一种肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物及在抗结核疫苗中的应用的制作方法

1.本发明属于抗结核糖疫苗技术领域，具体涉及一种肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物、所述寡糖缀合物的制备方法及所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物在制备抗结核糖疫苗中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.结核杆菌(mycobacterium tuberculosis)是引发人类结核病的病原体，它可通过呼吸道、消化道或者破损的皮肤粘膜侵入人体，可引发多组织、多器官患结核病，其中以肺结核为主。面对结核杆菌耐药菌株的大量出现、艾滋病例的增长、免疫抑制剂的使用以及人口流动日益增长等现状，全球范围内的结核病疫情不断恶化，成为全球尤其是发展中国家最为严重的公共卫生问题(n.engl.j.med.2007,356:656.)。
4.目前，控制结核病的方式主要以药物治疗为主，利福平、异烟肼、链霉素、吡嗪酰胺等抗生素是一线抗结核药物，但抗生素治疗周期较长，会对患者的免疫系统和机体造成损伤，还在一定程度上增加了病菌的耐药性(nat.rev.mol.cell biol.2001,2:569.)。免疫预防可以克服上述缺点，但同样存在较大缺陷。作为临床上唯一预防结核病的疫苗，卡介苗(bacille calmette-guerin,bcg)可以诱导婴幼儿产生较强的免疫保护效应，显著降低婴幼儿的发病率，但对于成年人以及耐药结核病患者的预防与治疗是几乎无效的，此外，对于免疫缺陷的儿童，bcg还可引发不良反应，严重时可致死(trends microbiol.2008,16:456.)。综上所述，研究开发安全、有效的新型结核疫苗是国内外学者亟需攻克的一项难题。
5.糖疫苗是糖类药物研究领域的热门方向之一，细菌表面的天然糖抗原是研制相关糖疫苗的理想靶标分子(nat.rev.drug discov.2010,9:308)。然而，天然多糖-蛋白结合疫苗具有结构不均一、制备重现性低、易被热源性物质污染等缺点，相比之下，近年来人们发展了一种有效的疫苗合成策略：基于天然病菌表面多糖结构，设计并化学合成结构明确的糖半抗原，进而将其与具有免疫原性的载体共价偶联得到半合成/全合成糖蛋白疫苗，基于此策略研发的b型流感嗜血杆菌疫苗已成功应用于临床。
6.脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,lam)是结核杆菌细胞表面大量表达的高度保守的糖脂分子，是结核杆菌重要的毒力因子和特异性抗原。lam分子包含三种特征性结构模块，即甘露聚糖、阿拉伯聚糖和磷酸酯化肌醇，分子通过磷酸化脂肪链锚定在细胞表面。由于lam分子量较大，筛选其中具有抗原活性的片段作为半抗原有望得到免疫效果良好的疫苗。研究表明，lam非还原端的阿拉伯寡糖片段能够促进宿主体内巨噬细胞中有机体的存活，当片段缺失或被修饰时，lam相关的免疫原性会降低甚至消失(mol.microbiol.2004,53:391.)。此外，部分课题组对lam分子的生物免疫活性进行了研究报道，例如：svenson等将分离得到的不同分子量的脱脂lam寡糖片段与破伤风类毒素tt和白喉毒素无毒变异体
crm
197
等载体蛋白共价偶联，动物免疫实验表明，上述合成的糖蛋白缀合物均具有较强免疫原性，可使兔血清中t细胞依赖的特异性igg抗体滴度显著升高(vaccine 1999,17:2853.)；seeberger课题组在高效合成一系列lam还原端分子pim1-pim6的基础上，利用合成分子中的巯基与钥孔血蓝蛋白klh偶联以制备糖蛋白缀合物，小鼠免疫结果显示，合成的pim-klh糖蛋白缀合物具有较强免疫原性(j.am.chem.soc.2008,130:16791.)；bundle和guo课题组分别发现基于lam非还原端结构所合成的阿拉伯寡糖和阿拉伯甘露寡糖具有开发为相关糖蛋白疫苗的可行性(bioconjugate chem.2014,25:685；j.org.chem.2015,80:10060.)。基于以上研究表明，以lam分子及其结构片段作为糖抗原用于结核杆菌糖蛋白疫苗的研发具有较大潜力。


技术实现要素：

7.基于上述研究背景，本发明目的在于一种性能更优的抗结核糖疫苗，基于结核杆菌表面的lam分子结构，设计并合成一系列结构明确的肌醇阿拉伯甘露寡糖分子。利用连接臂将寡糖分子与具有免疫原性的载体(蛋白或糖脂)进行偶联，得到全合成/半合成的肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物，随后将糖缀合物制备成可使用的剂型，进行免疫学研究，筛选并确定抗结核病糖疫苗候选物。经筛选，本发明得到一系列具有良好免疫效果的寡糖缀合物，基于上述技术效果，本发明提供下列技术方案：
