用于检测半滑舌鳎白细胞介素IL-6基因表达水平的引物组合物及其应用的制作方法

用于检测半滑舌鳎白细胞介素il
‑
6基因表达水平的引物组合物及其应用
技术领域
1.本发明属于基因技术领域，尤其是一种用于检测半滑舌鳎白细胞介素il
‑
6基因表达水平的引物组合物及其应用。


背景技术：

2.细胞白介素(il)
‑
6由许多不同类型的细胞分泌，并作用于t细胞、b细胞和干细胞，从而刺激细胞增殖和分化，调节基因表达和细胞存活。它在机体防御中承担着重要功能，是最重要的促炎细胞因子之一。当机体受到感染或组织损伤时，il
‑
6可激活免疫和急性期反应，在宿主暴露于病原体后第一时间被释放，帮助机体清除感染源并恢复受损组织。因此它的调节表达与病原体感染和和免疫刺激有关。研究其在半滑舌鳎中的表达情况，建立一种可靠的、高效的基因表达水平检测方法具有重要意义，为深入了解半滑舌鳎的先天性免疫奠定基础。
3.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测半滑舌鳎白细胞介素il
‑
6基因表达水平的引物组合物及其应用。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
6.一种用于检测半滑舌鳎白细胞介素il
‑
6基因表达水平的引物组合物，其特征在于：所述组合物由引物组1和引物组2组成；所述引物组1用于半滑舌鳎il
‑
6基因检测，所述引物组2用于β
‑
actin内参基因检测；所述引物组1由序列seq id no.1和seq id no.2所示的引物组成；所述引物组2由序列seq id no.3和seq id no.4所示的引物组成；
7.其中，所述引物组1和引物组2的上游和下游引物的终浓度均为0.3
‑
0.4μm；
8.seq id no.1：ccctcaaagccaagtttctgtc
9.seq id no.2：tacatcctcctcctcacctgaa
10.seq id no.3：gctgtgctatgtcgccttg
11.seq id no.4：taccaaggaaggaaggctg
12.如上所述的引物组合物在制备用于检测半滑舌鳎白细胞il
‑
6基因表达水平的试剂盒中应用。
13.进一步地，采用2
‑
δδct
相对定量方法计算不同样品的il
‑
6基因表达水平。
14.一种用于检测半滑舌鳎il
‑
6基因表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组合物和荧光染料。
15.进一步地，所述荧光染料为sybr green荧光染料。
16.一种用于检测半滑舌鳎il
‑
6基因表达水平的方法：包括以下步骤：
17.步骤1：提取样品中的rna；
18.步骤2：将步骤1中提取出来的rna反转录成cdna；
19.步骤3：以上述的引物组合物为引物，用荧光定量pcr方法检测il
‑
6基因以及内参基因β
‑
actin表达水平。
20.较优地，步骤3中荧光定量pcr反应条件为95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃退火30s，运行40个循环；95℃5s，60℃1min，运行1个循环；50℃30s降温结束反应。
21.本发明取得的优点和积极效果为：
22.本发明设计的引物组合物能够实现对半滑舌鳎il
‑
6基因的特异性扩增，荧光定量pcr反应的扩增和熔解曲线仅见单独的峰，特异性强。通过本发明建立的实时荧光定量方法对样品中的il
‑
6基因表达水平进行定量，其检测灵敏度非常高。同时，整个检测过程无需进行电泳，可通过电脑快速得到实验结果，而传统的半定量检测方法需要1.5h来完成扩增反应，然后还需要花2个小时进行凝胶电泳来观察结果。相比之下，本发明节省了人力、物力和时间。
附图说明
23.图1为本发明中半滑舌鳎il
‑
6基因的扩增曲线；
24.图2为本发明中半滑舌鳎il
‑
6基因的熔解曲线；
25.图3为本发明中半滑舌鳎β
‑
actin基因的扩增曲线；
26.图4为本发明中半滑舌鳎β
‑
actin基因的熔解曲线；
27.图5为本发明中半滑舌鳎il
‑
6基因扩增产物胶图；其中，m为marker，1为il
‑
6基因肾脏扩增产物，2为β
‑
actin基因肾脏扩增产物；
28.图6为本发明中il
‑
6基因在经灭活鳗弧菌刺激的半滑舌鳎各组织中的相对表达图。
具体实施方式
29.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
30.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
31.一种用于检测半滑舌鳎白细胞介素il
‑
6基因表达水平的引物组合物，其特征在于：所述组合物由引物组1和引物组2组成；所述引物组1用于半滑舌鳎il
‑
6基因检测，所述引物组2用于β
‑
actin内参基因检测；所述引物组1由序列seq id no.1和seq id no.2所示的引物组成；所述引物组2由序列seq id no.3和seq id no.4所示的引物组成；
32.其中，所述引物组1和引物组2的上游和下游引物的终浓度均为0.3
