四价抗体药物偶联物及其应用的制作方法

四价抗体药物偶联物及其应用
1.交叉引用
2.本技术要求2020年4月11日提交的美国临时申请63/008,726的优先权，其全文通过引用并入本文。
3.本技术要求2020年4月29日提交的美国专利申请16/862,042的优先权，其全文通过引用并入本文。
4.序列表引用
5.本技术包含以ascii形式通过efs
‑
web提交的序列表，其名称为“bliss001us_st25.txt”，大小为108kb，在2020年4月27日生成，序列表的全文通过引用并入本文。


背景技术：

6.抗体是抵抗外来病原体的关键免疫分子。单克隆抗体(monoclonal antibody,mab)技术的发展使单克隆抗体在疾病的研究、诊断和治疗中得到了广泛的应用。第一代mab(主要是单特异性、二价mab)的治疗用途在多种疾病(包括癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病)的治疗中取得了成功。但是，许多疾病(例如实体瘤)已显示出对基于抗体的疗法较强的抗性。
7.为了提高效价、改善安全性并获得mab的非天然特性，已开发出修饰的、具有多价特性的新形式的mab。例如，已经开发了新的三价和四价抗体，以通过增强的生物分布和功能性亲和力来最大化肿瘤靶向能力。例如，已经产生了用于癌症免疫疗法的四价抗体，其中两个结合部分可以与癌细胞表面上的靶分子反应，而另外两个结合部分则与细胞毒性t细胞或自然杀伤(nk)细胞反应。
8.抗体药物偶联物(adc)是与活性药物化学连接的mab，因此，既具有mab的特异性靶向作用，又具有细胞毒性药物的抗癌能力。选择特定mab
‑
药物组合的能力以及在mab与药物连接方面的进展为靶向癌症提供了新的可能性，同时最大限度地减少了健康组织的暴露。到2019年，fda总共批准了七个adc，包括：ado
‑
trastuzumab emtansine(kadcyla
tm
)、brentuximab vedotin(adcetris
tm
)、inotuzumab ozogamicin(besponsa
tm
)、gemtuzumab ozogamicin(mylotarg
tm
)、polatuzinumab vegotin piiq(polivy
tm
)、enfortumab vedotin(padcev
tm
)和trastuzumab deruxtecan(enhertu
tm
)。所有这些都涉及细胞毒性药物与二价mab的偶联。除了已批准上市的七种adc药物外，大量adc也正在临床开发中。
9.her2(human epidermal growth factor receptor 2，人类表皮生长因子受体2)也称为neu、erbb
‑
2、cd340或p185，是erbb2基因编码的表皮生长因子受体(egfr/erbb)家族的成员。该基因的获得性体细胞改变导致在人类乳腺癌、膀胱癌、胃癌和肺癌中分别发生约20
‑
25％、23
‑
80％、10
‑
30％和20％的扩增和过表达。扩增和过表达导致与her2相关的增殖刺激增加。增殖刺激的增加导致肿瘤生长增强。因此，增强的或组成型的her2活性被认为是表达her2的人肿瘤细胞中恶性肿瘤的驱动力。罗氏(roche)公司开发了靶向her2的曲妥珠单抗(trastuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)，它们通过阻止her2必要的二聚化或与her家族其他成员(egfr、her3和her4)的异源二聚化来抑制酪氨酸激酶信号通路，反过来减缓
了her2过表达(her2阳性)癌细胞的生长。为了进一步提高靶向her2的抗体疗法的治疗获益，罗氏推出了trastuzumab emtansine(t
‑
dm1)，该药物将曲妥珠单抗的抗肿瘤活性与抗微管剂dm1相结合。
10.表皮生长因子受体(epidermal growth factor recepotr,egfr，也称为her1或c
‑
erbb
‑
1)是170kda的跨膜糖蛋白，是细胞表面受体酪氨酸激酶家族的成员。egfr在许多上皮肿瘤中被异常激活，包括在非小细胞肺癌、乳腺癌、大肠癌、头颈癌和前列腺癌中的那些。egfr的异常激活可能是由于受体的过表达、基因扩增、激活突变、受体配体的过表达和/或egfr活性调节剂的缺失引起的。
11.通过阻断受体胞外结构域上的egfr结合位点或抑制细胞内酪氨酸激酶活性来中断egfr信号传导，可以阻止表达egfr的肿瘤的生长并改善患者的病情。抗egfr抗体通过结合细胞表面的受体来干扰配体结合，从而发挥抗肿瘤作用，从而抑制了其下游信号传导途径。嵌合单克隆抗体c225(或cetuximab，西妥昔单抗)包含鼠mab225的可变区和人igg1的恒定区，可在世界各地用于治疗伊立替康难治性结肠癌。
12.批准用于egfr的裸抗(即西妥昔单抗、尼莫妥珠单抗、帕尼单抗和尼西单抗)在恶性肿瘤中显示出治疗作用，但通常与化学疗法药物联合使用以达到显著的临床疗效。由于裸抗的活性欠佳，抗体药物偶联物(antibody
‑
drug conjugate,adc)作为下一代疗法可能会增加抗体的抗肿瘤活性。在egfr靶向治疗中，尚无商业批准的adc，但数个adc已进入临床试验。avid
‑
100是由美登木素生物碱与抗egfr抗体连接而成，被开发用于治疗i/ii期的上皮肿瘤患者。abt
‑
414由通过可裂解接头与抗egfrviii抗体连接的单甲基澳瑞他汀f组成，已在iii期中显示出对表达扩增的egfr和egfrviii的肿瘤的显著疗效(van den bent et al.,2017)。所有临床阶段的靶向egfr的adc均使用常规的二价抗egfr mab作为靶向抗体。
13.发明简述
14.一方面，本公开提供了抗体药物偶联物(antibody
‑
drug conjugate,adc)，其包括：四价单克隆抗体[或四聚体(tetrabody)]，所述四价单克隆抗体通过化学接头与细胞毒性药物偶联；其中，所述单克隆抗体包括：两条长链和四条短链；其中每条所述长链包括第一片段和第二片段，所述第一片段位于所述长链的n端附近，所述第二片段位于所述长链的c端附近，每个所述第一片段和每个所述第二片段与一条所述短链配对，从而形成抗原结合片段结构域，因此形成对同一抗原具有特异性的四个抗原结合片段结构域。
[0015]
在所述adc的一些实施方案中，所述两条长链彼此相同，并且所述四条短链彼此相同。在一些实施方案中，所述两条长链可以彼此不同。在一些实施方案中，所述四条短链可以彼此不完全相同。
[0016]
在一些实施方案中，至少一条或每条所述长链的所述第一片段和所述第二片段具有相同的序列。在一些其他的实施方案中，至少一条或每条所述长链的所述第一片段和所述第二片段具有不同的序列。
[0017]
在adc的一些实施方案中，每条所述长链包括具有天然人igg1、igg2、igg4抗体同种型之一的ch2
‑
ch3结构域序列的子序列，所述子序列位于所述第一片段和所述第二片段之间。
[0018]
在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含位于所述第一片段和所述第二片段之间的子序列，所述子序列包含人igg1同种型的fc(或ch2
‑
ch3)结构域。在一些实施方案
中，此类fc结构域可包括一个或多个突变，以用于fc结构域功能的期望的改善。
[0019]
在adc的一些实施方案中，至少一条或每条所述短链包括天然人igg同种型的vl
‑
cl(λ)或vl
‑
cl(κ)的序列。
[0020]
在adc的一些实施方案中，至少一条或每条所述短链包括vh
‑
ch1的序列，其中ch1是人igg抗体同种型。在一些这样的实施方案中，所述vh可包含一个或多个突变。
[0021]
在adc的一些实施方案中，至少一条所述长链的至少一个所述第一片段或所述第二片段包括天然人igg1、igg2或igg4抗体同种型的vl
‑
cl(κ)序列。
[0022]
在adc的一些实施方案中，所述长链各自包含选自seq id no:3、5和9组成的组中的序列，而所述短链各自包含选自seq id no:4、6和10组成的组中的序列。
[0023]
在一些实施方案中，每条所述长链的所述第一片段和所述第二片段各自包含选自seq id no:25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组中的序列。
[0024]
在一些实施方案中，每条所述短链的所述第一片段和所述第二片段各自包含选自seq id no:25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组中的序列。
[0025]
在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:25所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:26所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:26所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:25所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:27所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:28所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:28所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:27所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:29所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:30所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:30所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:29所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:31所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:32所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:32所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:31所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:33所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:34所示的序列。在一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:34所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:33所示的序列。
[0026]
在adc的一些实施方案中，每条所述短链包含选自seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22和seq id no:24组成的组中的序列。
[0027]
在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含选自seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21和seq id no:23组成的组中的序列。
[0028]
在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:1所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:2所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:3所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:4所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:5所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:6所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:7所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:8所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条
所述长链包含如seq id no:9所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:10所示的序列。
[0029]
在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:11所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:12所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:13所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:14所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:15所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:16所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:17所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:18所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:19所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:20所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:21所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:22所示的序列。在adc的一些实施方案中，每条所述长链包含如seq id no:23所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:24所示的序列。
[0030]
在一些实施方案中，本公开提供了一种adc，其包含通过化学接头与细胞毒性药物偶联的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含两条相同的长链和四条相同的短链，其中：
[0031]
(a)每条所述长链包含如seq id no:1所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:2所示的序列；或者
[0032]
(b)每条所述长链包含如seq id no:3所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:4所示的序列；或者
[0033]
(c)每条所述长链包含如seq id no:5所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:6所示的序列；或者
[0034]
(d)每条所述长链包含如seq id no:7所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:8所示的序列；或者
[0035]
(e)每条所述长链包含如seq id no:9所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:10所示的序列；或者
[0036]
(f)每条所述长链包含如seq id no:11所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:12所示的序列；或者
[0037]
(g)每条所述长链包含如seq id no:13所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:14所示的序列；或者
[0038]
(h)每条所述长链包含如seq id no:15所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:16所示的序列；或者
[0039]
(i)每条所述长链包含如seq id no:17所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:18所示的序列；或者
[0040]
(j)每条所述长链包含如seq id no:19所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:20所示的序列；或者
[0041]
(k)每条所述长链包含如seq id no:21所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:22所示的序列；或者
[0042]
(1)每条所述长链包含如seq id no:23所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:24所示的序列。
[0043]
在adc的一些实施方案中，所述第二片段通过柔性肽接头与所述长链的其余部分
连接，所述柔性肽接头包括(g
x
s)
y
序列的一个或多个重复单元，其中x为1到6(包含)之间的整数，而y是0到8(包含)之间的整数。
[0044]
在一些实施方案中，所述抗原是egfr，并且所述adc包含四个均与egfr特异性结合的四个抗原结合片段结构域。在一些实施方案中，所述抗原是her2，并且所述adc包含四个均与her2特异性结合的抗原结合片段结构域。在一些实施方案中，所述抗原是c
‑
met，并且所述adc包含四个均与c
‑
met特异性结合的抗原结合片段结构域。
[0045]
在adc的一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自单甲基澳瑞他汀e(mmae)、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)、澳瑞他汀e、澳瑞他汀f、美登素dm1和dm4、美登木醇、山卓霉素、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、蒽环类、加利车霉素、尾海兔素10、杜卡霉素、阿霉素、泰兰抑菌素a、uncialamycin、甘露糖苷、蓖麻毒蛋白、白喉毒素、艾瑞布林、
131
i、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子和纳米颗粒组成的组。
[0046]
在adc的一些实施方案中，所述接头是可裂解的或不可裂解的，并可选自6
‑
马来酰亚胺基己酰基(mc)、马来酰亚胺基丙酰基(mp)、缬氨酸
‑
瓜氨酸(val
‑
cit)、丙氨酸
‑
苯丙氨酸(ala
‑
phe)、对氨基苄氧羰基(pab)、n
‑
琥珀酰亚胺基4
‑
(2
‑
吡啶硫基)戊酸酯(spp)、n
‑
琥珀酰亚胺基4
‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)
‑
环己烷
‑1‑
羧酸酯(smcc)、n
‑
琥珀酰亚胺基(4
‑
碘
‑
乙酰基)氨基苯甲酸酯(siab)、6
‑
马来酰亚胺基己酰基
‑
缬氨酸
‑
瓜氨酸
‑
对氨基苄氧基羰基(mc
‑
vc
‑
pab)、val
‑
cit
‑
pabc，n
‑
琥珀酰亚胺基
‑4‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)、n
‑
琥珀酰亚胺基3
‑
(吡啶
‑2‑
基二硫代)
‑
丙酸酯(spdp)、phe
‑
lys(fmoc)
‑
pab、aloc
‑
d
‑
ala
‑
phe
‑
lys(aloc)
‑
pab
‑
pnp、boc
‑
phe
‑
(alloc)lys
‑
pab
‑
pnp和全氟苯基3
‑
(吡啶
‑2‑
基二硫烷基)丙酸酯组成的组。
[0047]
在adc的一些实施方案中，所述药物接头可以通过半胱氨酸偶联、胺偶联、末端偶联、酶偶联或碳水化合物偶联与四价抗体连接。
[0048]
在adc的一些实施方案中，所述药物抗体比在1与12(包含)之间。在一些实施方案中，所述药物抗体比为约3或4。
[0049]
本公开还提供了如本文所述的adc的各种实施方案的其药学上可接受的盐。
[0050]
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含adc或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
[0051]
在另一方面，本公开提供了一种方法，通过向受试者施用有效量的本文所述的药物组合物来治疗增生性疾病、紊乱或病症。所述增生性疾病可以是癌症，例如结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌、食道癌、肉瘤和头颈癌。
附图说明
[0052]
图1为根据本公开的实施方案的四价adc的结构的示意图。
[0053]
图2为本公开的一些实施方案的特定四价adc与对照adc的hic分布的比较图；
[0054]
a图：ctl
‑
mmae；b图：具有低dar的bb01e
‑
mmae；c图：具有高dar的bb01e
‑
mmae。
[0055]
图3示出了本公开的一些实施方案的四价抗体和对照抗体的elisa结合结果；
[0056]
a图：egfr结合结果；b图：her2结合结果。
[0057]
图4示出了本公开的一些实施方案的四价抗egfr抗体和对照抗体的facs分析；
[0058]
a图：高表达egfr的mda
‑
mb
‑
468细胞；b图：低表达egfr的nugc3细胞。
[0059]
图5示出了本公开的一些实施方案的四价抗egfr抗体和对照抗体的内化分析；
[0060]
a图：高表达egfr的mda
‑
mb
‑
468细胞；b图：低表达egfr的nugc3细胞。
[0061]
图6a
‑
6c示出了本公开的一些实施方案的四价adc和对照adc的内化分析；
[0062]
6a图：在高表达egfr的mda
‑
mb
‑
468细胞上具有mmae效应分子的adc；6b图：在mda
‑
mb
‑
468细胞上具有dm1效应分子的adc；6c图：在低表达egfr的nugc3细胞上具有mmae效应分子的adc。
[0063]
图7a
‑
7c示出了本公开的实施方案的四价adc和对照adc的细胞毒性；
[0064]
7a图：在高表达egfr的mda
‑
mb
‑
468细胞上具有mmae效应分子的adc；7b图：在mda
‑
mb
‑
468细胞上具有dm1效应分子的adc；7c图：在低表达egfr的nugc3细胞上具有mmae效应分子的adc。
[0065]
发明详述
[0066]
在一个方面，并且结合图1所示，本公开提供了一种抗体药物偶联物(antibody
‑
drug conjugate,adc)1000，其包括：通过化学接头30与细胞毒性药物40偶联的四价单克隆抗体10；其中，所述单克隆抗体10包括：两条长链(110和120)和四条短链(210、220、230和240)；其中每条所述长链包括第一片段(111、121)和第二片段(112、122)，所述第一片段位于所述长链的n端附近，所述第二片段位于所述长链的c端附近，每个所述第一片段和每个所述第二片段与一条所述短链配对，从而形成抗原结合片段结构域，因此形成对同一抗原具有特异性的四个抗原结合片段结构域。