8.本发明第一方面，提供一种肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物，其特征在于，包括如下式(i)所示结构：
[0009][0010]
经本发明验证，上述lam寡糖片段中，包括：α-(l
→
5)、α-(l
→
3)和β-(l
→
2)键接的阿拉伯聚糖、α-(1
→
2)和α-(1
→
6)链接的甘露聚糖以及lam还原端双甘露糖化肌醇模块，与天然lam聚糖的相似程度高，涵盖了更多的抗原活性片段，与免疫载体连接后能够激起t细胞响应的机体免疫反应，有望克服现有抗结核疫苗只适用于婴幼儿，无法对成人起效的缺陷。另外，上述寡糖与多种免疫载体进行连接均可以得到良好的载糖效果，技术人员可依据
经济成本、使用需求等目的进行常规选择。
[0011]
基于此，本发明第二方面，提供所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物的制备方法，所述制备方法包括活化所述肌醇阿拉伯甘露寡糖，将活化后的肌醇阿拉伯甘露寡糖与免疫载体连接得到。
[0012]
所述制备方法采用含双酯基结构的交联剂对寡糖片段和免疫载体进行共价偶联，在室温条件下即可完成偶联反应，并且后处理工艺简单。该制备方法应用于实际工业生产易于执行和推广，并且具有较高的安全性。
[0013]
本发明第三方面，提供所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物在制备抗结核疫苗中的应用。
[0014]
基于本发明的研究结果，上述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物注射至机体内能够刺激机体产生t细胞依赖的免疫反应，提高机体对结核杆菌的免疫能力。基于本领域的常规研究思路，所述寡糖缀合物可应用于抗结核疫苗的制备，包括用于结核疾病的预防及治疗。
[0015]
应用于结核疾病预防的方案中，还包括将上述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物与其他类型抗结核疫苗或抵抗其他病原体的疫苗共同作为联合疫苗使用。
[0016]
本发明第四方面，提供一种抗结核疫苗，其特征在于，所述抗结核疫苗中包括第一方面所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物的溶液及注射佐剂。
[0017]
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
[0018]
1.本发明基于lam分子结构设计得到了一种包含阿拉伯寡糖、甘露寡糖及双甘露糖化肌醇模块的lam寡糖片段，与天然lam分子更为相似，对天然lam聚糖的抗原性具有较高程度的还原。肌醇阿拉伯甘露寡糖抗原与免疫载体偶联制备的寡糖缀合物疫苗，结构新颖，尚无文献报道，对基于lam分子设计糖疫苗具有启示意义。
[0019]
2.本发明得到的肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物作为疫苗能够刺激机体产生t细胞依赖的免疫反应。经动物模型验证，所述糖缀合物诱导小鼠产生的免疫反应中包括igg1，igg2a，igg2b及igg3等多种igg类型抗体，并且kappa含量可达到较高水平，基于该研究结果可以推至，所述糖缀合物作为疫苗能够对幼儿和成人均具有长久的免疫效果，有望成为一种临床效果良好的抗结核疫苗。
附图说明
[0020]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0021]
图1为实施例1中肌醇阿拉伯甘露寡糖-crm197缀合物4的免疫原性抗体滴度图。
具体实施方式
[0022]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0023]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0024]
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物及所述寡糖缀合物在制备抗结核疫苗中的应用。
[0025]
本发明第一方面，提供一种肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物，其结构如下式(i)所示：
[0026][0027]
优选的，所述式(i)中，a、b、n均为整数。
[0028]
优选的，所述连接臂为连接寡糖与免疫载体的化学基团，所述化学基团中包括但不限于亚甲基、羰基及亚氨基；进一步优选的，所述连接臂为如下式(ⅱ)中的任意一种：
[0029][0030]
