1.本发明涉及生物
技术领域：
：，尤其涉及阴道微生物在鉴别诊断宫颈高级别上皮内病变中的应用。
背景技术：
：：2.人乳头瘤病毒(hpv)是全球女性性传播疾病(std)的最常见原因之一(1)。hpv感染的发生率在人的一生中很常见(在性生活活跃的人群中感染率>80％)，大约30％以上的hpv感染患者会同时感染多种类型hpv。然而，hpv相关疾病的发病率相对较低。10‑20％的hpv感染具有持续潜伏性，只有0.3‑1.2％的初始感染最终会发展为浸润性宫颈癌。持续性高危型hpv(hrhpv)感染并不总是导致宫颈上皮内肿瘤/癌症，其它如阴道微生物群失调等也可能起着重要作用。3.阴道生态系统作为微生物和宿主之间的微调平衡而存在。二代测序方法能够提供阴道微生物群更深入、详尽的微生物组成。有新的证据表明，阴道微生物在hpv引起的宫颈病变中发挥关键作用，并与防止微生态失调和hpv感染有关。研究表明性活跃且同时发生阴道微生态失调的妇女发生宫颈癌前病变及宫颈癌的风险增加。宫颈阴道微生态失调(多种原因导致，包括hpv感染或肿瘤细胞外)降低了宫颈阴道的屏障功能并且改变了其内的代谢组成，反之，这些改变又促进了hpv感染及宫颈癌前病变/癌的发生。4.宫颈上皮内瘤变是女性宫颈癌前病变的统称，持续性高危型人乳头瘤病毒(hpv)感染是诱发宫颈上皮内瘤变的病因，一些低级别的宫颈上皮内瘤变可自行消退，但级别较高的宫颈上皮内瘤变可能发展为癌。而宫颈高级别上皮内病变(hsil)恶变率更高，需要引起重视，积极治疗。宫颈细胞学和hpv检测广泛用于宫颈癌筛查，利于早期发现潜在的疾病。然而，尽管目前的筛查方案对于宫颈高级别上皮内病变的发现具有较高的敏感度，但其特异性欠满意。因此，发明人研究的目的是探索与宫颈高级别上皮内病变(hsil)最相关的阴道微生物的特异组成成分，从而辅助当前的宫颈癌筛查方法以减少不必要的有创检查及过度治疗。技术实现要素：5.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于宫颈高级别上皮内病变的的早期诊断和/或鉴别诊断的生物标志物，并提供其在制备诊断产品中的用途，辅助当前的宫颈癌筛查方法(宫颈细胞学和hpv检测)以减少不必要的有创检查及过度治疗。6.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：7.本发明第一方面提供了检测生物标志物的试剂在制备辅助诊断宫颈高级别上皮内病变的产品中的应用，所述生物标记物选自以下一种或多种组合：stenotrophomonas、faecalibacterium、bacteroides、bifidobacterium、streptococcus。8.优选地，所述辅助诊断包括鉴别诊断和/或早期诊断。9.优选地，所述鉴别诊断包括从hr‑hpv感染的患者中鉴别出hsil患者。10.本发明第二方面提供了一种鉴别诊断宫颈高级别上皮内病变的试剂盒，所述试剂盒包括检测受试者样本中stenotrophomonas和/或faecalibacterium和/或bifidobacterium的含量的试剂；优选地，所述受试者为hpv16和/或18感染患者。11.在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒诊断标准包括，所述受试者满足以下任一一个条件：stenotrophomonas含量在0.0090387％以上，所述faecalibacterium含量在0.01402015％以下，所述bifidobacterium含量在0.0116183％以下，判定为hsil患者。12.本发明第三方面提供了一种鉴别诊断宫颈高级别上皮内病变的试剂盒，所述试剂盒包括检测受试者样本中stenotrophomonas和/或streptococcus和/或bacteroides的含量的试剂；优选地，所述受试者为其他12种hpv感染且tct异常。所述其他12种hpv包括，hpv31、33、35、37、43、45、51、52、56、58、62、66。13.在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒诊断标准：所述受试者满足以下任一一个条件：当stenotrophomonas含量在0.01549105％以上，所述streptococcus的含量在0.48409585％以上，所述bacteroides的含量在0.0296912％以下，判定为hsil患者。14.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：15.本发明提供一组与宫颈高级别上皮内病变相关的生物标志物，stenotrophomonas、faecalibacterium、bacteroides、bifidobacterium和/或streptococcus可用于宫颈高级别上皮内病变的早期诊断和鉴别诊断，提高宫颈细胞学和hpv检测对宫颈癌筛查的阳性预测值。16.本发明提供一种灵敏度高、操作简单、无创快速的hsil辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括stenotrophomonas、faecalibacterium和bifidobacterium的含量的试剂，用于在hpv16和/或18感染人群中鉴别出hsil患者。发明提供一种灵敏度高、操作简单、无创快速的hsil辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括stenotrophomonas、streptococcus和bacteroides的含量的试剂，用于在其他12种hpv感染且tct异常人群中鉴别出hsil患者。发明人探索与宫颈高级别上皮内病变(hsil)最相关的阴道微生物，辅助当前的宫颈癌筛查方法以减少不必要的有创检查及过度治疗。附图说明17.图1本发明研究流程图。hpv，人乳头瘤病毒；hsil，高级别鳞状上皮内病变；tct、巴氏涂片检测。18.图2三组阴道细菌群落组成。(a)每组前10门相对丰度的条形图。(b)每组前10个属的相对丰度条形图。(c)每组前30属的相对丰度条形图。(d)每组前10种物种的相对丰度条形图。19.图3三组中阴道微生物组的结构。(a)三组中272个样本的物种累积箱线图。(b)三组中阴道微生物组多样性的稀疏曲线，误差条以标准偏差表示。