[0067]
如本文所用，“特异性结合”靶标(或靶标抗原，例如her2、her3、egfr、cldn18.2、trop2、bmca、cd33、cd22、cd72或其他抗原)的抗体或其部分可以指与人靶标蛋白结合从而抑制其相关信号传导的抗体或其部分。优选地，所述抗体以“高亲和力”结合人靶标蛋白，所述高亲和力即kd为1
×
10
‑8m或更小，更优选地为5
×
10
‑9m或更小或进一步更优选地为1
×
10
‑9m或更小。
[0068]
如本文所用的术语“细胞毒性药物”或“细胞毒性剂”，如本文所用，旨在指已知的抑制细胞生长和/或复制、和/或杀死细胞的任何试剂或药物。作为所述adc的一个组分，它也称为“效应分子”(payload)。
[0069]
在一些实施方案中，本公开的四价单特异性抗体的构建可以被认为是前体抗体的完整fab结构域与相同前体抗体的fc的c端连接，或者与具有同一抗原特异性的不同前体抗体的fc的c端连接。
[0070]
四价抗体的所述抗原结合区的正确排列和间隔可促进同一抗原的几个分子在细胞表面上的多价结合。设计不佳的抗体可能会导致某些结合表位的障碍。本发明的设计隔开了四个fab结构域，fc结构域每侧两个，在c端的fab结构域与柔性gs接头连接。这种排列为每个臂(fab)接触(结合)靶标抗原提供了合适的灵活性和范围，并且可以使不同fab的空间位阻最小化。
[0071]
本公开的所述四价抗体可以同时通过n端的fab和c端的fab与靶标结合，并且所述多价结合可以诱导所述靶标
‑
抗体复合物更有效的内化。与传统adc相比，这提供了四价adc的明显优势。
[0072]
已经报道了scfv与fc的c端融合的多价抗体。这种设计的主要挑战是当fab结构转换为scfv时亲和力降低。当转换为scfv时，大多数mab序列变得不稳定或亲和力降低。相反，
具有完整vh
‑
ch1和vl
‑
cl的fab通常是稳定的，并保持其亲和力。
[0073]
本公开的四价抗体药物偶联物在癌细胞上多价结合抗原的过程中利用了adc
‑
靶标复合物的增强的内化能力，这潜在地改善了细胞毒性药物向表达靶标的肿瘤细胞中的递送。
[0074]
在所述adc的一些实施方案中，所述两条长链彼此相同，并且所述四条短链彼此相同。在一些实施方案中，所述两条长链可以彼此不同。在一些实施方案中，所述四条短链可以彼此不完全相同。
[0075]
在所述adc的一些实施方案中，至少一条或每条所述长链的所述第一片段和所述第二片段具有相同的序列。在一些其他的实施方案中，至少一条或每条所述长链的所述第一片段和所述第二片段可具有不同的序列。
[0076]
在所述adc的一些实施方案中，每条所述长链包括具有天然人igg1、igg2、igg4同种型之一的ch2
‑
ch3结构域序列的子序列，所述子序列位于所述第一片段和所述第二片段之间。
[0077]
在所述adc的一些实施方案中，每条所述长链包含位于所述第一片段和所述第二片段之间的子序列，所述子序列包含人igg1同种型的ch2
‑
ch3(或fc)结构域，其中该fc结构域可包括一个或多个突变，以用于fc结构域功能的期望的改善。
[0078]
在所述adc的一些实施方案中，至少一条或每条所述短链包括天然人igg抗体同种型的vl
‑
cl(λ)或vl
‑
cl(κ)的序列。
[0079]
在所述adc的一些实施方案中，至少一条或每条所述短链包括vh
‑
ch1的序列，其中ch1是人igg抗体同种型。所述序列的所述vh部分可包含一个或多个突变。
[0080]
在所述adc的一些实施方案中，至少一条所述长链的至少一个所述第一片段或所述第二片段包括天然人igg1、igg2或igg4抗体同种型的vl
‑
cl(κ)序列。
[0081]
在所述adc的一些实施方案中，所述长链各自包含选自seq id no:3、5和9组成的组中的序列，而所述短链各自包含选自seq id no:4、6和10组成的组中的序列。
[0082]
在所述adc的一些实施方案中，每条所述长链的所述第一片段和所述第二片段各自包含选自seq id no:25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组中的序列。
[0083]
在所述adc的一些实施方案中，每条所述长链的所述第一片段和所述第二片段各自包含选自由：
[0084]
(1)一种抗原结合序列，其包含(1a)包含序列如seq id no:35所示的cdr1，(1b)包含序列如seq id no:36所示的cdr2，和(1c)包含序列如seq id no:37所示的cdr3；
[0085]
(2)一种抗原结合序列，其包含(2a)包含序列如seq id no:38所示的cdr1，(2b)包含序列如seq id no:39所示的cdr2和(2c)包含序列如seq id no:40所示的cdr3；
[0086]
(3)一种抗原结合序列，其包含(3a)包含序列如seq id no:41所示的cdr1，(3b)包含序列如seq id no:42所示的cdr2，和(3c)包含序列如seq id no:43所示的cdr3；
[0087]
(4)一种抗原结合序列，其包含(4a)包含序列如seq id no:44所示的cdr1，(4b)包含序列如seq id no:45所示的cdr2，和(4c)包含序列如seq id no:46所示的cdr3；
[0088]
(5)一种抗原结合序列，其包含(5a)包含序列如seq id no:47所示的cdr1，(5b)包含序列如seq id no:48所示的cdr2，和(5c)包含序列如seq id no:49所示的cdr3；
[0089]
(6)一种抗原结合序列，其包含(6a)包含序列如seq id no:50所示的cdr1，(6b)包
id no:2所示的序列；或者
[0118]
(b)每条所述长链包含如seq id no:3所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:4所示的序列；或者
[0119]
(c)每条所述长链包含如seq id no:5所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:6所示的序列；或者
[0120]
(d)每条所述长链包含如seq id no:7所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:8所示的序列；或者
[0121]
(e)每条所述长链包含如seq id no:9所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:10所示的序列；或者
[0122]
(f)每条所述长链包含如seq id no:11所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:12所示的序列；或者
[0123]
(g)每条所述长链包含如seq id no:13所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:14所示的序列；或者
[0124]
(h)每条所述长链包含如seq id no:15所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:16所示的序列；或者
[0125]
(i)每条所述长链包含如seq id no:17所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:18所示的序列；或者
[0126]
(j)每条所述长链包含如seq id no:19所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:20所示的序列；或者
[0127]
(k)每条所述长链包含如seq id no:21所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:22所示的序列；或者
[0128]
(1)每条所述长链包含如seq id no:23所示的序列，并且每条所述短链包含如seq id no:24所示的序列。
[0129]
在所述adc的一些实施方案中，所述第二片段通过柔性肽接头与所述长链的其余部分连接，所述柔性肽接头包括(g
x
s)
y
序列的一个或多个重复单元，其中x为1到6(包含)之间的整数，而y是0到8(包含)之间的整数。
[0130]
在一些实施方案中，所述抗原是her2、egfr、cmet或其他抗原，并且所述adc包含四个均与egfr特异性结合的抗原结合片段结构域。
[0131]
在所述adc的一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自单甲基澳瑞他汀e(mmae)、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)、澳瑞他汀e、澳瑞他汀f、美登素dm1和dm4、美登木醇、山卓霉素、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、蒽环类、加利车霉素、尾海兔素10、杜卡霉素、阿霉素、泰兰抑菌素a、uncialamycin、甘露糖苷、蓖麻毒蛋白、白喉毒素、艾瑞布林、
131
i、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子和纳米颗粒组成的组。在一个实施方案中，所述细胞毒性药物是mmae。在一实施方案中，所述细胞毒性药物是mmaf。在一个实施方案中，所述细胞毒性药物是dm1。在一个实施方案中，所述细胞毒性药物是dm4。
[0132]
连接抗体部分和细胞毒性药物的化学接头可以是可裂解的或不可裂解的。在一些实施方案中，所述接头包括pegn，其中n在1至20之间(即，具有1
‑
20个重复单元(ch2ch2o))。在一些实施方案中，所述化学接头还包括连接所述pegn间隔子的肽接头。在一些实施方案中，所述化学接头包括肽接头，但不包括pegn间隔子。所述肽接头可以选自6
‑
马来酰亚胺基
己酰基(mc)、马来酰亚胺基丙酰基(mp)、缬氨酸
‑
瓜氨酸(val
‑
cit)、丙氨酸
‑
苯丙氨酸(ala
‑
phe)、对氨基苄氧羰基(pab)、n
‑
琥珀酰亚胺基4
‑
(2
‑
吡啶硫基)戊酸酯(spp)、n
‑
琥珀酰亚胺基4
‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)
‑
环己烷
‑1‑
羧酸酯(smcc)、n
‑
琥珀酰亚胺基(4
‑
碘
‑
乙酰基)氨基苯甲酸酯(siab)、6
‑
马来酰亚胺基己酰基
‑
缬氨酸
‑
瓜氨酸
‑
对氨基苄氧基羰基(mc
‑
vc
‑
pab)、val
‑
cit
‑
pabc，n
‑
琥珀酰亚胺基
‑4‑
(2
‑
吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)、n
‑
琥珀酰亚胺基3
‑
(吡啶
‑2‑
基二硫代)
‑
丙酸酯(spdp)、phe
‑
lys(fmoc)
‑
pab、aloc
‑
d
‑
ala
‑
phe
‑
lys(aloc)
‑
pab
‑
pnp、boc
‑
phe
‑
(alloc)lys
‑
pab
‑
pnp和全氟苯基3
‑
(吡啶
‑2‑
基二硫烷基)丙酸酯组成的组。
[0133]
在所述adc的一些实施方案中，所述药物
‑
接头可通过半胱氨酸偶联、胺偶联、末端偶联、酶促偶联或碳水化合物偶联与四聚体连接。
[0134]
在所述adc的一些实施例中，所述药物抗体比在1与12(包含)之间。在一些实施方案中，所述药物抗体比为约3或4。
[0135]
在如本文所述的adc的各种实施方案中，本公开还提供了其药学上可接受的盐。
[0136]
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含adc或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
[0137]
在另一方面，本公开提供了一种方法，通过向受试者施用有效量的本文所述的药物组合物来治疗增生性疾病、紊乱或病症。所述增生性疾病可以是癌症，例如结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌、食道癌、肉瘤和头颈癌。本公开还提供了一种方法，所述方法治疗与egrf、her2或c
‑
met相关的疾病、紊乱或病症，比如增生性疾病、紊乱或病症例如癌症的方法。
[0138]
在另一方面，本公开提供了编码本发明的抗体、或抗原结合部分的核酸分子。本发明还涵盖重组表达载体，所述重组表达载体包含编码本发明抗体的核酸；以及宿主细胞，所述宿主细胞被此类载体转染；以及通过培养此类宿主细胞制备本发明所述抗体的方法；例如，一种表达载体，所述表达载体包含编码抗体2f8的重链和轻链的可变区和恒定区的核苷酸序列，所述抗体2f8由杂交瘤产生。
[0139]
本公开还提供了能够产生本发明所述单克隆抗体的哺乳动物细胞，所述单克隆抗体与目的靶标特异性结合。在一个实施方案中，所述杂交瘤包括与永生细胞融合的b细胞，所述b细胞获自转基因非人动物，例如转基因小鼠；所述转基因小鼠具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组，所述人重链转基因和人轻链转基因编码本发明的抗体的全部或一部分。
[0140]
如本文所用的术语“约”是指相对于特定的给定值或(大于或小于)所述给定值高达25％的范围。
[0141]
如本文所用的术语“癌症”旨在涵盖非转移性癌症和转移性癌症。在本文中，治疗癌症涉及原发性肿瘤和肿瘤转移的治疗。
[0142]
如本文所用的“治疗”是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，其可以包括预防疾病的复发、缓解症状、减弱疾病任何直接或间接的病理学后果、预防转移、疾病减缓疾病进展速度、改善或缓解疾病状况、以及消除或改善预后。
[0143]
在本公开中，“受试者”是指哺乳动物，例如牛、猫、狗和马、灵长类、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，所述哺乳动物是指人。
[0144]
在本公开中，“有效量”是指在期望的剂量和时间内有效地实现期望的治疗或预防效果的量。物质的所述“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述物质/分子在个体中引起期望的应答的能力等因素而变化。对于癌症，adc的所述治疗有效量可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤体积、抑制所述癌细胞渗入周围器官、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤生长、和/或在某种程度上缓解与癌症有关的一种或多种症状。为了预防或治疗疾病，本公开的adc的合适剂量将取决于要治疗的疾病的类型、抗体药物偶联物的类型、所述疾病的严重性和进展、所述adc的施用等。适当地，将所述抗体药物偶联物一次性或通过一系列治疗施用于所述患者。根据疾病的类型和严重程度，施用于所述患者的剂量可以是约1μg/kg
‑
100mg/kg(例如0.1mg/kg
‑
20mg/kg)的adc，例如或通过一次或多次单独施用或通过连续输注。取决于上述因素，通常日剂量可以在约1μg/kg
‑
100mg/kg或更大的范围内。对于几天或更久的重复给药，视情况而定，通常会继续所述治疗，直到症状出现所需的抑制为止。抗体药物偶联物的示例性剂量可以在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。这样，可以将约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量的抗体药物偶联物施用于所述患者。这样的剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如患者接受约2至约20剂，或，例如约6剂的抗体药物偶联物)。可以施用较高的初始负荷剂量，然后施用较低剂量的一剂或多剂。该疗法的过程很容易通过常规技术和分析进行监测。
[0145]
当在本公开中使用时，“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其对于暴露于其的细胞或哺乳动物在所采用的剂量和浓度下是无毒的。通常，生理上可接受的载体是ph缓冲水溶液。生理上可接受的载体的示例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐的反离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂。
[0146]
在本公开中，所述载药量或药物抗体比(即adc中每种抗体的细胞毒性药物模块的平均数目)可以在每抗体1
‑
12个药物的范围内，例如，约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个药物。可以使用不同的连接位点，例如通过重链和轻链之间的链间二硫键、通过铰链区中的重链之间的链间二硫键、在工程化的半胱氨酸、在选定的每条链上的lys残基、在碳水化合物、末端残基。可以通过常规手段，例如质谱、elisa分析、和hplc来验证来自adc制备的偶联反应的每个抗体的平均药物模块数目。在某些实施方案中，本公开的adc可以具有从1到大约8、从约4到约12、从约2到约6、从约3到约5、从大约4到大约5、从约3.5到约4.5、约4的载药量。在某些实施方案中，为了产生用于接头与抗体连接的反应性硫醇基，可以在部分或完全还原条件下还原所述抗体以产生反应性的半胱氨酸硫醇基。
[0147]
在本公开中，所述adc的所述药学上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如以下酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸。
[0148]
本公开的所述抗体药物偶联物的所述药学上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和衍生自氨或含1
‑
16个碳原子的有机胺的铵盐，其中所述有机胺为例如乙胺、二乙胺、三乙胺、乙二异丙胺、单乙醇胺、二
乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苯甲酰胺、n
‑
甲基哌啶、n
‑
甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2
‑
乙二胺。
[0149]
可以用本发明的adc治疗的与靶标蛋白相关的肿瘤包括具有靶标过度表达的肿瘤。例如，与egfr有关的肿瘤，包括呼吸道肿瘤(例如小细胞癌和非小细胞癌、支气管癌)；消化道肿瘤(例如食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠)；内分泌腺和外分泌腺肿瘤(例如甲状腺和甲状旁腺、胰腺和唾液腺)；头和颈部区域的肿瘤(例如喉、下咽、鼻咽、口咽、唇、口腔、舌头和食道)；和/或神经胶质瘤。her2相关的肿瘤，包括膀胱癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、胃腺癌等。
[0150]
本公开的adc可以与已知的化学治疗剂组合使用以治疗肿瘤。所述化学治疗剂可以是，例如，阿霉素、环磷酰胺和紫杉烷[taxol和taxotere]、xeloda、gemzar、navelbine、tamoxifen、芳香酶抑制剂(arimidex、femara、aromasin)、5
‑
fu加亚叶酸、camptosar、奥沙利铂、顺铂、卡铂、雌莫司汀、novantrone、泼尼松、oncovin等，或其组合。
实施例
[0151]
制备的所述四价抗体总结列表如表1所示。
[0152]
表1
[0153]
id蛋白结构(长链/短链)seq id no.(长链)seq id no.(短链)bb01hvhch1fc(g1)(g3s)4vhch1/vlcl(κ)12bb01evhch1fc(g2)(g3s)4vhch1/vlcl(λ)34bb02evhch1fc(g1)(g3s)4vhch1/vlcl(κ)56bb03evhch1fc(g1)(g3s)4vhch1/vlcl(κ)78bb04evhch1fc(g2)(g3s)1vhch1/vlcl(κ)910bb05evlcl(κ)fc(g1)(g3s)4vlcl(κ)/vhch11112bb02hvhch1fc(g1)(g3s)4vhch1/vlcl(κ)1314bb03hvlcl(κ)fc(g1)(g3s)4vlcl(κ)/vhch11516bb04hvlcl(κ)fc(g1)(g3s)4vlcl(κ)/vhch11718bb06evlcl(κ)fc(g1)(g3s)4vlcl(κ)/vhch11920bb01mvhch1fc(g1)(g3s)4vhch1/vlcl(κ)2122bb02mvlcl(κ)fc(g1)(g3s)4vlcl(κ)/vhch12324
[0154]
1.四价抗体的制备
[0155]
使用表1中的序列与选择的稳定同种型融合，以设计并合成示例性四价抗体。在一些实施例中，出于特定目的引入了某些点突变。制备了两种类型的四价抗体，常规形式和转换形式。每种四价抗体包含两条长链和四条短链。对于常规形式，长链的序列包含一条全长重链和同一抗体的完整vh
‑
ch1片段，该片段通过柔性(gs)接头与fc的c端融合。短链序列与同一抗体的轻链相同。
[0156]
对于转换形式，长链的序列包含直接与fc(ch2
‑
ch3)的n端融合的全长轻链(vl
‑
cl)和另一条通过柔性(gs)接头与fc的c端融合的全长轻链(vl
‑
cl)(同一抗体)。短链的序列包含同一抗体的全长vh
‑
ch1。
[0157]
为了表达工程化的四价抗体，进行了密码子优化和基因合成。将特定的全长长链
和短链dna分别克隆到单独的pcdna3质粒中。配对的质粒对hek293细胞瞬时转染并使用一步protein a纯化来制备足量的蛋白进行测定。
[0158]
示例性四价抗体：
[0159]
(a)bb01h：bb01h以igg1κ同种型的常规形式制备，其中，其长链包含：vh
‑
ch1
‑
ch2
‑
ch3
‑
(g3s)4‑
vh
‑
ch1，而短链包含：vl
‑
cl(κ)。如所描述的四价抗体的序列中所使用的，vh、vl、ch1、ch2、ch3指来自其构建四价抗体的前体抗体的结构域或片段。bb01h的长链的序列如seq id no:1所示。bb01h的短链的序列如seq id no:2所示。
[0160]
(b)bb01e：bb01e以igg2λ同种型的常规形式制备，其中，其长链包含：vh
‑
ch1
‑
ch2
‑
ch3
‑
(g3s)4‑
vh
‑
ch1(igg2的ch2
‑
ch3也称为fc(g2))，而短链包含：vl
‑
cl(λ)。bb01e的长链的序列如seq id no:3所示。bb01e的短链的序列如seq id no:4所示。
[0161]
(c)bb04e：bb04e以igg2κ同种型的常规形式制备，其中，其长链包含：vh
‑
ch1
‑
ch2
‑
ch3
‑
(g3s)1‑
vh
‑
ch1，而短链包含：vl
‑
cl(κ)。bb04e的长链的序列如seq id no:9所示。bb04e的短链的序列如seq id no:10所示。
[0162]
(d)bb05e：bb05e以igg1κ同种型的转换形式制备，其中，其长链包含：vl
‑
cl(κ)
‑
ch2
‑
ch3
‑
(g3s)4‑
vl
‑
cl(κ)，而短链包含：vh
‑
ch1(igg1)。bb05e的长链的序列如seq id no:11所示。bb05e的短链的序列如seq id no:12所示。
[0163]
2.四价adc的制备
[0164]
四价抗体(bb01e、bb02e、bb03e、bb04e、bb05e)和对照二价抗体(ctl)通过接头与细胞毒性剂(例如mmae、dm1)偶联。向在中性ph的磷酸盐缓冲液中的抗体加入tcep进行部分还原。加入在dma中的药物
‑
接头(mc
‑
val
‑
cit
‑
pab
‑
mmae或mc
‑
