2至12ug/ml范围内的脂染胺浓度。
[0442]
另一用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔。
[0443]
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。可在反义寡核苷酸处理后16至24小时收集细胞，此时通过本领域中已知的和本文所述的方法测量目标核酸的rna或蛋白含量。一般而言，当以多次重复执行处理时，将数据呈现为重复处理的平均值。
[0444]
所用的反义寡核苷酸浓度在细胞系之间有所不同。确定最佳用于特定细胞系的反义寡核苷酸浓度的方法在本领域中为熟知的。当用脂染胺转染时，通常使用浓度在1nm至300nm范围内的反义寡核苷酸。当使用电穿孔进行转染时，使用625nm至20,000nm范围内的较高浓度的反义寡核苷酸。
[0445]
rna分离
[0446]
可对总细胞rna或聚(腺苷酸) mrna进行rna分析。rna分离的方法在本领域中为熟知的。rna是使用本领域中熟知的方法，例如使用trizol试剂(invitrogen,carlsbad,ca)，根据制造商推荐的方案来制备。
[0447]
分析对标靶含量或表达的抑制作用
[0448]
对τ蛋白核酸的含量或表达的抑制作用可以本领域中已知的多种方式来分析。例如，目标核酸含量可通过例如北方墨点分析、竞争聚合酶链反应(pcr)或定量实时pcr来定量。可对总细胞rna或聚(腺苷酸) mrna进行rna分析。rna分离的方法在本领域中为熟知的。北方墨点分析在本领域中也是常规的。定量实时pcr可方便地使用市售可得的abi prism 7600、7700或7900序列检测系统(可获自pe
‑
applied biosystems,foster city,ca并且根据制造商说明书来使用)完成。
[0449]
对目标rna含量的定量实时pcr分析
[0450]
可通过定量实时pcr，使用abi prism 7600、7700或7900序列检测系统(pe
‑
applied biosystems,foster city,ca)根据制造商说明书来对目标rna含量进行定量。定量实时pcr的方法在本领域中是熟知的。
[0451]
在实时pcr之前，使分离的rna进行逆转录酶(rt)反应，产生互补dna(cdna)，其接着用作实时pcr扩增的受质。在同一样品孔中依序进行rt和实时pcr反应。rt和实时pcr试剂可获自invitrogen(carlsbad,ca)。rt实时pcr反应是通过为本领域技术人员熟知的方法进行。
[0452]
通过实时pcr获得的基因(或rna)标靶量是使用表达恒定的基因(诸如亲环素a(cyclophilin a))的表达含量或通过使用ribogreen(invitrogen公司，carlsbad,ca)定量总rna来校正。亲环素a表达是通过实时pcr，通过与标靶同时操作、复合操作或分开操作来定量。总rna是使用ribogreen rna定量试剂(invetrogen公司，eugene,or)来定量。通过ribogreen定量rna的方法在jones,l.j.等人(analytical biochemistry,1998,265,368
‑
374)中有所教导。使用cytofluor 4000仪器(pe applied biosystems)测量ribogreen荧光。
[0453]
探针和引物经设计以与τ蛋白核酸杂交。设计实时pcr探针和引物的方法在本领域中为熟知的，并且可包括使用软件，诸如primer express软件(applied biosystems,foster city,ca)。
[0454]
分析蛋白含量
[0455]
对τ蛋白核酸的反义抑制作用可通过测量τ蛋白蛋白含量来评估。τ蛋白的蛋白含量可以本领域中熟知的多种方式来评估或定量，诸如免测沈淀法、西方墨点分析(免疫墨点法)、酶联免疫吸附分析(elisa)、定量蛋白质分析、蛋白质活性分析(例如卡斯蛋白酶活性分析)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选法(facs)。针对标靶的抗体可经识别且获自多种来源，诸如msrs抗体目录(aerie公司，birmingham,mi)，或可经由本领域中熟知的常规单株或多株抗体产生方法来制备。
[0456]
活体内测试反义化合物
[0457]
在动物中测试例如反义寡核苷酸的反义化合物以评估其抑制τ蛋白表达且产生表型变化(诸如认知和运动功能改进)的能力。在某些实施方案中，通过新颖物体辨认和筑窝行为来测量认知。在某些实施方案中，通过在动物中进行行走引发分析、旋转杆、握力、爬杆、空场表达、平衡木、后爪足印测试来测量运动功能。在某些实施方案中，在动物中测试例如反义寡核苷酸的反义化合物以评估其降低过度磷酸化τ蛋白和神经纤维缠结的能力。在某些实施方案中，测试例如反义寡核苷酸的反义化合物以评估其在戊烯四唑(ptz)诱发的癫痫发作模型中预防癫痫发作和/或减轻癫痫发作的严重性的能力。
[0458]
可在正常动物中或在实验疾病模型中进行测试。对于向动物施用，以药学上可接受的稀释剂，诸如磷酸盐缓冲生理盐水中配制反义寡核苷酸。施用包括非经肠施用途径，诸如腹膜内、静脉内和皮下。计算反义寡核苷酸剂量和施用频率在本领域技术人员的能力内，并且取决于诸如施用途径和动物体重的因素。在用反义寡核苷酸治疗一段时期之后，从cns组织或csf分离rna且测量τ蛋白核酸表达的变化。
[0459]
某些适应症
[0460]
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的方法、化合物和组合物，包含施用一种或多种本文所述的药物组合物。在某些实施方案中，个体患有神经退化性疾病。在某些实施方案中，个体处于发展神经退化性疾病的风险下，神经退化性疾病包括但不限于τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫和dravet综合征。在某些实施方案中，个体已鉴定为患有τ蛋白相关疾病。在某些实施方案中，本文提供用于防治性降低个体中的τ蛋白表达的方法。某些实施方案包括通过向个体施用治疗有效量的靶向τ蛋白核酸的反义化合物来治疗有需要的个体。
[0461]
在一个实施方案中，施用治疗有效量的靶向τ蛋白核酸的反义化合物伴随有监测个体中的τ蛋白含量以测定个体对施用反义化合物的反应。个体对施用反义化合物的反应可由医师用于确定治疗介入的量和持续时间。
[0462]
在某些实施方案中，施用靶向τ蛋白核酸的反义化合物导致τ蛋白表达降低至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或处于由这些值中的任何两者所界定的范围内。在某些实施方案中，施用靶向τ蛋白核酸的反义化合物导致动物的运动功能改进。在某些实施方案中，施用τ蛋白反义化合物使运动功能改进至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或处于由这些值中的任何两者所界定的范围内。
[0463]
在某些实施方案中，包含靶向τ蛋白的反义化合物的药物组合物用于制备用于治疗罹患或易患神经退化性疾病的患者的药剂，神经退化性疾病包括τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫和dravet综合征。
[0464]
某些热点区
[0465]
1.seq id no:1的核碱基135783
‑
135980
[0466]
在某些实施方案中，反义寡核苷酸经设计以靶向seq id no:1(genbank登录号genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的核碱基135783
‑
135980。在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135980为热点区。在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135980由反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，间隔体为5
‑
10
‑
5moe间隔体、5
‑9‑
5moe间隔体、5
‑7‑
6moe间隔体和5
‑8‑
5moe间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由磷酸
二酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷酸间键连接(例如反义寡核苷酸具有“混合骨架”)。
[0467]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135980由以下isis编号所靶向：424879、424880、548937、613114
‑
613120、622096
‑
622150、623988
‑
623996、664511
‑
664542和664661
‑
664819。
[0468]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135980由以下seq id no所靶向：56、57、248、462
‑
467、1668
‑
1698、2025
‑
2048、2301
‑
2309、2331
‑
2443和2478
‑
2483。
[0469]
在某些实施方案中，靶向核碱基135783
‑
135980的反义寡核苷酸达成活体外和/或活体内τ蛋白mrna和/或蛋白质含量降低至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％或至少93％。
[0470]
2.seq id no:1的核碱基135853
‑
135872
[0471]
在某些实施方案中，反义寡核苷酸经设计以靶向seq id no:1(genbank登录号genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的核碱基135853
‑
135872。在某些实施方案中，核碱基135853
‑
135872为热点区。在某些实施方案中，核碱基135853
‑
135872由反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，间隔体为5
‑
10
‑
5moe间隔体、5
‑9‑
5moe间隔体、5
‑7‑
6moe间隔体或5
‑8‑
5moe间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由磷酸二酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷酸间键连接(例如反义寡核苷酸具有“混合骨架”)。
[0472]
在某些实施方案中，核碱基135853
‑
135872由以下isis编号所靶向：424879、424880、613117、613118、622114
‑
622125、623993
‑
623996、664522
‑
664542、664676
‑
664713、664729
‑
664766和664783
‑
664819。
[0473]
在某些实施方案中，核碱基135853
‑
135872由以下seq id no所靶向：56、57、248、464
‑
465、1668
‑
1673、2039
‑
2048、2306
‑
2309、2345
‑
2443和2478
‑
2483。
[0474]
在某些实施方案中，靶向核碱基135853
‑
135872的反义寡核苷酸达成活体外和/或活体内τ蛋白mrna和/或蛋白质含量降低至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、
至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％或至少87％。
[0475]
3.seq id no:1的核碱基135783
‑
135929
[0476]
在某些实施方案中，反义寡核苷酸经设计以靶向seq id no:1(genbank登录号genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的核碱基135783
‑
135929。在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135929为热点区。在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135929由反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，间隔体为5
‑
10
‑
5moe间隔体、5
‑9‑
5moe间隔体、5
‑7‑
6moe间隔体或5
‑8‑
5moe间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由磷酸二酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷酸间键连接(例如反义寡核苷酸具有“混合骨架”)。
[0477]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135929由以下isis编号所靶向：424879、424880、548937、613114
‑
613119、622096
‑
622138、623988
‑
623996、664511
‑
664542和664661
‑
664819。
[0478]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135929由以下seq id no所靶向：56、57、248、462
‑
466、1668
‑
1686、2025
‑
2048、2301
‑
2309、2331
‑
2443和2478
‑
2483。
[0479]
在某些实施方案中，靶向核碱基135783
‑
135929的反义寡核苷酸达成活体外和/或活体内τ蛋白mrna和/或蛋白质含量降低至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％或至少93％。
[0480]
4.seq id no:1的核碱基135783
‑
135914
[0481]
在某些实施方案中，反义寡核苷酸经设计以靶向seq id no:1(genbank登录号genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的核碱基135783
‑
135914。在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135914为热点区。在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135914由反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，间隔体为5
‑
10
‑
5moe间隔体、5
‑9‑
5moe间隔体、5
‑7‑
6moe间隔体或5
‑8‑
5moe间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由磷酸二酯核苷间键连接。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷由硫代磷酸酯和磷酸二酯核
苷酸间键连接(例如反义寡核苷酸具有“混合骨架”)。
[0482]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135914由以下isis编号所靶向：424879、424880、548937、613114
‑
613119、622096
‑
622133、623988
‑
623996、664511
‑
664542、664661
‑
664819。
[0483]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135914由以下seq id no所靶向：56、57、248、462
‑
466、1668
‑
1681、2025
‑
2048、2301
‑
2309、2331
‑
2443和2478
‑
2483。
[0484]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135914由以下isis编号所靶向：424879、424880、548937、613114
‑
613119、622096
‑
622133和623988
‑
623996。
[0485]
在某些实施方案中，核碱基135783
‑
135914由以下seq id no所靶向：56、57、248、462
‑
466、1668
‑
1681、2025
‑
2048和2301
‑
2309。
[0486]
在某些实施方案中，靶向核碱基135783
‑
135914的反义寡核苷酸达成活体外和/或活体内τ蛋白mrna和/或蛋白质含量降低至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％或至少93％。
[0487]
本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。
[0488]
实施方案1.一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，所述经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含核碱基序列seq id no:20
‑
2443和seq id no:2478
‑
2483中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0489]
实施方案2.如实施方案1所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包含所述核碱基序列seq id no:446、313、321、1634和2309中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0490]
实施方案3.如实施方案1所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包含seq id no:446的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0491]
实施方案4.如实施方案1所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包含seq id no:313的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0492]
实施方案5.如实施方案1所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包含seq id no:321的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少
17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0493]