其中，c为1≤c≤15的整数，d为1≤c≤15的整数。
[0031]
优选的，所述免疫载体为增强寡糖抗原免疫原性的大分子物质，更为优选的，为具
有抗原性的蛋白或糖脂。
[0032]
具体的，所述免疫载体选自牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)、兔血清白蛋白(rsa)、卵清白蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、破伤风类毒素(tt)、白喉类毒素(dt)、白喉毒素无毒突变体(crm
197
)、脱毒后的绿脓杆菌毒素a、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、单磷酰脂质a(mpla)、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原或轮状病毒vp7蛋白中的任意一种。
[0033]
上述免疫载体为本领域常见的糖疫苗载体，其毒性及免疫原性均为公知技术，制备方式采用本领域常规偶联方式进行制备，实际生产中，技术人员可以依据。
[0034]
在上述优选方案的一个具体的实施方式中，所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物结构如下式(iii)所示：
[0035][0036]
在上述优选方案的又一个具体的实施方式中，所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物结构如下式(iv)所示：
[0037]
[0038]
本发明第二方面，提供第一方面所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物的制备方法，所述制备方法包括活化所述肌醇阿拉伯甘露寡糖，将活化后的肌醇阿拉伯甘露寡糖与免疫载体连接得到。
[0039]
优选的，所述活化方式如下：将肌醇阿拉伯寡糖与交联剂置于混合缓冲盐溶液中反应得到。
[0040]
进一步优选的，所述交联剂为包含双酯基的化合物，双酯基分别用于连接寡糖中的氨基及免疫载体中的氨基基团。
[0041]
上述优选的技术方案的具体实施方式中，所述交联剂为双琥珀酰亚胺戊二酸酯或3,4-二乙氧基-3-环丁烯-1,2-二酮。
[0042]
进一步优选的，所述混合缓冲液溶液为有机溶剂和磷酸盐缓冲溶液的混合溶液。
[0043]
所述有机溶剂用于增加原料在溶剂体系中的溶解程度，在一些实施方案中，所述有机溶剂可以采用二甲基甲酰胺或低元醇，出于降低毒性的考虑，所述低元醇优选为乙醇。
[0044]
进一步优选的，所述活化后还包括纯化所述活化后肌醇阿拉伯甘露寡糖的步骤，所述纯化采用柱分离方式。
[0045]
在更为具体的实施方式中，所述柱分离采用葡聚糖凝胶柱，以水为洗脱液进行洗脱分离。
[0046]
优选的，所述将活化后的肌醇阿拉伯甘露寡糖与免疫载体连接方式如下：将活化后的肌醇阿拉伯甘露寡糖与免疫载体置于磷酸盐缓冲液进行反应，反应结束后纯化得到产物得到所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物。
[0047]
进一步优选的，所述反应时间为3～5天。
[0048]
进一步优选的，所述反应温度为室温条件。
[0049]
进一步优选的，所述纯化采用分子筛及透析结合的方式进行纯化。
[0050]
上述优选方案的具体实施方式中，所述分子筛柱采用磷酸盐缓冲液洗脱。
[0051]
上述优选方案的具体实施方式中，所述透析采用蒸馏水对反应溶液进行透析。
[0052]
本发明第三方面，提供第一方面肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物在制备抗结核疫苗中的应用。
[0053]
优选的，所述抗结核疫苗为上述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物的注射剂形式或所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物注射剂与其他抗结核药物的联合使用的形式。
[0054]
在上述联合使用的具体实施方式中，所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物作为一种增强免疫活性成分，占所述药物活性成分含量的1～99％。
[0055]
在上述联合使用的具体实施方式中，所述药物中还包括药学上所必需的辅料。
[0056]
本发明第四方面，提供一种抗结核疫苗，所述抗结核疫苗中包括第一方面所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物的溶液及注射佐剂。
[0057]
优选的，所述抗结核疫苗为注射剂；具体的，为皮下注射剂、肌肉注射剂或静脉注射剂。
[0058]
