解磷菌3-1及在产植物生长激素上的应用的制作方法

解磷菌3
‑
1及在产植物生长激素上的应用
技术领域
1.本发明涉及农业种植与微生物学领域，具体涉及一株解磷菌及其应用。


背景技术：

2.磷是除氮之外限制植物生长最重要的营养要素。但是我国耕地土壤中约有74％的面积缺磷，植物可利用的有效态无机磷只占土壤总磷的2％～3％，为保证农业生产需投入大量磷肥。但研究表明磷肥的当季利用率只有10％～20％，总的利用率不超过25％。目前，我国农田农业土壤盈余己经达到282
×
104t。长期投入磷肥造成土壤板结、酸化和肥力下降，带来严重的水体污染和土壤污染。因此，减少化肥的使用，提高土壤磷素的利用，对农业生产及可持续发展具有重要的意义。
3.植物激素是影响植物生长发育和生殖的化学信使，可以在低浓度下调控植物的生长。iaa(吲哚
‑3‑
乙酸)和赤霉素都是重要的植物激素，在调控植物生长发育的过程中发挥作用。iaa具有促进细胞伸长生长、诱导维管束分化、调控根的分化形成、促进果实发育等功能，对植物的生长发育极其重要。产iaa的菌株对植物生长具有刺激作用，当植物接种能产生iaa的菌株时，植物对n、p、k、ca和mg的吸收增加从而植物生长被促进；赤霉素在植物生长发育中的作用主要包括促进细胞分裂和伸长等，另外，其可以通过长距离和短距离运输来调控植物的生长发育。
4.解磷微生物可以将土壤中的难溶磷转化为植物可以吸收利用的有效磷，其在农作物根际中大量存在，与植物互利共生，能分泌植物激素，促进植物根的发育，利于植物的生长。也可以在土壤受污染环境下对重金属进行固定和活化，提高植物抗病能力。因此，筛选解磷微生物并研究它们对植物的促生作用，对减少化肥使用、提高作物产量等方面具有重要的意义。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术上的问题和不足，本发明提供了一株具有溶磷作用、耐盐、耐重金属镉的路氏肠杆菌(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)，即一株解磷菌3
‑
1。本发明从磷矿土中分离出一株解磷菌3
‑
1，能在高盐、高重金属镉的环境下生存，并能在土壤中定植，显著促进上海青生长。
6.解磷菌3
‑
1，于2021年6月18日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m 2021734，分类名称为路氏肠杆菌enterobacter ludwigii strain 3
‑
1。
7.本发明的另一目的在于提供上述解磷菌3
‑
1(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)在提高植物生长性能中的应用。
8.所述解磷菌3
‑
1(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)能够在较高的盐度值(质量浓度为12％及以上)和重金属镉浓度(350mg/l及以上)的环境下生存。
9.本发明还请求保护上述解磷菌3
‑
1(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)在如下
任何一方面的应用：(1)在溶磷和/或固氮中的应用；(2)在产iaa和/或产赤霉素中的应用；(3)在提升土壤有效磷含量中的应用；(4)在促进植物生长性能中的应用；在促进植物生长性能中的应用中，优选地，所述应用的具体方式为：将所述解磷菌3
‑
1(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)配制为菌液后，将所述菌液注入植株根系土壤。
10.所述解磷菌3
‑
1(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)具有如下形态和生理生化特征：所述解磷菌3
‑
1在lb培养基上28℃培养24h后，菌落呈圆形，微乳白色，边缘整齐，光滑湿润，中间隆起，直径2
‑
3mm；显微镜下呈革兰氏阴性，细胞形态为杆状，不产芽孢；该菌株能以葡萄糖、蔗糖、和乳糖作为碳源生长，甲基红和vp反应呈阳性，淀粉水解呈阴性，明胶水解阳性。
11.与已有技术相比，本发明的增益之处在于：本发明的解磷菌3
‑
1(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)具有高耐盐、耐重金属镉、产iaa、产赤霉素、促进植物生长的有益效果，该菌可施用于盐碱地和受重金属污染农田，将土壤中难溶性磷转化为植物可吸收利用的磷酸盐，增加土壤和植物根际速效磷含量，促进植物生长，能有效缓解土壤板结、酸化问题，增强土壤肥力，将其作为微生物菌剂施用于农田中，可减少化肥使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
12.图1为实施例2中iaa标准曲线。
13.图2为实施例3中赤霉素标准曲线。
14.图3为实施例4中解磷菌3
‑