alpha多样性分析揭示了三组内观察到的物种差异。(c)生物多样性柱状图。20.图4三组内的阴道微生物组组成标记。(a)基于加权平均数的unifrac距离矩阵热图，该距离图显示了三组之间的组间差异。图中的数字是两个样本之间的差系数。差异系数越小，微生物组多样性的差异就越小。(b)组间阴道微生物群差异分析柱状图。(c)对三组患者的阴道微生物群进行lefse分析。lefse可以识别出组间差异显著物种情况。该图中均具有统计学意义(p<0.05)，并且lda得分>±4。前缀代表每个分类单元的分类等级的缩写：门(p_)，类别(c_)，顺序(o_)，科(f_)，属(g_)，种类(s_)。(d)基于metastat分析各组中属水平丰度差异显著。(e)基于t检验分析各种组中属和种水平丰度差异显著。具体实施方式21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。22.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。23.下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。24.实施例1筛选与hsil相关的微生物标志物25.1、研究对象26.纳入2018年7月至2019年3月期间就诊于北京协和医院妇产科门诊的患者。所有参与者都是参加宫颈癌筛查的女性。27.纳入标准：年龄20‑72岁，有性生活3年以上，非月经期、非妊娠期、非产褥期。排除标准：无性生活的女性、子宫全切或次全切、急性生殖道炎症的患者。hiv阳性、有自身免疫性疾病或有恶性肿瘤病史的妇女。同时，所有参与者应满足以下要求：采样前14天内未使用全身抗生素或抗真菌药物使用或阴道栓剂的使用；采样前3天内没有同房，或采样前2天内没有进行阴道冲洗。28.2、标本采集29.患者首次就诊时采集标本。采用一次性未蘸润滑剂的无菌窥器充分暴露阴道和宫颈，用无菌拭子从阴道后穹窿取得阴道分泌物。将无菌拭子样本立即保存在‑80℃冰箱中，用于随后的dna提取。同时采集了tct及hpv的样本用于检测。30.所述患者对tct宫颈细胞学检测是使用pap测试仪(hologic，inc.，ma)进行液体pap试验；并基于实时定性pcr(rq‑pcr)的方法通过4800仪器(rochemoleculardiagnostics，ca)进行hpv基因分型检测。31.3、研究分组32.根据hpv、tct检测结果和宫颈活检病理结果，研究者被分为三组。33.a组：83例hpv感染并且宫颈活检证实为hsil患者(感染hpv16型和/或18型；或感染其他12种hr‑hpv(high‑riskhpv)超过1年；或感染其他12种高危hpv且宫颈细胞学异常)。34.b组：86例hpv感染但宫颈活检未发生宫颈病变的患者(lsil患者除外)(感染hpv16型和/或18型；或感染其他12种hr‑hpv超过1年；或感染其他12种hr‑hpv且宫颈细胞学异常的患者)。35.c组：103例无hpv感染、且tct结果正常的患者(入组者仅为常规体检就诊，且其当前hpv和tct检测结果均为阴性)。所有入选患者均未接受过物理治疗，如激光治疗、冷冻治疗或手术治疗，如宫颈环形电切术或冷刀锥切术。本研究的流程图如图1所示。36.4、16srrna测序37.4.1基因组dna的提取和pcr扩增38.采用sds方法对样本的基因组dna进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。39.以稀释后的基因组dna为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，newenglandbiolabs公司的high‑fidelitypcrmastermixwithgcbuffer，和高效高保真酶进行pcr，确保扩增效率和准确性。40.引物对应区域：41.16sv4区引物(515f和806r)：鉴定细菌多样性；42.4.2pcr产物的混样和纯化43.pcr产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。44.4.3文库构建和上机测序45.使用dnapcr‑freesamplepreparationkit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过qubit和q‑pcr定量，文库合格后，使用hiseq2500进行上机测序。测序实验由北京诺禾致源公司完成。46.5、数据分析47.对于临床数据分析，使用了spss23.0软件(spssinc.，chicago，il，usa)。符合正态分布的连续变量采用t检验，分类变量采用卡方检验。当p<0.05时认为有统计学差异。48.5.1测序数据处理49.根据barcode序列和pcr扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后使用flash(v1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/flash/)对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始tags数据(rawtags)；拼接得到的rawtags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的tags数据(cleantags)。参照qiime(v1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的tags质量控制流程，进行如下操作：a)tags截取：将rawtags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)tags长度过滤：tags经过截取后得到的tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于tags长度75％的tags。经过以上处理后得到的tags需要进行去除嵌合体序列的处理，tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(effectivetags)。