dm1)，并使其与四聚体反应以获得期望的药物抗体比(drug
‑
to
‑
antibody ratio,dar)。
[0165]
将在磷酸盐缓冲液中的四价抗体加入到在dma中的osu
‑
glu
‑
val
‑
cit
‑
pab
‑
mmae中，使其反应以获得期望的dar。
[0166]
3.四价抗体和四价adc的表征
[0167]
(a)疏水相互作用色谱法(hydrophobic interaction chromatography,hic)：hic用于评价adc中的药物分布和药物与抗体的摩尔比。
[0168]
通过hic分析具有低dar的ctl
‑
mmae(二价adc)、bb01e
‑
mmae(四价adc)、以及具有高dar的bb01e
‑
mmae，其代表性hic色谱图如图2所示。对于具有低dar的ctl
‑
mmae(二价adc)和bb01e
‑
mmae(四价adc)，主峰是与2个和4个药物分子相连的抗体(分别为dar2、dar4)，次峰是抗体(dar0)以及与6个和8个药物分子相连的抗体(dar6、dar8)。结果表明bb01e
‑
mmae和ctl
‑
mmae具有相似的药物分布和dar值。具有高dar的bb01e
‑
mmae主要包含与8个和10个药物分子相连的抗体(dar8、dar10)。
[0169]
(b)结合
[0170]
(b1)结合重组表达的靶标蛋白
[0171]
使用elisa分析检验和比较四价抗体和对照二价抗体的靶标结合能力(与egfr或her2结合)。将四价抗体样品或对照抗体从20μg/ml开始以5倍梯度稀释，总共稀释8个梯度，将四价抗体样品或对照抗体包被在96孔板上，并将板在4℃孵育过夜。使用hrp标记的人靶标蛋白(5ng/ml的egfr或her2)作为检测剂，并使用tmb进行比色反应，在microplate reader(molecular devices，spectramax 190)上450/650nm读取板的吸光度，并采用剂量
反应曲线形式的四参数逻辑模型进行数据分析。
[0172]
如图3所示的结果表明，与对照二价抗体相比，所有四价抗体变体以增强的结合能力结合它们的特定靶标蛋白。
[0173]
(b2)结合表达egfr的癌细胞
[0174]
对具有不同表面egfr水平的几种癌细胞系(mda
‑
mb
‑
468、nugc3)进行facs分析，以分析四价抗体与表达egfr的细胞系的结合活性，并与二价对照进行比较。简而言之，首先将单细胞悬液用饱和浓度(10μg/ml)的四价抗体样品或对照抗体染色，然后用fitc标记的、作为二抗的抗人kappa抗体染色。
[0175]
如图4所示的结果表明，四价抗egfr抗体结合高表达egfr的mda
‑
mb468细胞的平均荧光强度(mean fluorescent intensity,mfi)比二价对照高3
‑
4倍。在低表达egfr的nugc3细胞上，mfi差异更大(相差近10倍)。尽管四价抗体上多出的两个拷贝的kappa可能有助于产生更强的信号(两倍)，但四价抗体染色显著更高的mfi(3
‑
10倍)表明，当结合靶标时，四价形式的四个靶向臂提供了比双价形式的两个臂显著更有效的协同效应。当结合低表达egfr的细胞时，这种协同效应比结合高表达egfr的细胞更为明显。
[0176]
(c)内化
[0177]
在具有不同表面egfr水平的几种癌细胞系(mda
‑
mb
‑
468、nugc3)上分析了四价抗体诱导的抗体
‑
靶标复合物的内化，并与二价对照进行了比较。为了进行分析，首先将单细胞悬液与抗体样品(10μg/ml)在冰上孵育1小时，然后洗涤以去除未结合的抗体。当一份等分试样留在冰上时，将其余等分试样在37℃下孵育不同的时间(0.5、1、2和4小时)。在每个规定的孵育时间结束时，将一份等分细胞从37℃的培养箱中取出并置于冰上。最长的孵育时间结束后，将所有等分试样均用fitc标记的二抗染色，并通过流式细胞仪分析染色的样品。在减去染色对照的mfi背景值后，根据相对于冰上，在37℃下的mfi损失计算受体
‑
抗体复合物的内化。内化百分比计算如下：内化百分比(％)＝(mfi
0小时
‑
mfi
其他时间
)/mfi
0小时
。
[0178]
如图5所示的结果表明，在高表达egfr的mda
‑
mb
‑
468细胞和低表达egfr的nugc3细胞上，内化的四价抗体的百分比均高于二价对照，表明在egfr阳性的人癌细胞中四价抗体的内化潜力比二价对照抗体显著增强。
[0179]
对四价adc和作为对照的常规adc进行了相似的内化分析。在所有情况下，具有mmae效应分子或dm1效应分子的四价adc的内化比常规二价adc更为有效(图6a
‑
6c)。
[0180]
(d)细胞毒性
[0181]
为了研究四价抗体和adc增强的内化是否将转变为更强的细胞毒性，在基于比色的细胞毒性测定中，评估了具有不同egfr表达水平的靶标表达癌细胞的体外细胞毒性，并与常规二价adc进行比较。为了进行测定，将靶标细胞接种到96孔平底组织培养板中，每种细胞系以优化的细胞密度接种并在37℃，5％co2下孵育过夜(16
‑
20小时)。将adc样品的梯度稀释液转移至细胞板，并将测定板孵育一段指定的时间(3
‑
5天，取决于细胞系)，以产生更大的杀伤。
[0182]
如图7a
‑
7c所示结果表明，具有mmae效应分子或dm1效应分子的各种四价adc产物相比常规的二价adc，在结合靶标表达的细胞时具有更强的细胞毒性。
[0183]
尽管已经详细描述了本发明的特定实施方案，但是本领域技术人员应理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，并且所有这些改变都落入本
发明的范围内。本发明的全部范围由所附权利要求书及其任何等同形式给出。
[0184]
序列表
[0185]
bb01h
[0186]
链1(长链，seq id no:1)：
[0187]
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[0213]
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[0214]
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[0215]
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[0216]
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[0218]
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[0221]
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[0223]
链2(短链，seq id no:16)：
[0224]
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[0225]
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[0226]
链1(长链，seq id no:17)：
[0227]
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[0228]
链2(短链，seq id no:18)：
[0229]
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[0230]
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[0231]
链1(长链，seq id no:19)：
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[0233]
链2(短链，seq id no:20)：
[0234]
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[0235]
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[0236]