‑
0.4μm；
33.seq id no.1：ccctcaaagccaagtttctgtc
34.seq id no.2：tacatcctcctcctcacctgaa
35.seq id no.3：gctgtgctatgtcgccttg
36.seq id no.4：taccaaggaaggaaggctg
37.如上所述的引物组合物在制备用于检测半滑舌鳎白细胞il
‑
6基因表达水平的试剂盒中应用。
38.较优地，采用2
‑
δδct
相对定量方法计算不同样品的il
‑
6基因表达水平。
39.一种用于检测半滑舌鳎il
‑
6基因表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组合物和荧光染料。
40.较优地，所述荧光染料为sybr green荧光染料。
41.一种用于检测半滑舌鳎il
‑
6基因表达水平的方法：包括以下步骤：
42.步骤1：提取样品中的rna；
43.步骤2：将步骤1中提取出来的rna反转录成cdna；
44.步骤3：以上述的引物组合物为引物，用荧光定量pcr方法检测il
‑
6基因以及内参基因β
‑
actin表达水平。
45.较优地步骤3中荧光定量pcr反应条件为95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃退火30s，运行40个循环；95℃5s，60℃1min，运行1个循环；50℃30s降温结束反应。
46.具体地，相关制备及检测如下：
47.实施例1
48.本实施例为引物组合物的使用方法，具体包括以下步骤：
49.步骤1：组织rna提取
50.用商品化试剂盒来提取组织rna，所提取的rna用超微量分光光度计测定rna浓度，od260/280值和od260/230值。本实施例用rna提取试剂盒(takara minibest universal rna extraction kit)来提取组织rna，具体操作按说明书进行。
51.步骤2：cdna反转录
52.取大约500ng rna，用takara商品化试剂盒primescript
tm rt reagent kit(perfect real time)来合成cdna，具体操作按说明书进行。
53.步骤3：荧光定量pcr反应
54.按takara生物有限公司产品pcr试剂(tb green premix ex taqii)，进行实时荧光定量扩增和数据分析，pcr扩增体系为：tb green premix ex taqii(2
×
)10μl，上、下游引物终浓度为0.3
‑
0.4μm，cdna模板2μl，体系总体积为20μl。
55.荧光定量pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃退火30s，运行40个循环；熔解程序为：95℃5s,60℃1min，运行1个循环；50℃30s降温结束反应。
56.本发明实施例荧光定量pcr仪采用applied biosystems step one plus real
‑
time pcr system。
57.步骤4：检测并分析结果
58.根据系统自动基线和对数期阈值设置获得各个反应的ct值。
59.计算2
‑
δδct
值，即实验组il
‑
6基因mrna表达水平与对照组比较的倍数。
60.δδct＝(ct il
‑6(实验组)
‑
ct
β
‑
actin
(实验组))
‑
(ct
il
‑6(对照组)
‑
ct
β
‑
actin
(对照组))
61.检测结果表明il
‑
6基因以及内参基因β
‑
actin引物扩增的熔解曲线均只出现单一的熔解峰(见图1、图2、图3、图4)，反应产物的电泳结果仅见一条特异性表达条带(见图5)，表明扩增的目的片段特异性良好，无非特异性扩增。
62.实施例2
63.本实施例对经灭活鳗弧菌刺激的半滑舌鳎各组织的白细胞介素il
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6基因表达水
平进行分析，具体步骤如下：
64.取健康半滑舌鳎幼鱼，体长13
‑
16cm，随机分成两组，分别为实验组和对照组。对照组每尾鱼腹腔注射0.1ml无菌pbs，实验组每尾鱼腹腔注射0.1ml灭活鳗弧菌菌液，菌液浓度为108cfu/ml，于注射后4h分别取半滑舌鳎的肝、脾、后肠和肾组织保存于
‑
80℃冰箱。
65.提取处理组和实验组各组织rna，反转录后采用荧光定量pcr检测il
‑
6基因表达水平。通过与对照组比较，计算出各组织中il
‑
6基因的相对表达水平(见图6)，结果表明经灭活鳗弧菌刺激4h的半滑舌鳎肝和脾组织中的il
‑
6基因表达量下调，是对照组的0.73倍和0.23倍，而后肠和肾组织中的il
‑
6基因表达量上调，是对照组的1.69倍和1.70倍。
66.上述实验说明本发明引物组合物可用于il
‑
6mrna表达水平的检测，为研究半滑舌鳎il
‑
6基因的功能及影响因素提供了有效工具和可靠手段。
67.以上对本发明的具体实施例进行了描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。