50.5.2otu聚类和物种注释51.利用uparse算法(uparsev7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样本的全部effectivetags进行聚类，默认以97％的一致性(identity)将序列聚类成为otus(operationaltaxonomicunits)，同时会选取otus的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是otus中出现频数最高的序列作为otus的代表序列。对otus序列进行物种注释，用mothur方法与silva132(http://www.arb‑silva.de/)的ssurrna数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用muscle(version3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有otus代表序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的alpha多样性分析和beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。52.5.3样本复杂度分析(alphadiversity)53.使用qiime软件(version1.9.1)计算observed‑otus，chao1，shannon，simpson，ace，goods‑coverage，pd_whole_tree指数，使用r软件(version2.15.3)绘制稀释曲线，rankabundance曲线，物种累积曲线并使用r软件进行alpha多样性指数组间差异分析；alpha多样性指数组间差异分析会分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用t‑test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是tukey检验和agricolae包的wilcox检验。54.alpha多样性指数具体描述如下：55.计算菌群丰度(communityrichness)的指数有:56.chao‑thechao1estimator57.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.diversity.alpha.chao1)；58.ace‑theaceestimator59.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.ace.html#skbio.diversity.alpha.ace)；60.计算菌群多样性(communitydiversity)的指数有:61.shannon‑theshannonindex62.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon)；63.simpson‑thesimpsonindex64.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.simpson.html#skbio.diversity.alpha.simpson)；65.测序深度指数有:66.coverage‑thegood’scoverage67.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.goods_coverage.html#skbio.diversity.alpha.goods_coverage)；68.系统发育多样性的指数有：69.pd_whole_tree‑pd_whole_treeindex70.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.faith_pd.html？highlight＝pd#skbio.diversity.alpha.faith_pd)71.5.4多样本比较分析(betadiversity)72.用qiime软件(version1.9.1)计算unifrac距离、构建upgma样本聚类树。使用r软件(version2.15.3)绘制pca，pcoa和nmds图。pca分析使用r软件的ade4包和ggplot2软件包，pcoa分析使用r软件的wgcna，stats和ggplot2软件包，nmds分析使用r软件的vegan软件包。使用r软件进行beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用t‑test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是tukey检验和agricolae包的wilcox检验。73.lefse分析使用lefse软件，默认设置ldascore的筛选值为4。metastats分析使用r软件在各分类水平(phylum、class、order、family、genus、species)下，做组间的permutationtest，得到p值，然后利用benjaminiandhochbergfalsediscoveryrate方法对于p值进行修正，得到q值。anosim，mrpp和adonis分析分别使用rvegan包的anosim函数，mrpp函数和adonis函数。amova分析使用mothur软件amova函数。组间差异显著的物种分析利用r软件做组间t_test检验并作图。74.6、结果75.6.1临床信息统计76.三组患者的社会人口学基本相似。三组的平均年龄分别为38.34±10.18岁、39.00±9.28岁和39.35±9.43岁。三组的年龄(p＝0.773)、孕次(p＝0.057)、产次(p＝0.541)、月经周期(p＝0.177)和避孕方法(p＝0.489；表1)无显著差异。在169例确诊为hpv感染的病例中，共有63例感染hpv16型和/或18型，90例感染其他12种hr‑hpv。在63例感染hpv16型和/或18型的患者中，48例确诊为hsil，15例被没有发生宫颈病变。只有2例被证实为其他12种hr‑hpv持续感染，a组和b组各1例。此外，40例患者感染了其他12种hr‑hpv，且tct结果异常，16例诊断为hsil，而24例未发生宫颈病变。77.表1.患者人口学资料及基本临床特点。[0078][0079][0080]说明：p值是通过卡方检验或t‑检验计算获得。[0081]6.2阴道微生物群的鉴定[0082](1)微生物群落多样性[0083]阴道微生物群落鉴定共55个门，1217属，1211种。图2显示了阴道细菌在不同水平上的分布。[0084](2)三组阴道微生物组的结构[0085]图3显示，物种多样性随着样本量的增加而增加，表明样本量足以进行分析。从稀疏曲线(图3b)中，发明人可以看出，a组的微生物多样性最高，其次是c组，b组的多样性最低。a组的微生物多样性比b、c组丰富得多(a组与b组，p＝0.0065；a组与c组，p＝0.0253；b组与c组，p＝0.5359；图3c)。[0086](3)三组阴道微生物组成的鉴定[0087]基于加权unifrac距离的距离矩阵热图显示，a组和b组之间阴道微生物组的差异最大，b组和c组之间的差异最小(图4a)。三组内的阴道成分显著不同(a对b，a对c，b对c，p<0.05；图4b)。[0088]在属水平上，根据a、b和c组的顺序，stenotrophomonas的相对丰度依次下降，三组内存在统计学差异。根据a、b和c组的顺序，几个属的相对丰度梯度急剧增加，且具有显著差异，包括dialister,mobiluncus,faecalibacterium,unidentifiedprevotellaceae,unidentifiedruminococcaceaeandunidentifiedlachnospiraceae。此外，在b组中，delftia和bacteroides的相对丰度最高，bifidobacterium的相对丰度在c组中最高。a组的streptococcus和pseudomonas的相对丰度最高(图4c–e和tables2,3)。上述说明，上述具有差异的标志物可以作为诊断hsil的潜在生物标志物。[0089]将这些潜在标志物用于hpv16/18、其它12种高危hpv感染且tct异常的患者筛查流程中，分析标志物的在特定人群中对hsil的诊断价值。[0090]表2.三组中两两之间具有显著差异的属和种(部分数据)[0091][0092][0093]表3.采用lefse分析方法提示三组中显著差异的属和种(部分数据)[0094][0095]7、生物标记物的诊断功效[0096]在临床中，宫颈癌筛查方法主要是tct和hpv检测，检测出hpv16或18感染人群或其他12种高危hpv感染且tct结果异常的人群都需要做宫颈活检证实是否患有hsil。因此，本发明筛选与hsil相关的阴道微生物，从而辅助当前的宫颈癌筛查方法以减少不必要的有创检查及过度治疗。[0097]发明人为了说明上述筛得的标志物对hsil诊断价值，应用roc曲线对上述的差异属进行单个或组合标志计算在特定人群中鉴别诊断hsil患者的敏感性和特异性以及确定最佳诊断界值；所述特定人群包括hpv16或18感染人群，或其他12种高危hpv感染且tct结果异常人群。[0098]具体，在63例感染hpv16型和/或18型的患者中，其中，48例经宫颈活检证实诊断hsil患者，15例经宫颈活检证实没有宫颈病变。应用roc曲线分析，筛选诊断特异性和灵敏度较高stenotrophomonas、faecalibacterium、bifidobacterium标志物，确定其最佳诊断的相对丰度(cut‑off值)，根据最佳的相对丰度，以辅助宫颈癌筛查避免不必要的宫颈活检。当满足以下任一一个条件时：stenotrophomonas的相对丰度在0.0090387％以上、faecalibacterium的相对丰度在0.01402015％以下，bifidobacterium的相对丰度在0.0116183％以下，即判定为hsil患者。上述判定hsil的敏感性(sensitivity，se)为97.9％，特异性(specificity，sp)为26.7％，阳性预测值(positivepredictivevalue，ppv)为81.03％。ppv从76.19％提高至81.03％。表4也说明，5例避免有创检查的患者中有4例患者是未发生hsil的(表4)。[0099]此外，在40例感染了其他12种高危hpv且tct结果异常的患者中，其中16例诊断为hsil，24例没有宫颈病变。应用roc曲线分析，筛选诊断特异性、灵敏度较高stenotrophomonas、streptococcus、bacteroides标志物，确定其最佳诊断的相对丰度(cut‑off值)，根据最佳的相对丰度，以辅助宫颈癌筛查避免不必要的宫颈活检。当满足以下任一一种条件时：stenotrophomonas的相对丰度在0.01549105％以上，streptococcus的相对丰度在0.48409585％以上，bacteroides的相对丰度在0.0296912％以下，判定为hsil患者。上述判定hsil的敏感性为100％，特异性为45.8％，阳性预测值为55.17％。ppv从40.00％提高至55.17％。也就是说，对于hpv其它12种感染且tct异常的患者，11例避免了有创活检且均未发生hsil(表4)。[0100]表4.不同宫颈癌筛查方案预测hsil的准确性。[0101][0102][0103]注释：*正常tct结果定义为“未见上皮内病变或未见恶性细胞”。异常tct结果包括：ascus(意义未明不典型鳞状上皮)、lsil(低级别鳞状上皮内病变)、hsil(高级别上皮内病变)、asc‑h(不除外高级别上皮内瘤变的不典型鳞状上皮)。“符合”，分别指符合hpv检查，hpv tct检查，hpv 微生物，以及hpv tct 微生物的结果。[0104]当前的宫颈癌筛查法结合本发明提供的两种诊断方式(试剂盒)，提高阳性预测值，可减少不必要的有创检查及过度治疗。[0105]在临床应用中，本发明试剂盒并不作为独立诊断hsil患者，需要结合宫颈活检进一步验证本发明诊断的阳性病例。[0106]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12当前第1页12
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：，尤其涉及阴道微生物在鉴别诊断宫颈高级别上皮内病变中的应用。
背景技术：
：：2.人乳头瘤病毒(hpv)是全球女性性传播疾病(std)的最常见原因之一(1)。hpv感染的发生率在人的一生中很常见(在性生活活跃的人群中感染率>80％)，大约30％以上的hpv感染患者会同时感染多种类型hpv。然而，hpv相关疾病的发病率相对较低。10‑20％的hpv感染具有持续潜伏性，只有0.3‑1.2％的初始感染最终会发展为浸润性宫颈癌。持续性高危型hpv(hrhpv)感染并不总是导致宫颈上皮内肿瘤/癌症，其它如阴道微生物群失调等也可能起着重要作用。3.阴道生态系统作为微生物和宿主之间的微调平衡而存在。二代测序方法能够提供阴道微生物群更深入、详尽的微生物组成。有新的证据表明，阴道微生物在hpv引起的宫颈病变中发挥关键作用，并与防止微生态失调和hpv感染有关。研究表明性活跃且同时发生阴道微生态失调的妇女发生宫颈癌前病变及宫颈癌的风险增加。宫颈阴道微生态失调(多种原因导致，包括hpv感染或肿瘤细胞外)降低了宫颈阴道的屏障功能并且改变了其内的代谢组成，反之，这些改变又促进了hpv感染及宫颈癌前病变/癌的发生。4.宫颈上皮内瘤变是女性宫颈癌前病变的统称，持续性高危型人乳头瘤病毒(hpv)感染是诱发宫颈上皮内瘤变的病因，一些低级别的宫颈上皮内瘤变可自行消退，但级别较高的宫颈上皮内瘤变可能发展为癌。而宫颈高级别上皮内病变(hsil)恶变率更高，需要引起重视，积极治疗。宫颈细胞学和hpv检测广泛用于宫颈癌筛查，利于早期发现潜在的疾病。然而，尽管目前的筛查方案对于宫颈高级别上皮内病变的发现具有较高的敏感度，但其特异性欠满意。因此，发明人研究的目的是探索与宫颈高级别上皮内病变(hsil)最相关的阴道微生物的特异组成成分，从而辅助当前的宫颈癌筛查方法以减少不必要的有创检查及过度治疗。技术实现要素：5.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于宫颈高级别上皮内病变的的早期诊断和/或鉴别诊断的生物标志物，并提供其在制备诊断产品中的用途，辅助当前的宫颈癌筛查方法(宫颈细胞学和hpv检测)以减少不必要的有创检查及过度治疗。6.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：7.本发明第一方面提供了检测生物标志物的试剂在制备辅助诊断宫颈高级别上皮内病变的产品中的应用，所述生物标记物选自以下一种或多种组合：stenotrophomonas、faecalibacterium、bacteroides、bifidobacterium、streptococcus。8.优选地，所述辅助诊断包括鉴别诊断和/或早期诊断。9.优选地，所述鉴别诊断包括从hr‑hpv感染的患者中鉴别出hsil患者。10.本发明第二方面提供了一种鉴别诊断宫颈高级别上皮内病变的试剂盒，所述试剂盒包括检测受试者样本中stenotrophomonas和/或faecalibacterium和/或bifidobacterium的含量的试剂；优选地，所述受试者为hpv16和/或18感染患者。11.在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒诊断标准包括，所述受试者满足以下任一一个条件：stenotrophomonas含量在0.0090387％以上，所述faecalibacterium含量在0.01402015％以下，所述bifidobacterium含量在0.0116183％以下，判定为hsil患者。12.本发明第三方面提供了一种鉴别诊断宫颈高级别上皮内病变的试剂盒，所述试剂盒包括检测受试者样本中stenotrophomonas和/或streptococcus和/或bacteroides的含量的试剂；优选地，所述受试者为其他12种hpv感染且tct异常。所述其他12种hpv包括，hpv31、33、35、37、43、45、51、52、56、58、62、66。13.在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒诊断标准：所述受试者满足以下任一一个条件：当stenotrophomonas含量在0.01549105％以上，所述streptococcus的含量在0.48409585％以上，所述bacteroides的含量在0.0296912％以下，判定为hsil患者。14.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：15.本发明提供一组与宫颈高级别上皮内病变相关的生物标志物，stenotrophomonas、faecalibacterium、bacteroides、bifidobacterium和/或streptococcus可用于宫颈高级别上皮内病变的早期诊断和鉴别诊断，提高宫颈细胞学和hpv检测对宫颈癌筛查的阳性预测值。16.本发明提供一种灵敏度高、操作简单、无创快速的hsil辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括stenotrophomonas、faecalibacterium和bifidobacterium的含量的试剂，用于在hpv16和/或18感染人群中鉴别出hsil患者。发明提供一种灵敏度高、操作简单、无创快速的hsil辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括stenotrophomonas、streptococcus和bacteroides的含量的试剂，用于在其他12种hpv感染且tct异常人群中鉴别出hsil患者。发明人探索与宫颈高级别上皮内病变(hsil)最相关的阴道微生物，辅助当前的宫颈癌筛查方法以减少不必要的有创检查及过度治疗。附图说明17.图1本发明研究流程图。hpv，人乳头瘤病毒；hsil，高级别鳞状上皮内病变；tct、巴氏涂片检测。18.图2三组阴道细菌群落组成。(a)每组前10门相对丰度的条形图。(b)每组前10个属的相对丰度条形图。(c)每组前30属的相对丰度条形图。(d)每组前10种物种的相对丰度条形图。19.图3三组中阴道微生物组的结构。(a)三组中272个样本的物种累积箱线图。(b)三组中阴道微生物组多样性的稀疏曲线，误差条以标准偏差表示。alpha多样性分析揭示了三组内观察到的物种差异。(c)生物多样性柱状图。20.图4三组内的阴道微生物组组成标记。(a)基于加权平均数的unifrac距离矩阵热图，该距离图显示了三组之间的组间差异。图中的数字是两个样本之间的差系数。差异系数越小，微生物组多样性的差异就越小。(b)组间阴道微生物群差异分析柱状图。(c)对三组患者的阴道微生物群进行lefse分析。lefse可以识别出组间差异显著物种情况。该图中均具有统计学意义(p<0.05)，并且lda得分>±4。前缀代表每个分类单元的分类等级的缩写：门(p_)，类别(c_)，顺序(o_)，科(f_)，属(g_)，种类(s_)。(d)基于metastat分析各组中属水平丰度差异显著。(e)基于t检验分析各种组中属和种水平丰度差异显著。具体实施方式21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。22.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。23.下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。24.实施例1筛选与hsil相关的微生物标志物25.1、研究对象26.纳入2018年7月至2019年3月期间就诊于北京协和医院妇产科门诊的患者。所有参与者都是参加宫颈癌筛查的女性。27.纳入标准：年龄20‑72岁，有性生活3年以上，非月经期、非妊娠期、非产褥期。排除标准：无性生活的女性、子宫全切或次全切、急性生殖道炎症的患者。hiv阳性、有自身免疫性疾病或有恶性肿瘤病史的妇女。同时，所有参与者应满足以下要求：采样前14天内未使用全身抗生素或抗真菌药物使用或阴道栓剂的使用；采样前3天内没有同房，或采样前2天内没有进行阴道冲洗。28.2、标本采集29.患者首次就诊时采集标本。采用一次性未蘸润滑剂的无菌窥器充分暴露阴道和宫颈，用无菌拭子从阴道后穹窿取得阴道分泌物。将无菌拭子样本立即保存在‑80℃冰箱中，用于随后的dna提取。同时采集了tct及hpv的样本用于检测。30.所述患者对tct宫颈细胞学检测是使用pap测试仪(hologic，inc.，ma)进行液体pap试验；并基于实时定性pcr(rq‑pcr)的方法通过4800仪器(rochemoleculardiagnostics，ca)进行hpv基因分型检测。31.3、研究分组32.根据hpv、tct检测结果和宫颈活检病理结果，研究者被分为三组。33.a组：83例hpv感染并且宫颈活检证实为hsil患者(感染hpv16型和/或18型；或感染其他12种hr‑hpv(high‑riskhpv)超过1年；或感染其他12种高危hpv且宫颈细胞学异常)。34.b组：86例hpv感染但宫颈活检未发生宫颈病变的患者(lsil患者除外)(感染hpv16型和/或18型；或感染其他12种hr‑hpv超过1年；或感染其他12种hr‑hpv且宫颈细胞学异常的患者)。35.c组：103例无hpv感染、且tct结果正常的患者(入组者仅为常规体检就诊，且其当前hpv和tct检测结果均为阴性)。所有入选患者均未接受过物理治疗，如激光治疗、冷冻治疗或手术治疗，如宫颈环形电切术或冷刀锥切术。本研究的流程图如图1所示。36.4、16srrna测序37.4.1基因组dna的提取和pcr扩增38.采用sds方法对样本的基因组dna进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。39.以稀释后的基因组dna为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，newenglandbiolabs公司的high‑fidelitypcrmastermixwithgcbuffer，和高效高保真酶进行pcr，确保扩增效率和准确性。40.引物对应区域：41.16sv4区引物(515f和806r)：鉴定细菌多样性；42.4.2pcr产物的混样和纯化43.pcr产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。44.4.3文库构建和上机测序45.使用dnapcr‑freesamplepreparationkit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过qubit和q‑pcr定量，文库合格后，使用hiseq2500进行上机测序。测序实验由北京诺禾致源公司完成。46.5、数据分析47.对于临床数据分析，使用了spss23.0软件(spssinc.，chicago，il，usa)。符合正态分布的连续变量采用t检验，分类变量采用卡方检验。当p<0.05时认为有统计学差异。48.5.1测序数据处理49.根据barcode序列和pcr扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后使用flash(v1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/flash/)对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始tags数据(rawtags)；拼接得到的rawtags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的tags数据(cleantags)。参照qiime(v1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的tags质量控制流程，进行如下操作：a)tags截取：将rawtags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)tags长度过滤：tags经过截取后得到的tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于tags长度75％的tags。经过以上处理后得到的tags需要进行去除嵌合体序列的处理，tags序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(effectivetags)。50.5.2otu聚类和物种注释51.利用uparse算法(uparsev7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样本的全部effectivetags进行聚类，默认以97％的一致性(identity)将序列聚类成为otus(operationaltaxonomicunits)，同时会选取otus的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是otus中出现频数最高的序列作为otus的代表序列。对otus序列进行物种注释，用mothur方法与silva132(http://www.arb‑silva.de/)的ssurrna数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用muscle(version3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)软件进行快速多序列比对，得到所有otus代表序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的alpha多样性分析和beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。52.5.3样本复杂度分析(alphadiversity)53.使用qiime软件(version1.9.1)计算observed‑otus，chao1，shannon，simpson，ace，goods‑coverage，pd_whole_tree指数，使用r软件(version2.15.3)绘制稀释曲线，rankabundance曲线，物种累积曲线并使用r软件进行alpha多样性指数组间差异分析；alpha多样性指数组间差异分析会分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用t‑test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是tukey检验和agricolae包的wilcox检验。54.alpha多样性指数具体描述如下：55.计算菌群丰度(communityrichness)的指数有:56.chao‑thechao1estimator57.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.diversity.alpha.chao1)；58.ace‑theaceestimator59.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.ace.html#skbio.diversity.alpha.ace)；60.计算菌群多样性(communitydiversity)的指数有:61.shannon‑theshannonindex62.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon)；63.simpson‑thesimpsonindex64.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.simpson.html#skbio.diversity.alpha.simpson)；65.测序深度指数有:66.coverage‑thegood’scoverage67.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.goods_coverage.html#skbio.diversity.alpha.goods_coverage)；68.系统发育多样性的指数有：69.pd_whole_tree‑pd_whole_treeindex70.(http://scikit‑bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.faith_pd.html？highlight＝pd#skbio.diversity.alpha.faith_pd)71.5.4多样本比较分析(betadiversity)72.用qiime软件(version1.9.1)计算unifrac距离、构建upgma样本聚类树。使用r软件(version2.15.3)绘制pca，pcoa和nmds图。pca分析使用r软件的ade4包和ggplot2软件包，pcoa分析使用r软件的wgcna，stats和ggplot2软件包，nmds分析使用r软件的vegan软件包。使用r软件进行beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用t‑test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是tukey检验和agricolae包的wilcox检验。73.lefse分析使用lefse软件，默认设置ldascore的筛选值为4。metastats分析使用r软件在各分类水平(phylum、class、order、family、genus、species)下，做组间的permutationtest，得到p值，然后利用benjaminiandhochbergfalsediscoveryrate方法对于p值进行修正，得到q值。anosim，mrpp和adonis分析分别使用rvegan包的anosim函数，mrpp函数和adonis函数。amova分析使用mothur软件amova函数。组间差异显著的物种分析利用r软件做组间t_test检验并作图。74.6、结果75.6.1临床信息统计76.三组患者的社会人口学基本相似。三组的平均年龄分别为38.34±10.18岁、39.00±9.28岁和39.35±9.43岁。三组的年龄(p＝0.773)、孕次(p＝0.057)、产次(p＝0.541)、月经周期(p＝0.177)和避孕方法(p＝0.489；表1)无显著差异。在169例确诊为hpv感染的病例中，共有63例感染hpv16型和/或18型，90例感染其他12种hr‑hpv。在63例感染hpv16型和/或18型的患者中，48例确诊为hsil，15例被没有发生宫颈病变。