链1(长链，seq id no:21)：
[0237]
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[0238]
链2(短链，seq id no:22)：
[0239]
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[0240]
bb02m
[0241]
链1(长链，seq id no:23)：
[0242]
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[0243]
链2(短链，seq id no:24)：
[0244]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgytftsywlhwvrqapgkglewvgmidpsnsdtrfnpnfkdrftisadtskntaylqmnslraedtavyycatyrsyvtpldywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepksc
[0245]
抗体抗原结合位点部分序列
[0246]
链1(seq id no:25)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0247]
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[0248]
链2(seq id no:26)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0249]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveik
[0250]
抗体抗原结合位点部分序列
[0251]
链1(seq id no:27)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0252]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftftdytmdwvrqapgkglewvadvnpnsggsiynqrfkgrftlsvdrskntlylqmnslraedtavyycarnlgpsfyfdywgqgtlvtvss
[0253]
链2(seq id no:28)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0254]
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqdvsigvawyqqkpgkapklliysasyrytgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyyiypytfgqgtkveik
[0255]
抗体抗原结合位点部分序列
[0256]
链1(seq id no:29)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltnygvhwvrqspgkglewlgviwsggntdyntpftsrlsinkdnsksqvffkmnslqsddtaiyycaraltyydyefaywgqgtlvtvsa
[0257]
链2(seq id no:30)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：dilltqspvilsvspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqnnnwpttfgagtklelk
[0258]
抗体抗原结合位点部分序列
[0259]
链1(seq id no:31)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0260]
qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsggsvssgdyywtwirqspgkglewighiyysgntnynpslksrltisidtsktqfslklssvtaadtaiyycvrdrvtgafdiwgqgtmvtvss
[0261]
链2(seq id no:32)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0262]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdisnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyfcqhfdhlplafgggtkveik
[0263]
抗体抗原结合位点部分序列
[0264]
链1(seq id no:33)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0265]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgytftsywlhwvrqapgkglewvgmidpsnsdtrfnpnfkdrftisadtskntaylqmnslraedtavyycatyrsyvtpldywgqgtlvtvss
[0266]
链2(seq id no:34)(下划线部分表示cdr1、cdr2、cdr3)：
[0267]
diqmtqspsslsasvgdrvtitckssqsllytssqknylawyqqkpgkapklliywastresgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyyaypwtfgqgtkveik
[0268]
如seq id no:25
‑
34所示的cdr序列
[0269]
gfnikdt(seq id no:35)
[0270]
yptngy(seq id no:36)
[0271]
wggdgfyamdy(seq id no:37)
[0272]
rasqdvntava(seq id no:38)
[0273]
sasflys((seq id no:39)
[0274]
qqhyttppt(seq id no:40)
[0275]
gftftdy(seq id no:41)
[0276]
npnsgg(seq id no:42)
[0277]
nlgpsfyfdy(seq id no:43)
[0278]
kasqdvsigva(seq id no:44)
[0279]
sasyryt(seq id no:45)
[0280]
qqyyiypyt(seq id no:46)
[0281]
gfsltny(seq id no:47)
[0282]
wsggn(seq id no:48)
[0283]
altyydyefay(seq id no:49)
[0284]
rasqsigtnih(seq id no:50)
[0285]
yasesis(seq id no:51)
[0286]
qqnnnwptt(seq id no:52)
[0287]
ggsvssgdy(seq id no:53)
[0288]
yysgn(seq id no:54)
[0289]
drvtgafdi(seq id no:55)
[0290]
qasqdisnyln(seq id no:56)
[0291]
dasnlet(seq id no:57)
[0292]
qhfdhlpla(seq id no:58)
[0293]
gytftsy(seq id no:59)
[0294]
dpsnsd(seq id no:60)
[0295]
yrsyvtpldy(seq id no:61)
[0296]
kssqsllytssqknyla(seq id no:62)
[0297]
wastres(seq id no:63)
[0298]
qqyyaypwt(seq id no:64)。