优选的，所述抗结核疫苗为一种联合疫苗，为所述肌醇阿拉伯甘露寡糖缀合物与其他类型疫苗的联合制剂。
[0059]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0060]
实施例1
[0061]
本实施例中，提供一种lam寡糖片段制备的寡糖缀合物及所述寡糖缀合物作为抗结核疫苗的免疫原活性验证说明，所述lam寡糖片段结构如下式1所示，由糖化学定制合成公司合成。
[0062][0063]
一、寡糖的活化
[0064][0065]
将化学合成的肌醇阿拉伯甘露寡糖片段1(10.0mg，4.6μmol)和3,4-二乙氧基-3-环丁烯-1,2-二酮(3.5μl，23.9μmol)溶于乙醇(etoh)和磷酸盐缓冲溶液(pbs buffer，50mm，ph＝7.3)的混合液(v/v 1:1,1.5ml)中，反应液室温搅拌24小时，减压旋蒸，除去溶剂，所得混合物经葡聚糖凝胶柱(型号：g-15，洗脱液：h2o)分离纯化，得到寡糖片段2(8.5mg，81％)。
[0066]
二、寡糖-klh缀合物的制备
[0067]
按照1:1的质量比取活化的肌醇阿拉伯甘露寡糖2(3.0mg)和klh蛋白(寡糖/蛋白＝1/1)溶于磷酸盐缓冲溶液(pbs buffer，0.1m，ph＝8.0，0.5ml)，反应液室温搅拌4天，用分子筛柱(biogel a0.5，磷酸盐缓冲溶液洗脱，0.1m，ph＝8.0)除去未反应的小分子物质，所得样品溶液用蒸馏水透析5次，除去无机盐，收集蛋白水溶液冻干得肌醇阿拉伯甘露寡糖-klh缀合物3。使用硫酸-苯酚法(参考方法：医药导报，2008,12:1511)计算缀合物的载糖率为8.3％。
[0068][0069]
实施例2寡糖-crm
197
缀合物
[0070]
一、寡糖-crm
197
缀合物的制备
[0071]
采用实施例1中所述寡糖2，按照1:2的质量比取活化的寡糖2(3.0mg)和crm
197
蛋白(寡糖/蛋白＝1/2)溶于磷酸盐缓冲溶液(pbs buffer，0.1m，ph＝8.0，0.5ml)，反应液室温搅拌3天，用分子筛柱(biogel a0.5，磷酸盐缓冲溶液洗脱，0.1m，ph＝8.0)除去未反应的小分子物质，所得样品溶液用蒸馏水透析5次，除去无机盐，收集蛋白水溶液冻干得肌醇阿拉伯甘露寡糖-crm
197
缀合物4。用硫酸-苯酚法计算缀合物的载糖率为8.1％。
[0072][0073]
二、肌醇阿拉伯甘露寡糖-crm
197
缀合物4的免疫活性研究：
[0074]
肌醇阿拉伯甘露寡糖-crm
197
缀合物4的免疫活性测试在balb/c型雌鼠上进行，将制备得到的寡糖-crm
197
缀合物4(约2.7mg，根据crm
197
缀合物的糖含量计算其中寡糖的含量，每只老鼠每次注射约3μg寡糖抗原，每组免疫6只老鼠)分别溶于0.3ml 10
×
pbs缓冲溶液中，随后加水稀释形成1.5ml 2
×
pbs溶液(6μg/100μl)。将寡糖-crm
197
缀合物的pbs溶液分别与1.5mlgold免疫佐剂充分混合成乳液，待用。通过皮下注射的方式在第1、14、21、28天将0.1ml的乳液注射到小鼠体内，依次完成初次免疫与加强免疫。分别在免疫前的第0天和免疫后的第22和29天对小鼠进行取血操作，以相应的寡糖-bsa缀合物为捕获抗原，通过酶联免疫吸附实验(elisa)测定血液样品中的抗体滴度。肌醇阿拉伯甘露寡糖-crm
197
缀合物4的elisa实验结果如图1所示。图中kappa代表实验体针对糖蛋白缀合物产生的免疫球蛋白中轻链为kappa的免疫球蛋白；igm代表实验体针对糖蛋白缀合物产生的免疫球蛋白中重链为μ的免疫球蛋白；igg1、igg2a、igg2b和igg3为实验体针对糖蛋白缀合物产生的免疫球蛋白中重链为γ的免疫球蛋白的不同亚型。
[0075]
小鼠经糖缀合物4免疫后，血液中的抗体滴度显著增高，其中igg1和igg2b抗体滴
度占比较高，表明糖缀合物4诱导小鼠产生的免疫反应是t细胞参与的，该免疫反应能够使宿主细胞产生长久性免疫记忆，进而起到抗结核杆菌感染的作用。上述动物免疫实验表明肌醇阿拉伯甘露寡糖蛋白缀合物是一种有应用前景的预防结核病的糖疫苗。
[0076]
实施例3寡糖-bsa缀合物
[0077]
采用实施例1中制备的寡糖2，按照1:2的质量比取活化的寡糖2(3.0mg)和bsa蛋白(寡糖/蛋白＝1/2)溶于磷酸盐缓冲溶液(pbs buffer，0.1m，ph＝8.0，0.5ml)，反应液室温搅拌4天，用分子筛柱(biogel a0.5，磷酸盐缓冲溶液洗脱，0.1m，ph＝8.0)除去未反应的小分子物质，所得样品溶液用蒸馏水透析5次，除去无机盐，收集蛋白水溶液冻干得肌醇阿拉伯甘露寡糖-bsa缀合物5。用硫酸-苯酚法计算缀合物的载糖率为8.3％。
[0078][0079]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。