一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒及其检测方法与流程

：
1.本发明属于核酸检测技术领域，特别涉及一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，及其检测方法。


背景技术：

2.子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，也是目前唯一一个病因明确的恶性肿瘤。根据世界卫生组织统计，在全球范围内，2018年估计有57万例新病例，占所有女性癌症死亡人数的7.5％。在每年估计超过31.1万例死于宫颈癌的死亡中，其中超过85％发生在欠发达地区。在发达国家，已经实施了一些方案，女性可以接受针对人乳头瘤病毒的疫苗接种，并可以对妇女进行定期筛查。筛查可以在易于治疗的阶段识别出癌前病变。在这些国家，早期治疗可预防多达80 ％的宫颈癌。
3.人乳头瘤病毒(hpv)是一种主要存在于人皮肤、黏膜及女性宫颈上皮细胞异形区的微小共价双链环状dna病毒，至今发现的hpv约有200多种，为一组形态和基因结构相似，但致瘤表现不同的病毒，可引起人类上皮的良性和恶性肿瘤。1995年国际癌症研究机构(iarc)正式宣布hpv某些型别持续性感染是导致宫颈癌的最主要因素。who把与宫颈癌发生有关的hpv型别称为高危型，与肿瘤不相关的称为低危型，最常见的低危型为hpv 6,11和81。依据iarc及其它研究成果，包括国家食品药品监督管理局hpv相关指导原则建议与宫颈癌相关的型别中hpv 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68列为高危型别，hpv26，53，66，73，82列为中等风险型别。
4.研究提示在宫颈癌的发生中16、18、31、33等高危型的致癌性远远高于其他型别。70％以上的宫颈癌患者体内均发现感染hpv16或18型，不同型别的致癌性有所差异，如：hpv16见于50％的宫颈癌(多为鳞癌)；hpv18见于15％的宫颈癌(多为腺癌和神经内分泌癌)。美国阴道镜和宫颈病理学会将16和18型阳性列为病理学检测指症。hpv病毒载量，作为与感染细胞数和病毒数两者相关的参数，主要受两大因素的影响：hpv在宫颈表面感染程度和感染区域病毒量水平。病毒载量被认为是中度宫颈上皮内瘤变(cinⅱ)或更高级别的宫颈上皮内瘤变的潜在生物指征。尤其是病毒载量的持续监测而非单次测量是宫颈癌的发生发展的有效标志之一。
5.hpv感染是宫颈癌的直接病因。就大多数患者而言，从感染到最终宫颈癌的发生存在一个缓慢的潜伏期。为此，及时定期检测宫颈脱落细胞中hpv的有无及载量的变化在宫颈癌的早期筛查、辅助诊断和愈后评估等环节中显得尤为重要。
6.鉴于此，本发明提出了一种基于荧光定量pcr法的快速分型定量检测18种高、中危型别的试剂盒，能够实现双管内同时检测18种hpv型别，并能够满足较高的灵敏度，对其中风险级别高的型别进行分型和定量分析，在通过配套软件对检测结果进行综合风险评分，具有明确的临床意义及潜在的应用价值。
7.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，可以应用于宫颈癌筛查流程的风险分层，试剂盒检测包含与宫颈癌发生发展相关的18种高、中危型别，其中根据不同型别的风险等级可以对hpv6、18、31、33、52、58进行分型和定量分析，对除了以上6种型别以外的其它型别进行定量分析，最终通过配套分析软件对检测结果进行综合风险评分，用于风险分层。
9.为实现上述目的，本发明提供了一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，用于hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv52、hpv58进行分型和定量分析、以及除以上6种型别以外其他型仅进行定量分析，其特征在于：包括：核酸扩增反应液、hpv
‑
a组反应液、hpv
‑
b组反应液、阳性对照、弱阳性对照、阴性对照；
10.核酸扩增反应液主要由2
×
pcr缓冲液、终浓度2～4mmmgcl2、0.05
‑
0.5mmdntps(datp：dttp：dctp：dgtp：dutp＝1:1:1:1:1)、1～2udna聚合酶、0.05～0.1uung酶及去rna酶水组成；
11.hpv
‑
a组反应液和hpv
‑
b组反应液包括了如seqidno.1至seqidno.34的引物探针；
12.所述阳性对照和弱阳性对照主要组分为不同浓度的人工合成的基因、c33a人宫颈癌细胞系dna、10mmtris(ph7.4)、1mmedta、5mg/ml海藻糖；
13.所述阴性对照主要组分为c33a人宫颈癌细胞系dna、10mmtris(ph7.4)、1mmedta、5mg/ml海藻糖。
14.该试剂盒反应体系的灵敏度确定为200copies/ml，其感染单位的绝对偏差不超过
±
0.5个对数数量级。
15.该试剂盒能够进行18种高/中危型的定型检测，涵盖了宫颈癌发生发展相关的最常见型别，根据大量筛查临床试验数据优选致癌性最高的7种型别进行分型和定量分析，对剩余型别进行定性和综合定量分析；分析灵敏度均高于以上对比文献，序列进行了优先，体系进行大量优化工作；配套用系统分析软件，对上述结果进行综合评分，获得进一步风险预警。
16.优选地，上述技术方案中，探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自fam、hex、vic、tet、tamra、rox、cy3.5或cy5中的任意一种或几种；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl和mgb中的任意一种或几种。
17.一种利用前文描述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒核酸的定量检测方法，采用实时荧光pcr技术和水解探针技术，主要以人乳头瘤病毒基因组l1、e7等区为靶区域，设计监测18个型别的引物和探针，其中包含型别特异性引物探针和通用型引物探针，分别以fam、vic/hex、rox、cy5等基团标记相应探针，在同一反应体系中可一次性定性检测18种型别人乳头瘤病毒及采集样本的细胞数，样本中宫颈脱落细胞数的获取通过参考基因与待测细胞的线性关系获得。
18.优选地，上述技术方案中，根据权利要求3所述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒核酸的定量检测方法，其特征在于：将配制的pcr反应液加好检测模板后放置于荧光定量pcr仪器中进行检测，实验检测程序具体为：ung酶处理50℃5min；95℃10min预变性；变性、退火、延伸及检测荧光条件为：95℃10s，58℃30～40s，45cycles，58℃时荧光检测，反应体系配
置方法为：10～20μl 核酸扩增反应液，10～20μl引物探针反应液，5～20μl待测样本核酸。。
19.优选地，上述技术方案中，基于不同型别致癌性的差异，其病毒载量的权重也不一，根据其它研究提示以及在中国境内开展的中国人群为基础的atina研究，该研究通过对常规需要宫颈癌筛查的受试者进行hpv分型定量检测，可横断面及纵向三年受试者随访观察hpv不同的致癌型别及病毒载量的高低与宫颈癌病变程度及进程的关系。以阴道镜检查和/或组织病理学检查结果为金标准，明确不同型别在宫颈癌发生发展中的绝对风险值和相对风险值，用绝对风险值乘以相对风险值从而得到型别所属的权重值x。该项目随机纳入约13000例适龄妇女，分别在山东大学齐鲁医院、浙江大学医学院附属妇产科医院、河南省人民医院开展研究工作。
20.编号型别权重1hpv1610～10000x2hpv1810～1000x3hpv31、33、52、58x4others(除以上6种的其它型)0.0001～10x
21.表格中权重的x为绝对风险值，x前的数值为相对风险值。
22.优选地，上述技术方案中，绝对风险值和相对风险值计算方式如下表2和表3：
23.表2，
[0024][0025]
表3，
[0026][0027]
本发明的试剂性能验证如下：因暂无人乳头状瘤病毒体外培养技术，无法获得稳
定的病毒株,因而主要采用hpv16、18型国际标准品、hpv18种型别重组特异性片段的质粒及临床样本进行分析性能评估。性能评估包括最低检测限、 hpv分型准确度、hpv16型定量准确度、线性范围、特异性、干扰物质、精密度评价等。
[0028]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0029]
本发明基于荧光定量pcr法，快速分型定量检测18种高、中危型别的试剂盒，能够实现双管内同时检测18种hpv型别，并能够满足较高的灵敏度，对其中风险级别高的型别hpv16、18、31、33、52、58进行分型和定量分析，除以上6种型别以外其它型别进行定量分析，不涉及具体分型，再通过配套软件对检测结果进行综合风险评分。综合评分系统的hpv型别参数基于大量临床试验数据对不同型别的风险级别进行分层进行设置，与此同时，参考基因可以作为内标对照监控仪器故障、试剂因素、操作不当或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果。该方法灵敏度高、通量大，可以解决临床使用中通过载量分析进行宫颈癌筛查中进一步的人群分流。
附图说明：
[0030]
图1为hpv16型的阳性参考品检测示意图。
[0031]
图2为hpv16型的特异性检测示意图。
[0032]
图3为hpv16型的灵敏度曲线示意图。
[0033]
图4为细胞学结合hpv联合筛查示意图；
[0034]
图5为hpv初筛伴16/18分型结合细胞学分流的策略；
[0035]
图6为hpv初筛16/18分型结合病毒载量评分系统分流的策略。
具体实施方式：
[0036]
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0037]
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
[0038]
实施例1特异性引物和探针的设计
[0039]
通过ncbi搜索下载hpv不同型别的全基因组或者l1、e7等区基因序列，进行序列比对后利用beacon designer或primer 3软件，分别设计上述病原体的特异性扩增引物和分子信标或taqman探针，由上海硕颖生物科技有限公司合成。用于检测的引物及探针如下表4所示：
[0040]
表4引物及探针序列信息
[0041][0042]
[0043]
实施例2样本核酸提取
[0044]
1.样本类型：宫颈脱落细胞