只有2例被证实为其他12种hr‑hpv持续感染，a组和b组各1例。此外，40例患者感染了其他12种hr‑hpv，且tct结果异常，16例诊断为hsil，而24例未发生宫颈病变。77.表1.患者人口学资料及基本临床特点。[0078][0079][0080]说明：p值是通过卡方检验或t‑检验计算获得。[0081]6.2阴道微生物群的鉴定[0082](1)微生物群落多样性[0083]阴道微生物群落鉴定共55个门，1217属，1211种。图2显示了阴道细菌在不同水平上的分布。[0084](2)三组阴道微生物组的结构[0085]图3显示，物种多样性随着样本量的增加而增加，表明样本量足以进行分析。从稀疏曲线(图3b)中，发明人可以看出，a组的微生物多样性最高，其次是c组，b组的多样性最低。a组的微生物多样性比b、c组丰富得多(a组与b组，p＝0.0065；a组与c组，p＝0.0253；b组与c组，p＝0.5359；图3c)。[0086](3)三组阴道微生物组成的鉴定[0087]基于加权unifrac距离的距离矩阵热图显示，a组和b组之间阴道微生物组的差异最大，b组和c组之间的差异最小(图4a)。三组内的阴道成分显著不同(a对b，a对c，b对c，p<0.05；图4b)。[0088]在属水平上，根据a、b和c组的顺序，stenotrophomonas的相对丰度依次下降，三组内存在统计学差异。根据a、b和c组的顺序，几个属的相对丰度梯度急剧增加，且具有显著差异，包括dialister,mobiluncus,faecalibacterium,unidentifiedprevotellaceae,unidentifiedruminococcaceaeandunidentifiedlachnospiraceae。此外，在b组中，delftia和bacteroides的相对丰度最高，bifidobacterium的相对丰度在c组中最高。a组的streptococcus和pseudomonas的相对丰度最高(图4c–e和tables2,3)。上述说明，上述具有差异的标志物可以作为诊断hsil的潜在生物标志物。[0089]将这些潜在标志物用于hpv16/18、其它12种高危hpv感染且tct异常的患者筛查流程中，分析标志物的在特定人群中对hsil的诊断价值。[0090]表2.三组中两两之间具有显著差异的属和种(部分数据)[0091][0092][0093]表3.采用lefse分析方法提示三组中显著差异的属和种(部分数据)[0094][0095]7、生物标记物的诊断功效[0096]在临床中，宫颈癌筛查方法主要是tct和hpv检测，检测出hpv16或18感染人群或其他12种高危hpv感染且tct结果异常的人群都需要做宫颈活检证实是否患有hsil。因此，本发明筛选与hsil相关的阴道微生物，从而辅助当前的宫颈癌筛查方法以减少不必要的有创检查及过度治疗。[0097]发明人为了说明上述筛得的标志物对hsil诊断价值，应用roc曲线对上述的差异属进行单个或组合标志计算在特定人群中鉴别诊断hsil患者的敏感性和特异性以及确定最佳诊断界值；所述特定人群包括hpv16或18感染人群，或其他12种高危hpv感染且tct结果异常人群。[0098]具体，在63例感染hpv16型和/或18型的患者中，其中，48例经宫颈活检证实诊断hsil患者，15例经宫颈活检证实没有宫颈病变。应用roc曲线分析，筛选诊断特异性和灵敏度较高stenotrophomonas、faecalibacterium、bifidobacterium标志物，确定其最佳诊断的相对丰度(cut‑off值)，根据最佳的相对丰度，以辅助宫颈癌筛查避免不必要的宫颈活检。当满足以下任一一个条件时：stenotrophomonas的相对丰度在0.0090387％以上、faecalibacterium的相对丰度在0.01402015％以下，bifidobacterium的相对丰度在0.0116183％以下，即判定为hsil患者。上述判定hsil的敏感性(sensitivity，se)为97.9％，特异性(specificity，sp)为26.7％，阳性预测值(positivepredictivevalue，ppv)为81.03％。ppv从76.19％提高至81.03％。表4也说明，5例避免有创检查的患者中有4例患者是未发生hsil的(表4)。[0099]此外，在40例感染了其他12种高危hpv且tct结果异常的患者中，其中16例诊断为hsil，24例没有宫颈病变。应用roc曲线分析，筛选诊断特异性、灵敏度较高stenotrophomonas、streptococcus、bacteroides标志物，确定其最佳诊断的相对丰度(cut‑off值)，根据最佳的相对丰度，以辅助宫颈癌筛查避免不必要的宫颈活检。当满足以下任一一种条件时：stenotrophomonas的相对丰度在0.01549105％以上，streptococcus的相对丰度在0.48409585％以上，bacteroides的相对丰度在0.0296912％以下，判定为hsil患者。上述判定hsil的敏感性为100％，特异性为45.8％，阳性预测值为55.17％。ppv从40.00％提高至55.17％。也就是说，对于hpv其它12种感染且tct异常的患者，11例避免了有创活检且均未发生hsil(表4)。[0100]表4.不同宫颈癌筛查方案预测hsil的准确性。[0101][0102][0103]注释：*正常tct结果定义为“未见上皮内病变或未见恶性细胞”。异常tct结果包括：ascus(意义未明不典型鳞状上皮)、lsil(低级别鳞状上皮内病变)、hsil(高级别上皮内病变)、asc‑h(不除外高级别上皮内瘤变的不典型鳞状上皮)。“符合”，分别指符合hpv检查，hpv tct检查，hpv 微生物，以及hpv tct 微生物的结果。[0104]当前的宫颈癌筛查法结合本发明提供的两种诊断方式(试剂盒)，提高阳性预测值，可减少不必要的有创检查及过度治疗。[0105]在临床应用中，本发明试剂盒并不作为独立诊断hsil患者，需要结合宫颈活检进一步验证本发明诊断的阳性病例。[0106]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12当前第1页12
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