1在阿须贝氏培养基上的生长情况。
15.图4为实施例5中解磷菌3
‑
1的系统发育树。
16.图5为实施例6中解磷菌3
‑
1对上海青种子发芽的影响。
具体实施方式
17.下面结合具体实例对本发明作出进一步详细阐述，所述实施例的给出仅用于解释本发明，并未对本发明的使用范围进行限制。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
18.固体无机磷筛选培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5.0g，mgso4·
7h2o 0.3g，feso4·
7h2o 30mg，mnso4·
h2o 30mg，水1000ml，ph 7.0
‑
7.5，琼脂粉20g。
19.牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10g，氯化钠5.0g，水1000ml，ph7.0
‑
7.2，固体培养基添加1.5％的琼脂粉。
20.lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g。
21.金氏(king)培养基：蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，水1000ml，ph 7.0
‑
7.2。
22.阿须贝(ashby)氏无氮培养基：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，nacl 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，caso
4 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂20g，水1000ml。
23.s2比色液：4.5g fecl3，h2so
4 1ml，定容至1000ml。
24.实施例1解磷菌3
‑
1的分离、筛选土壤样品采自湖北省宜昌市磷矿(北纬n：31
°
13’55”，东经e：111
°
15’36”)土壤，装入无菌袋中带回实验室，4℃保存。称取10g新鲜土样加入90ml无菌生理盐水中，100r/min振荡15min，置入28℃培养箱培养24h。富集后取上清稀释到10
‑3、10
‑4、10
‑5三个梯度，分别取每个稀释度的液体350μl涂布于无机磷筛选固体培养基上，每组3个平行。倒置于28℃培养箱培养4
‑
5d，观察透明圈。挑取有透明圈的菌落反复划线纯化培养，纯化后挑取单菌落转接至牛肉膏蛋白胨培养基斜面4℃保藏备用。
25.经中国典型培养物保藏中心保藏，得到高耐盐耐重金属的解磷菌3
‑
1，所述菌株分类为路氏肠杆菌(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021734。
26.实施例2产iaa能力测定配制50ml液体金氏(king)培养基于150ml锥形瓶中，灭菌后接种500μl用无菌水重悬的解磷菌3
‑
1菌悬液(1
×
108cfu/ml)，设置三个重复，以未接种培养基为对照。培养液放置于28℃摇床中200r/min培养12天。采用s2比色法测量，将培养12d的培养液在10000r/min 4℃的条件下离心10min，取1ml上清液与1ml s2比色液混合均匀，避光静置30min后，利用分光光度计测定530nm下的吸光值，用标准曲线算出iaa产量。
27.iaa标准曲线的制作：准确称取2.8mg的iaa 于100ml容量瓶中，用甲醇定容。再用甲醇稀释成不同浓度，分别为0mg/l、4mg/l、8mg/l、12mg/l、16mg/l、20mg/l、24mg/l、28mg/l，以iaa浓度为横坐标，530nm处的吸光值为纵坐标，制作标准曲线(如图1)。经测得iaa 的标准曲线方程为y＝0.0335x 0.0158，r2＝0.9987。
28.表1解磷菌3
‑
1分泌iaa能力结果如表1所示，从表1中可以看出，解磷菌3
‑
1分泌iaa的量为25.92mg/l。
29.实施例3产赤霉素能力测定挑取经过活化的解磷菌3
‑
1菌株置于nb液体培养基中，28℃振荡培养过夜制成种子液，在无机磷筛选液体培养基
①
中添加100μl种子液，28℃条件下200r/min振荡培养5d，每24h取0.5ml试液测定412nm处吸光度。
30.赤霉素标准曲线的制作：称取分析纯纯度的赤霉素用质量浓度为70％的乙醇溶解，配制成浓度为100μg/ml的赤霉素含量标准液，按照浓度梯度为0、10、20、30、40、50μg/ml，取各浓度赤霉素0.5ml与4.5ml的浓硫酸混合，定容至20ml测定其在412nm的吸光值，以
赤霉素浓度为横坐标，412nm处的吸光值为纵坐标，制作标准曲线(如图2)。经测得赤霉素的标准曲线方程为y＝0.0045x
‑
0.0025，r2＝0.9996。
31.表2解磷菌3
‑
1分泌赤霉素能力结果如表2所示，从表2中可以看出，5天内解磷菌3
‑