[0045]
2.样本的采集：
[0046]
使用宫颈采样拭子置于宫颈口采集宫颈脱落细胞，将刷子平行插入子宫内，使刷子中部刷毛轻轻的深插入子宫颈管内，以便较短的刷毛能够完全接触到外子宫颈，用手轻轻固定，柔和地向前抵住采样器，然后将采样器向同一方向转 5～10圈。慢慢取出采样器，将其放入专用细胞保存液中，反复的将扫帚状采样器推入瓶底，上下涮洗10次左右，最后在溶液中快速的转动扫帚状采样器以进一步的将细胞样本漂洗下来。弃掉采样器，拧紧瓶盖，密闭送检。
[0047]
3.样本保存和运输
[0048]
样本采集后应及时检测，2
‑
30℃保存6个月内完成检测，
‑
20
±
5℃保存不超过12个月，
‑
70℃以下长期有效。避免反复冻融样本，冻融次数不能超过5 次，2
‑
30℃运输不能超过7天。
[0049]
4.核酸提取
[0050]
样本核酸提取采用qiagen公司的viral rna mini kit试剂盒或者江苏硕世生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂，按照说明书进行核酸提取。
[0051]
实施例3对提取的样本核酸进行检测
[0052]
按照上述浓度进行扩增反应体系的配制，按照以下程序进行pcr循环参数设定(参照仪器的操作说明进行设置)
[0053]
表5 pcr循环参数
[0054][0055][0056]
实施例4性能评价
[0057]
1.特异性分析
[0058]
采用本发明方法对与人乳头状瘤病毒感染部位相同、症状相似的病原体及试剂盒检测范围之外的人乳头状瘤病毒来验证试剂盒的特异性。细菌的浓度为 106cfu/ml，病毒的浓度为105pfu/ml；hpv40、hpv42、hpv43和hpv44的浓度为 106copies/ml。检测表6中病原体结果显示，均未见明显s型扩增曲线，且结果呈阴性，因此上述病原体在研究的浓度范围内对试剂盒的检测不会产生干扰。
[0059]
表6病原体名称
[0060][0061]
2.灵敏度分析
[0062]
采用经过浓度标定的阳性参考品进行梯度稀释确定本试剂盒的灵敏度。将 hpv阳性参考品按要求进行梯度稀释后取1
×
106copies、1
×
105copies、 1
×
104copies、1
×
103copies、1
×
102copies的浓度梯度共5个浓度梯度对反应体系的灵敏度进行确定，每个浓度梯度重复检测20次，总检测次数为60次。采用ssps软件对数据进行probit分析，当病毒样本的阳性检出率≥95％时的浓度即为试剂盒的最低检出限。另外，采用18个hpv国家标准品进行梯度稀释至最低检测限浓度(200copies/ml)，每个浓度5份，每份重复检测20次，总检测次数为100次，以验证本试剂盒反应体系的灵敏度。本研究对反应体系的灵敏度进行验证，对实验结果进行统计分析，浓度为200copies/ml的18个hpv 国家标准品检出率分别都大于95％。因此本试剂盒反应体系的灵敏度确定为 200copies/ml。
[0063]
定量准确度(以hpv16型为例)：分别对hpv16型定量准确度、参考基因定量准确度以及hpv16型感染单位进行验证，采用hpv16型国际标准品 (1
×
107iu/ml)使用本试剂盒进行定量检测来确定hpv16型定量准确度；将人白细胞采用细胞计数器进行计数，收集的106人白细胞样本采用试剂盒进行定量检测来确定参考基因定量准确度；将浓度为104copies/ml的hpv16型定量参考品(以浓度为104copies/ml参考基因背景)使用本试剂盒进行定量检测，来确定hpv16型感染单位准确度。
[0064]
以上量值进行测定后，按照b＝m
‑
t公式(b
‑
绝对偏差；m
‑
测试结果均值； t
‑
参考物质标示值)进行计算。绝对偏差均不超过
±
0.5个对数数量级为量值准确度的标准。
[0065]
分别对hpv16型定量准确度、参考基因定量准确度以及hpv16型感染单位(感染单位(拷贝数/10000细胞))量值测定结果，实验结果表明，使用试剂盒对 hpv16型国际标准品以及参考基因的浓度的绝对偏差均不超过
±
0.5个对数数量级，使用试剂盒对hpv16型定量参考品的检测，其感染单位的绝对偏差不超过
±
0.5个对数数量级，符合试剂盒性能要求。
[0066]
实施例5风险评分系统
[0067]
对上述约13000例受试者进行基线期hpv和细胞学筛查后，后续进行阴道镜以及组织病理学检查，仅对基线期数据进行分析，在宫颈癌筛查流程中，病毒载量评分系统能显著提高基线期hsil(高级别鳞状上皮内病变)的检出率。具体如下表所示：
[0068]
1)联合筛查策略：细胞学结合hpv联合筛查如图4所示。
[0069]
2)hpv初筛策略：hpv初筛伴16/18分型结合细胞学分流的策略如图5所示。
[0070]
3)硕世分型定量策略：hpv初筛16/18分型结合病毒载量评分系统分流的策略如图6所示。
[0071]
表7不同筛查策略的hsil检出率
[0072]
筛查策略hsil检出数量基线期hsil漏诊率联合筛查策略5753.3％hpv初筛策略9720.5％硕世分型定量策略1128.2％
[0073]
，从上表不难看出采用本技术修正过的策略筛选获得的漏检率远低于目前常规的筛选漏诊率。
[0074]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。