实施方案6.如实施方案1所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包含seq id no:1634的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0494]
实施方案7.如实施方案1所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸具有包含seq id no:2309的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0495]
实施方案8.一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，所述经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含核碱基序列seq id no:2444
‑
2477和seq id no:2484
‑
2565中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0496]
实施方案9.一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，所述经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含核碱基序列seq id no:20
‑
2565中任一者的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
[0497]
实施方案10.一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，所述经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135980的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0498]
实施方案11.一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，所述经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135853
‑
135872的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0499]
实施方案12.一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，所述经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135929的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0500]
实施方案13.一种包含经修饰寡核苷酸的化合物，所述经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含含有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个互补于seq id no:1的核碱基135783
‑
135914的相等长度部分的连续核碱基的核碱基序列。
[0501]
实施方案14.如实施方案4
‑
7所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的所述核碱基序列与seq id no:1至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
[0502]
实施方案15.如任何先前实施方案所述的化合物，其由单股经修饰的寡核苷酸组成。
[0503]
实施方案16.如任何先前实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键为经修饰核苷间键。
[0504]
实施方案17.如实施方案16所述的化合物，其中至少一个经修饰核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
[0505]
实施方案18.如实施方案16所述的化合物，其中每个经修饰核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键或磷酸二酯核苷间键。
[0506]
实施方案19.如实施方案1至18中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0507]
实施方案20.根据实施方案1至18中任一项所述的化合物，其中两个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0508]
实施方案21.根据实施方案1至18中任一项所述的化合物，其中三个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0509]
实施方案22.根据实施方案1至18中任一项所述的化合物，其中四个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0510]
实施方案23.根据实施方案1至18中任一项所述的化合物，其中五个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0511]
实施方案24.根据实施方案1至18中任一项所述的化合物，其中六个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0512]
实施方案25.根据实施方案1至18中任一项所述的化合物，其中至少六个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。
[0513]
实施方案26.如任何先前实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键为硫代磷酸酯键并且至少一个核苷间键为磷酸二酯键。
[0514]
实施方案27.如实施方案1至17中任一项所述的化合物，其中每个经修饰的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
[0515]
实施方案28.如任何先前实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷包含经修饰的核碱基。
[0516]
实施方案29.如实施方案28所述的化合物，其中所述经修饰的核碱基为5
‑
甲基胞嘧啶。
[0517]
实施方案30.如任何先前实施方案所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸中至少一个核苷包含经修饰的糖。
[0518]
实施方案31.如实施方案30所述的化合物，其中所述至少一个经修饰的糖为双环糖。
[0519]
实施方案32.如实施方案31所述的化合物，其中所述双环糖在所述糖的2’位与4’位之间包含化学键4
’‑
ch2
‑
n(r)
‑
o
‑2’
桥，其中r独立地为h、c1
‑
c12烷基或保护基。
[0520]
实施方案33.如实施方案31所述的化合物，其中所述双环糖包含4
’‑
ch2
‑
n(r)
‑
o
‑2’
桥，其中r独立地为h、c1
‑
c12烷基或保护基。
[0521]
实施方案34.如实施方案31所述的化合物，其中至少一个经修饰的糖包含2
’‑
o
‑
甲氧基乙基。
[0522]
实施方案35.如实施方案31所述的化合物，其中所述经修饰的糖包含2
’‑
o(ch2)2‑
och3基团。
[0523]
实施方案36.如任何先前实施方案所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包
含：
[0524]
由10个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0525]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0526]
由5个连接的核苷组成的3’翼段；
[0527]
其中所述间隔段位于所述5’翼段与所述3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0528]
实施方案37.如任何先前实施方案所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
[0529]
由9个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0530]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0531]
由5个连接的核苷组成的3’翼段；
[0532]
其中所述间隔段位于所述5’翼段与所述3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0533]
实施方案38.如任何先前实施方案所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
[0534]
由7个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0535]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0536]
由6个连接的核苷组成的3’翼段；
[0537]
其中所述间隔段位于所述5’翼段与所述3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0538]
实施方案39.如任何先前实施方案所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
[0539]
由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0540]
由5个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0541]
由5个连接的核苷组成的3’翼段；
[0542]
其中所述间隔段位于所述5’翼段与所述3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0543]
实施方案40.如任何先前实施方案所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
[0544]
由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0545]
由4个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0546]
由6个连接的核苷组成的3’翼段；
[0547]
其中所述间隔段位于所述5’翼段与所述3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0548]
实施方案41.如任何先前实施方案所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
[0549]
由8个连接的脱氧核苷组成的间隔段；
[0550]
由6个连接的核苷组成的5’翼段；和
[0551]
由4个连接的核苷组成的3’翼段；
[0552]
其中所述间隔段位于所述5’翼段与所述3’翼段之间并且其中每个翼段的每个核苷包含经修饰的糖。
[0553]
实施方案42.如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
[0554]
实施方案43.如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。
[0555]
实施方案44.如任何先前实施方案所述的化合物，其中经修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
[0556]
实施方案45.一种组合物，其包含如任何先前实施方案所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂中至少一种。
[0557]
实施方案46.一种方法，其包括向动物施用如任何先前实施方案所述的化合物或组合物。
[0558]
实施方案47.如实施方案46所述的方法，其中所述动物为人类。
[0559]
实施方案48.如实施方案46所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善τ蛋白相关疾病、病症或病状或减缓其进展。
[0560]
实施方案49.如实施方案48所述的方法，其中所述疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0561]
实施方案50.如实施方案48所述的方法，其中所述疾病、病症或病状为阿尔茨海默病。
[0562]
实施方案51.如任何先前实施方案所述的化合物或组合物的用途，其是用于制造用于治疗神经退化性疾病、病症或病状的药剂。
[0563]
实施方案52.如实施方案51所述的用途，其中所述疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0564]
实施方案53.如实施方案51所述的用途，其中所述疾病、病症或病状为阿尔茨海默病。
[0565]
实施方案54.如实施方案1
‑
46中任一项所述的化合物或组合物，是用于治疗神经退化性疾病、病症或病状。
[0566]
实施方案55.如实施方案54所述的化合物或组合物，其中所述疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0567]
实施方案56.如实施方案54所述的化合物或组合物，其中所述疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病。
[0568]
实施方案57.一种化合物，其由isis 613099组成。
[0569]
实施方案58.一种化合物，其由isis 613361组成。
[0570]
实施方案59.一种化合物，其由isis 613370组成。
[0571]
实施方案60.一种化合物，其由isis 623782组成。
[0572]
实施方案61.一种化合物，其由isis 623996组成。
[0573]
实施方案62.一种化合物，其根据下式由经修饰的寡核苷酸组成：ges aeo teo aeo teo tds ads tds mcds mcds tds tds tds gds ads geo mceo mces aes mce；其中，
[0574]
a＝腺嘌呤，
[0575]
mc＝5
’‑
甲基胞嘧啶
[0576]
g＝鸟嘌呤，
[0577]
t＝胸腺嘧啶，
[0578]
e＝2
’‑
o
‑
甲氧乙基修饰的核苷，
[0579]
d＝2
’‑
脱氧核苷，和
[0580]
o＝磷酸二酯核苷间键，以及
[0581]
s＝硫代磷酸酯核苷间键。
[0582]
实施方案63.一种化合物，其根据下式由经修饰的寡核苷酸组成：aes mceo aeo mceo aeo mcds mcds tds tds mcds ads tds tds tds ads mceo teo ges tes mce；其中，
[0583]
a＝腺嘌呤，
[0584]
mc＝5
’‑
甲基胞嘧啶
[0585]
g＝鸟嘌呤，
[0586]
t＝胸腺嘧啶，
[0587]
e＝2
’‑
o
‑
甲氧乙基修饰的核苷，
[0588]
d＝2
’‑
脱氧核苷，和
[0589]
o＝磷酸二酯核苷间键，以及
[0590]
s＝硫代磷酸酯核苷间键。
[0591]
实施方案64.一种化合物，其根据下式由经修饰的寡核苷酸组成：ges geo teo teo teo tds mcds ads ads ads mcds ads mcds ads mcds mceo teo tes mces ae；其中，
[0592]
a＝腺嘌呤，
[0593]
mc＝5
’‑
甲基胞嘧啶
[0594]
g＝鸟嘌呤，
[0595]
t＝胸腺嘧啶，
[0596]
e＝2
’‑
o
‑
甲氧乙基修饰的核苷，
[0597]
d＝2
’‑
脱氧核苷，
[0598]
o＝磷酸二酯核苷间键，以及
[0599]
s＝硫代磷酸酯核苷间键。
[0600]
实施方案65.一种化合物，其根据下式由经修饰的寡核苷酸组成：mces mceo geo teo tes tds tds mcds tds tds ads mcds mcds aeo mceo mces mces te；其中，
[0601]
a＝腺嘌呤，
[0602]
mc＝5
’‑
甲基胞嘧啶
[0603]
g＝鸟嘌呤，
[0604]
t＝胸腺嘧啶，
[0605]
e＝2
’‑
o
‑
甲氧乙基修饰的核苷，
[0606]
d＝2
’‑
脱氧核苷，
[0607]
o＝磷酸二酯核苷间键，以及
[0608]
s＝硫代磷酸酯核苷间键。
[0609]
实施方案66.一种化合物，其根据下式由经修饰的寡核苷酸组成：aes aeo teo teo tes gds mcds tds mcds tds tds ads mcds teo mceo mces mces ae；其中，
[0610]
a＝腺嘌呤，
[0611]
mc＝5
’‑
甲基胞嘧啶
[0612]
g＝鸟嘌呤，
[0613]
t＝胸腺嘧啶，
[0614]
e＝2
’‑
o
‑
甲氧乙基修饰的核苷，
[0615]
d＝2
’‑
脱氧核苷，
[0616]
o＝磷酸二酯核苷间键，以及
[0617]
s＝硫代磷酸酯核苷间键。
[0618]
实施方案67.一种组合物，其包含如实施方案57
‑
66中任一项所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂中至少一种。
[0619]
实施方案68.一种方法，其包括向动物施用如实施方案57
‑
66中任一项所述的化合物或组合物。
[0620]
实施方案69.如实施方案68所述的方法，其中所述动物为人类。
[0621]
实施方案70.如实施方案67或68所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善τ蛋白相关疾病、病症或病状或减缓其进展。
[0622]
实施方案71.如实施方案70所述的方法，其中所述疾病、病症或病状为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0623]
实施方案72.如实施方案71所述的方法，其中所述疾病、病症或病状为阿尔茨海默病。
[0624]
实施方案73.如实施方案57
‑
66中任一项所述的化合物或组合物的用途，其是用于制造用于治疗神经退化性病症的药剂。
[0625]
实施方案74.如实施方案73所述的用途，其中所述神经退化性病症为τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0626]
实施方案75.如实施方案73所述的用途，其中所述神经退化性病症为阿尔茨海默病
[0627]
实施方案76.如实施方案1
‑
45或57
‑
66中任一项所述的化合物或组合物，是用于治疗神经退化性病症。
[0628]
实施方案77.如实施方案1
‑
45或57
‑
66中任一项所述的用于治疗神经退化性病症的化合物或组合物，其中所述神经退化性病症选自τ蛋白病变、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(ftd)、ftdp
‑
17、进行性核上麻痹(psp)、慢性创伤性脑病变(cte)、皮质基底神经节退化(cbd)、癫痫或dravet综合征。
[0629]
实施方案78.如实施方案1
‑
45或57
‑
66中任一项所述的化合物或组合物，是用于治
疗阿尔茨海默病。
[0630]
实例
[0631]
非限制性公开和以引用方式并入
[0632]
虽然已根据某些实施方案特定描述本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实例仅用以说明本文所述的化合物而不意欲限制。本技术案中所述的每个参考文献以全文引用的方式并入本文中。
[0633]
实例1：由moe间隔体对hepg2细胞中的人类τ蛋白的反义抑制
[0634]
设计靶向τ蛋白核酸的反义寡核苷酸并且活体外测试其对τ蛋白mrna的影响。使用脂质转染试剂，用100nm反义寡核苷酸转染培养的hepg2细胞。在约24小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。人类引物探针组rts3104(正向序列aagattgggtccctggacaat，在本文中指定为seq id no:10；逆向序列agcttgtgggtttcaatctttttatt，在本文中指定为seq id no:11；探针序列cacccacgtccctggcgga，在本文中指定为seq id no:12)用于测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。
[0635]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑
10
‑
5moe间隔体。间隔体的长度为20个核苷，其中中心间隔段包含10个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在整个每个间隔体中的核苷间键为硫代磷酸酯键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。下表1中所列的每个间隔体靶向在本文中指定为seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的人类τ蛋白基因组序列或靶向在本文中指定为seq id no:2(genbank登录号nm_001123066.3)的人类τ蛋白mrna序列。
‘
n/a’指示寡核苷酸不以100％互补性靶向基因序列。表2中所列的序列不以100％互补性靶向seq id no:1或2，而代之以靶向seq id no:3(genbank登录号nm_016841.4，跳过外显子3、4、6、8、10和12的变异mrna序列)或seq id no:4(genbank登录号nt_010783.14，自核苷酸2624000至2761000截短)。
[0636]
表1
[0637]
由靶向seq id no:1和2的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0638]
[0639][0640]
表2
[0641]
由靶向seq id no:3和4的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0642][0643]
实例2：由5
‑
10
‑
5moe间隔体对hepg2细胞中的人类τ蛋白的剂量依赖性反义抑制
[0644]
选择来自上述研究的展现显著活体外抑制τ蛋白mrna的间隔体并且在各种剂量下于hepg2细胞中加以测试。将细胞以每孔10,000个细胞的密度涂铺并且使用脂质转染试剂，用如下表中指定的12.5nm、25.0nm、50.0nm、100.0nm或200.0nm浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。在反义寡核苷酸处理的细胞中，τ蛋白mrna含量以剂量依赖性方式显著降低。
[0645]
表3
[0646][0647]
实例3：由5
‑
10
‑
5moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的反义抑制
[0648]
设计靶向τ蛋白核酸的另外的反义寡核苷酸并且活体外测试其对τ蛋白mrna的影响。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。使用电穿孔，用7,000nm反义寡核苷酸转染培养的sh
‑
sy5y细胞。在约24小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋
白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。
[0649]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑
10
‑
5moe间隔体。间隔体的长度为20个核苷，其中中心间隔段包含10个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在整个每个间隔体中的核苷间键为硫代磷酸酯键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。下表中所列的每个间隔体靶向在本文中指定为seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的人类τ蛋白基因组序列或靶向在本文中指定为seq id no:2(genbank登录号nm_001123066.3)的人类τ蛋白mrna序列。
‘
n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
[0650]
表4
[0651]
[0652]
[0653][0654]
表5
[0655]
[0656]
[0657][0658]
实例4：由5
‑
10
‑
5moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的剂量依赖性反义抑制
[0659]
选择来自上述研究的展现显著活体外抑制τ蛋白mrna的间隔体并且在各种剂量下在sh
‑
sy
‑
5y细胞中加以测试。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺并且使用电穿孔，用如下表中指定的1.25μm、2.50μm、5.00μm、10.00μm和20.00μm浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。在反义寡核苷酸处理的细胞中，τ蛋白mrna含量以剂量依赖性方式显著降低。
[0660]
表6
[0661][0662]
实例5：由5
‑
10
‑
5moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的反义抑制
[0663]
设计靶向τ蛋白核酸的另外的反义寡核苷酸并且活体外测试其对τ蛋白mrna的影响。将培养的sh
‑
sy5y细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺并且使用电穿孔，用6,000nm反义寡核苷酸转染。在约24小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。
[0664]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑
10
‑
5moe间隔体。间隔体的长度为20个核苷，其中中心间隔段包含10个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在整个每个间隔体中的核苷间键为硫代磷酸酯键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。’下表中所列的每个间隔体靶向在本文中指定为seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的人类τ蛋白基因组序列。
[0665]
表7
[0666]
[0667]
[0668]
[0669][0670]
实例6：由5
‑
10
‑
5moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的剂量依赖性反义抑制
[0671]
选择来自上述研究的展现显著活体外抑制τ蛋白mrna的间隔体并且在各种剂量下在sh
‑
sy
‑
5y细胞中加以测试。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.625μm、1.25μm、2.500μm、5.00μm、10.00μm和20.00μm浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理时期之后，自细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。在反义寡核苷酸处理的细胞中，τ蛋白mrna含量以剂量依赖性方式显著降低。
[0672]
表8
[0673][0674]
实例7：由具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的反义抑制
[0675]
设计靶向τ蛋白核酸的反义寡核苷酸并且活体外测试其对τ蛋白mrna的影响。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。使用电穿孔，用8,000nm反义寡核苷酸转染培养的sh
‑
sy5y细胞。在约24小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。
[0676]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑
10
‑
5moe间隔体。间隔体的长度为20个核苷，其中中心间隔段包含10个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在整个每个间隔体中的核苷间键为硫代磷酸酯键或磷酸二酯键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。
‘
化学’行描述每个寡核苷酸的核苷间键。
‘
s’指示硫代磷酸酯键并且
‘
o’指示磷酸二酯键。“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。
[0677]
下表中所列的每个间隔体靶向在本文中指定为seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的人类τ蛋白基因组序列、在本文中指定为seq id no:2(genbank登录号nm_001123066.3)或seq id no:3(genbank登录号nm_016841.4)的人类τ蛋白mrna序列。表10、12和16中呈现的若干寡核苷酸靶向在本文中指定为seq id no:5(genbank登录号dr002467.1)、seq id no:6(genbank登录号nm_001203251.1)或seq id no:7(genbank登录号nm_016835.4)的变异mrna序列。寡核苷酸是根据其以100％互补性靶向的主要基因序列呈现于各种表中。
‘
n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
[0678]
表9
[0679]
由靶向seq id no:1和3的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0680]
[0681][0682]
表10
[0683]
由靶向seq id no:5和6的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔
体对τ蛋白mrna的抑制
[0684][0685]
表11
[0686]
由靶向seq id no:1和3的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0687]
[0688]
[0689][0690]
表12
[0691]
由靶向seq id no:6和7的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0692][0693]
表13
[0694]
由靶向seq id no:1和3的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0695]
[0696]
[0697][0698]
表14
[0699]
由靶向seq id no:1和3的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0700]
[0701]
[0702][0703]
表15
[0704]
由靶向seq id no:1和3的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0705]
[0706][0707]
表16
[0708]
由靶向seq id no:5和6的具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔
体对τ蛋白mrna的抑制
[0709][0710]
实例8：由具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑
10
‑
5moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的剂量依赖性反义抑制
[0711]
选择来自上述研究的展现显著活体外抑制τ蛋白mrna的间隔体并且在各种剂量下在sh
‑
sy
‑
5y细胞中加以测试。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺并且使用电穿孔，用如下表中指定的1.25μm、2.500μm、5.00μm、10.00μm和20.00μm浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。在反义寡核苷酸处理的细胞中，τ蛋白mrna含量以剂量依赖性方式显著降低。
[0712]
表17
[0713][0714][0715]
表18
[0716][0717]
实例9：由5
‑
10
‑
5moe、5
‑8‑
5moe、4
‑8‑
6moe或6
‑8‑
4moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的反义抑制
[0718]
设计靶向τ蛋白核酸的反义寡核苷酸并且活体外测试其对τ蛋白mrna的影响。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。isis 613412也包括在分析中。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。使用电穿孔，用8,000nm反义寡核苷酸转染在每孔20,000个细胞的密度下的培养的sh
‑
sy5y细胞。在约24小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。
[0719]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑8‑
5moe、4
‑8‑
6moe或6
‑8‑
4moe间隔体。5
‑8‑
5moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。4
‑8‑
6moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由分别包含4个和6个核苷的翼段侧接。6
‑8‑
4moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由分别包含6个和4个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在下表中的整个每个间隔体(isis 613412除外)中，核苷间键基序为5
’‑
sooosssssssssooss
‑3’
，其中每个“s”代表硫代磷酸酯核苷间键并且其中每个“o”代表磷酸二酯核苷间键。isis 613412的核苷间键基序为5
’‑
soooossssssssssooss
‑3’
，其中每个“s”代表硫代磷酸酯核苷间键并且其中每个“o”代表磷酸二酯核苷间键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。下表中所列的每个间隔体靶向seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)、seq id no:4(genbank登录号nt_010783.14，自核苷酸2624000
至2761000截短)、seq id no:5(genbank登录号dr002467.1)或seq id no:6(genbank登录号nm_001203251.1)。
‘
n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
[0720]
表19
[0721]
由靶向seq id no:1和seq id no:4的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0722]
[0723]
[0724][0725]
表20
[0726]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0727]
[0728]
[0729][0730]
表21
[0731]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制1
[0732]
[0733]
[0734][0735]
表22
[0736]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0737]
[0738][0739]
表23
[0740]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0741]
[0742][0743]
表24
[0744]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0745]
[0746][0747]
表25
[0748]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0749]
[0750][0751]
表26
[0752]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0753]
[0754][0755]
表27
[0756]
由靶向seq id no:1的5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0757]
[0758][0759]
表28
[0760]
由靶向seq id no:1和2的5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0761]
[0762][0763]
表29
[0764]
由靶向seq id no:1和2的5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0765]
[0766][0767]
表30
[0768]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0769]
[0770][0771]
表31
[0772]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0773]
[0774][0775]
表32
[0776]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0777]
[0778][0779]
表33
[0780]
由靶向seq id no:5和6的5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0781][0782][0783]
表34
[0784]
由靶向seq id no:1和2的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0785]
[0786][0787]
表35
[0788]
由靶向seq id no:1和2的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0789]
[0790][0791]
表36
[0792]
由靶向seq id no:1和2的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0793]
[0794][0795]
表37
[0796]
由靶向seq id no:1和2的5
‑
10
‑
5moe和5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0797]
[0798][0799]
表38
[0800]
由靶向seq id no:1的5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0801]
[0802][0803]
表39
[0804]
由靶向seq id no:1的5
‑8‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0805]
[0806][0807]
实例11：对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的剂量依赖性反义抑制
[0808]
选择来自上述研究的展现显著活体外抑制τ蛋白mrna的间隔体并且在各种剂量下在sh
‑
sy5y细胞中加以测试。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.938μm、0.1.875μm、3.750μm、7.500μm和15.00μm浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测
量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。在反义寡核苷酸处理的细胞中，τ蛋白mrna含量以剂量依赖性方式显著降低。
[0809]
表40
[0810][0811]
表41
[0812]
[0813]
表42
[0814][0815]
表43
[0816][0817][0818]
表44
[0819][0820]
表45
[0821][0822]
表46
[0823][0824]
表47
[0825][0826]
实例12：由5
‑
10
‑
5moe、5
‑8‑
5moe、4
‑8‑
6moe或6
‑8‑
4moe间隔体对hepg2细胞中的人类τ蛋白的反义抑制
[0827]
设计靶向τ蛋白核酸的反义寡核苷酸并且活体外测试其对τ蛋白mrna的影响。在具
有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。isis 613412也包括在分析中。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。使用电穿孔，用8,000nm反义寡核苷酸转染在每孔20,000个细胞的密度下的培养的hepg2细胞。在约24小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。
[0828]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑8‑
5moe、4
‑8‑
6moe或6
‑8‑
4moe间隔体。5
‑8‑
5moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。4
‑8‑
6moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由分别包含4个和6个核苷的翼段侧接。6
‑8‑
4moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由分别包含6个和4个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在下表中的整个每个间隔体(isis 613412除外)中，核苷间键基序为5
’‑
sooosssssssssooss
‑3’
，其中每个“s”代表硫代磷酸酯核苷间键并且其中每个“o”代表磷酸二酯核苷间键。isis 613412的核苷间键基序为5
’‑
soooossssssssssooss
‑3’
，其中每个“s”代表硫代磷酸酯核苷间键并且其中每个“o”代表磷酸二酯核苷间键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。下表中所列的每个间隔体靶向在本文中指定为seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的人类τ蛋白基因组序列。
[0829]
表48
[0830]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5moe间隔体对τ蛋白mrna的抑制
[0831]
[0832][0833]
表49
[0834]
由靶向seq id no:1的5
‑
10
‑
5moe、5
‑8‑
5moe、4
‑8‑
6moe和6
‑8‑
4间隔体对τ蛋白
mrna的抑制
[0835]
[0836]
[0837][0838]
实例13：由moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的剂
[0839]
量依赖性反义抑制
[0840]
选择来自上述研究的展现显著活体外抑制τ蛋白mrna的间隔体并且在各种剂量下在sh
‑
sy5y细胞中加以测试。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.938μm、0.1.875μm、3.750μm、7.500μm和15.00μm浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。在反义寡核苷酸处理的细胞中，τ蛋白mrna含量以剂量依赖性方式显著降低。
[0841]
表50
[0842][0843]
表51
[0844][0845]
表52
[0846][0847]
表53
[0848][0849]
表54
[0850][0851]
表55
[0852][0853]
实例14：设计在人类τ蛋白的热点区具有硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键的5
‑7‑
6moe、5
‑8‑
5moe、5
‑9‑
5moe和5
‑
10
‑
5moe间隔体
[0854]
设计在以上研究中鉴定为
‘
热点’的区域靶向τ蛋白核酸的反义寡核苷酸。
[0855]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑7‑
6moe、5
‑8‑
5moe、5
‑9‑
5moe或5
‑
10
‑
5moe间隔体。5
‑7‑
6moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含7个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由分别包含5个和6个核苷的翼段侧接。5
‑8‑
5moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5
‑9‑
5moe间隔体的长度为19个核苷，其中中心间隔段包含9个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5
‑
10
‑
5moe间隔体的长度为20个核苷，其中中心间隔段包含10个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在整个每个间隔体中的核苷间键为硫代磷酸酯键或磷酸二酯键。
‘
化学’行描述每个寡核苷酸的核苷间键。
‘
s’指示硫代磷酸酯键并且
‘
o’指示磷酸二酯键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。
[0856]“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。下表中所列的每个间隔体靶向在本文中指定为seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的人类τ蛋白基因组序列或靶向在本文中指定为seq id no:2(genbank登录号nm_001123066.3)的人类τ蛋白mrna序列。
‘
n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
[0857]
表56
[0858]
靶向seq id no:1和2的moe间隔体
[0859]
[0860]
[0861]
[0862]
[0863]
[0864][0865]
实例15：在hτ小鼠中脑室内施用针对人类τ蛋白mrna的反义寡核苷酸
[0866]
通过在人类τ蛋白转基因小鼠中进行icv给药来测试所选化合物的功效(duff等人,neurobiology of disease 7:87
‑
98,2000)。
[0867]
治疗和手术
[0868]
用通过icv快速浓注递送的200μg剂量向各组4只小鼠施用isis 613255、isis 613329、isis 613344、isis 613361、isis 613369、isis 613370、isis 613397、isis 613045、isis 613099、isis 613118、isis 613136。类似地用isis 424880治疗对照组2只小鼠并且类似地用pbs治疗对照组4只小鼠。所有程序都在异氟烷麻醉下进行并且符合iacuc规章。对于小鼠icv快速浓注，将反义寡核苷酸注射至人类τ蛋白转基因小鼠的右侧脑室中。历经约10秒注射10微升含有300μg寡核苷酸的pbs溶液。在寡核苷酸施用之后14天收集组织。
[0869]
rna分析
[0870]
在寡核苷酸给药后第14天，从海马、脊髓和皮质提取rna以针对τ蛋白mrna含量进行实时pcr分析。使用人类引物探针组rts3104测量人类τ蛋白mrna含量。结果计算为相较于对照的人类τ蛋白mrna表达抑制百分比。所有反义寡核苷酸都达到显著抑制人类τ蛋白mrna含量的目的。
[0871]
表57
[0872]
hτ小鼠中的人类τ蛋白mrna含量降低百分比
[0873][0874]
实例16：5
‑7‑
6moe、5
‑8‑
5moe、5
‑9‑
5moe和5
‑
10
‑
5moe间隔体对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的反义抑制
[0875]
在具有类似培养条件的一系列实验中测试以上实例中所述的反义寡核苷酸以及新设计的靶向人类τ蛋白核酸的反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。使用电穿孔，用8,000nm反义寡核苷酸转染培养的sh
‑
sy5y细胞。在约24小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。
[0876]
下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5
‑7‑
6moe、5
‑8‑
5moe、5
‑9‑
5moe或5
‑
10
‑
5moe间隔体。5
‑7‑
6moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含7个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由分别包含5个和6个核苷的翼段侧接。5
‑8‑
5moe间隔体的长度为18个核苷，其中中心间隔段包含8个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5
‑9‑
5moe间隔体的长度为19个核苷，其中中心间隔段包含9个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5
‑
10
‑
5moe间隔体的长度为20个核苷，其中中心间隔段包含10个2
’‑
脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼段侧接。5’翼段中的每个核苷和3’翼段中的每个核苷具有2
’‑
moe修饰。在整个每个间隔体中的核苷间键为硫代磷酸酯键或磷酸二酯键。
‘
键化学’行描述每个寡核苷酸的核苷间键。
‘
s’指示硫代磷酸酯键并且
‘
o’指示磷酸二酯键。在整个每个间隔体中的所有胞嘧啶残基均为5
‑
甲基胞嘧啶。
[0877]“起始位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近5’的核苷。“终止位点”指示人类基因序列中由间隔体所靶向的最靠近3’的核苷。下表中所列的每个间隔体靶向在本文中指定为seq id no:1(genbank登录号nt_010783.15，自核苷酸9240000至9381000截短)的人类τ蛋白基因组序列或靶向在本文中指定为seq id no:2(genbank登录号nm_001123066.3)的人类τ蛋白mrna序列。
‘
n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
[0878]
表58
[0879]
[0880][0881]
表59
[0882]
[0883]
[0884][0885]
表60
[0886]
[0887]
[0888][0889]
表61
[0890]
[0891]
[0892][0893]
实例17：对sh
‑
sy5y细胞中的人类τ蛋白的剂量依赖性反义抑制
[0894]
选择来自上述研究的展现显著活体外抑制τ蛋白mrna的间隔体并且在各种剂量下在sh
‑
sy5y细胞中加以测试。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现于以下显示的单独的表中。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.247μm、0.741μm、2.22μm、6.67μm和20.00μm浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理时期之后，从细胞分离rna并且通过定量实时pcr测量τ蛋白mrna含量。使用人类引物探针组rts3104测量mrna含量。根据如通过测量的总rna含量调整τ蛋白mrna含量。结果呈现为相对于未处理对照细胞的τ蛋白抑制百分比。在反义寡核苷酸处理的细胞中，τ蛋白mrna含量以剂量依赖性方式显著降低。
[0895]
表62
[0896][0897]
表63
[0898][0899]
表64
[0900][0901]
实例18：在hτ小鼠中脑室内施用针对人类τ蛋白mrna的反义寡核苷酸
[0902]
通过在人类τ蛋白转基因小鼠中进行icv给药来测试所选化合物的功效(duff等人,neurobiology of disease 7:87
‑
98,2000)。
[0903]
治疗和手术
[0904]
用通过icv快速浓注的200μg剂量向各组4只小鼠施用isis 613099、isis 613361、isis 613370、isis 623782或isis 623996。类似地用isis 424880治疗对照组2只小鼠并且类似地用pbs治疗对照组4只小鼠。所有程序都在异氟烷麻醉下进行并且符合iacuc规章。对于小鼠icv快速浓注，将反义寡核苷酸注射至人类τ蛋白转基因小鼠的右侧脑室中。历经约10秒注射10微升含有200μg寡核苷酸的pbs溶液。在寡核苷酸施用后14天收集组织。
[0905]
rna分析
[0906]
在寡核苷酸给药后第14天，从海马、脊髓和皮质提取rna以针对τ蛋白mrna含量进行实时pcr分析。使用人类引物探针组rts3104测量人类τ蛋白mrna含量。结果计算为相较于对照的人类τ蛋白mrna表达抑制百分比。所有反义寡核苷酸在若干组织中都达到显著抑制人类τ蛋白mrna含量的目的。
[0907]
表65
[0908]
hτ小鼠中的人类τ蛋白mrna含量降低百分比
623782、isis 623996、isis 424880和isis 603054被良好耐受。
[0917]
表67
[0918]
hτ小鼠和野生型c57bl6小鼠中的icv体内研究
[0919][0920]
实例20：靶向人类τ蛋白的寡核苷酸的大鼠中的体内分析
[0921]
将sprague dawley大鼠分组，每组4只大鼠。向大鼠组中的每只大鼠施用单次1mg鞘内(it)剂量或单次3mg鞘内(it)剂量的isis 613099、isis 613361、isis 613370、isis 623782、isis 623996、isis 424880或isis 603054。注射后3小时，针对每个大鼠，评估身体7个不同部位的动作。7个身体部位为(1)大鼠的尾部；(2)大鼠的后部位；(3)大鼠的后肢；(4)大鼠的后爪；(5)大鼠的前爪；(6)大鼠的前部位和(7)大鼠的头部。针对7个不同身体部位中的每一个，给予每个大鼠子分数，如果身体部位移动，则子分数为0或者如果身体部位瘫痪，则子分数为1。在评估7个身体部位中的每一个后，总计每个大鼠的子分数并且然后针对每组进行平均。例如，如果施用3mg it剂量后3小时，大鼠的尾部、头部和所有其他评估的身体部位移动，它将获得总计为0的分数。如果另一大鼠在3mg it剂量后3小时不移动其尾部但所有其他评估的身体部位移动，它将获得1分。盐水处理的大鼠通常获得0分。范围顶端处的分数提示毒性。结果在下表68中呈现为每个处理组的平均分。
[0922]
表68
[0923]
体内研究中1mg和3mg it快速浓注
[0924]