1分泌赤霉素的最大量为20.78mg/l。
32.实施例4固氮能力检测将解磷菌3
‑
1用无菌水制备成1
×
108cfu/ml的菌悬液，取5μl菌悬液以点接种法接种到阿须贝氏培养基上，于28℃培养3d。试验结果如图3所示，从图3看出解磷菌3
‑
1能在阿须贝氏培养基上生长，说明其具有固氮性能。
33.实施例5解磷菌3
‑
1的鉴定
‑
形态特征将解磷菌3
‑
1用无菌水制备成1
×
108cfu/ml的菌悬液，取5μl菌悬液以点接种法接种到lb培养基平板上，于28℃培养1d。结果显示菌落呈圆形，微乳白色，边缘整齐，光滑湿润，中间隆起；在电子显微镜下该菌呈革兰氏阴性，细胞形态为杆状，不产芽孢。
34.生理生化特性参照细菌鉴定手册对菌株生理生化特性进行测定。
35.结果显示，该菌株能以葡萄糖、蔗糖和乳糖作为碳源生长，甲基红和vp反应呈阳性，淀粉水解呈阴性，明胶水解阳性。
36.16s rdna基因序列分析使用细菌基因组dna小量纯化试剂盒takara mini best bacteria genomic dna extraction kit ver.3.0提取菌株dna。以菌株dna为模板，采用细菌16s rrna基因通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt
‑3’
)进行pcr扩增。
37.扩增反应体系：模板7μl，dntp 4μl，5
×
ps buffer 10μl，引物1(27f)2μl，引物2(1492r)2μl，primer star hs酶0.5μl，dd h2o 24.5μl。
38.反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30个周期；72℃延伸10min；最后4℃保持。
39.用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，选取电泳条带单一，片段大小合适的扩增样品送至武汉生工生物公司进行测序。测序结果在ncbi上进行序列比对。解磷菌3
‑
1的16srdna序列如seq id no:1所示。
40.鉴定结果：菌株鉴定为肠杆菌属，与enterobacter ludwigii相似度99.79％，系统发育树如图4所示。
41.所述解磷菌3
‑
1(enterobacter ludwigii strain 3
‑
1)的保藏信息：保藏日期：
2021年6月18日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号：cctcc m2021734，保藏地址：中国
·
武汉
·
武汉大学。
42.实施例6植物促生试验以上海青种子萌发的影响为一植物种植试验，但不代表仅仅对这一植物的效果，对其他类似植物也在本发明的保护范围之内。
43.上海青种子用质量分数2％次氯酸钠溶液消毒1min，用无菌水冲洗5次。解磷菌3
‑
1在lb培养基中培养24h，无菌水洗涤菌体后制成浓度为1
×
108cfu/ml的菌悬液。将上海青种子用沾蘸法沾菌悬液5s，置于铺有2层湿滤纸的无菌培养皿中，保持水的高度在种子的1/2处，以无菌水处理种子做对照，每处理重复3次，室温条件下(23℃)培养4d。结果如表3和图5所示。
44.表3解磷菌3
‑
1对上海青种子萌发的影响由上表各数据可知，解磷菌3
‑
1菌悬液对上海青种子萌发有明显的促进作用；与ck相比，解磷菌3
‑
1菌悬液使上海青幼苗的芽长和发芽率分别显著增长了89.11％和19.45％，幼苗的根长和鲜质量分别显著增长了58.14％和32.26％；与ck相比，解磷菌3
‑
1菌悬液使上海青幼苗的发芽势、发芽指数和活力指数分别极显著提高了26.47％，49.47％和97.70％。
45.由上述各表数据可知，以上实施例仅为本发明的优选技术方案，并非对本发明范围的限制，本领域的技术人员可以对上述实施例中的说明与技术方案进行不同形式的修改和变动。在不违背本发明精神和原则的基础上，所作的任何修饰、改进、同等替换，均应保护在本发明的权利保护范围之内。序列表<110>三峡大学<120>解磷菌3
‑
1及在生产植物生长激素上的应用<130><160>1<210>1<211>1401<212>dna<213>解磷菌3
‑
1<400>1gctgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaa
cggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggtgttgaggttaataacctcagcaattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttaccagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtatgtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactgggggtgaa