一种密码子优化的基因、重组表达载体、重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种密码子优化的基因、重组表 达载体、重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用。


背景技术：

2.结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)是引起结核病 (tuberculosis)主要胞内菌。由于卡介苗(bcg)功效低下，抗生素 滥用导致的耐药性增强，使结核病再次威胁全球健康。据世界卫生组 织(who)统计，2019年全球范围内，新增加1000万病例，引起 141万患者死亡，是单个传染病导致死亡首要因素。
3.结核分枝杆菌pe_pgrs45蛋白由rv2615c基因编码得到的，与pe_pgrs17 (rv0978c)和pe_pgrs18(rv0980c)具有高度同源性。生物信息学分析发现， pe_pgrs45保守的四肽基序(devs/dxxs)丝氨酸残基磷酸化后可竞争性与 caspase
‑
3蛋白结合，参与宿主细胞程序化死亡，暗示pe_pgrs45在结核分枝杆菌 感染中具有重要意义。因此，从pe_pgrs45基因着手寻求一种获得高效价的多克 隆抗体的方法是迫在眉睫的。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种密码子优化的基因、重组表达载体、 重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用。本发明将pe_pgrs45基因进行密码子 优化，并以此能得到本发明所述pe_pgrs45重组蛋白，进而获得高效价高多克隆 抗体。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种密码子优化的pe_pgrs45基因，所述pe_pgrs45基因核 苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明提供了一种包含上述基因的重组表达载体，所述重组表达载体的基础 质粒包括包括pmal
‑
c5x。
8.优选的，所述基因的核苷酸序列位于所述pmal
‑
c5x的nde i和hind
ꢀⅲ
酶切 位点之间。
9.本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.8所 示。
10.本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白的编码基因的序列包括seq idno.1所示的序列。
11.本发明提供了上述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
12.利用上述重组表达载体转化大肠杆菌后，依次进行培养和诱导，得重组蛋白。
13.优选的，在培养时，采用的培养基为含抗生素的lb液体培养基；所述培养的 温度为20～37℃，培养的结束标准为培养所得菌液的od
600
＝0.4～0.6；
14.在诱导时，采用的培养基包括以下浓度的组分：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物 5g/l、氯化钠10g/l、卡那霉素50ug/ml和0.5mm iptg；
15.所述诱导的温度为20～37℃，转速为200r/min，时间为12h。
16.本发明提供了一种效价高的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
17.以上述重组蛋白为抗原免疫宿主，得抗pe_pgrs45的多克隆抗体。
18.本发明提供了上述制备方法制备得到的多克隆抗体在制备诊断结核病试剂盒 中的应用。
19.本发明提供了一种用于诊断结核病的试剂盒，包括上述制备方法制备得到的 多克隆抗体。
20.本发明提供了一种密码子优化的pe_pgrs45基因，所述pe_pgrs45基因核 苷酸序列如seq id no.1所示。利用本发明所述pe_pgrs45基因能够获得效价高 的多克隆抗体。本发明具体实施例中试验结果表明，该基因的密码子适应指数(cai) 从0.73增加到0.90。
附图说明
21.图1为结核分枝杆菌pe_pgrs45同源氨基酸序列对比图，其中，m.tuberculosis 为结核分枝杆菌，m.bovis为牛分枝杆菌，m.africanum为非洲分枝杆菌，m.canettii 为卡耐提分枝杆菌，m.caprae为山羊分枝杆菌，每排最下面的序列为m. tuberculosis、m.bovis、m.africanum、m.canettii和m.caprae 5中菌相同的序列；
22.图2为结核分枝杆菌pe_pgrs45基因密码子分析图；
23.图3为重组表达载体鉴定结果，其中a为ncoⅰ和xhoⅰ酶切重组表达载体 pet
‑
28a
‑
pe_pgrs4结果，m为dna marker，1为pet
‑
28a
‑
pe_pgrs4重组表达 载体，b为ncoⅰ和xhoⅰ酶切重组表达载体pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45结果，m为 dna marker，1为重组表达载体pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45，c为nde
ꢀⅰ
和hind iii酶 切重组表达载体pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45结果，m为dna marker，1为重组表达载 体pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45；
24.图4为密码子优化后pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45和pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45重组表达 载体sds
‑
page分析，a为20℃时pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45在大肠杆菌中的融合表 达，b为37℃时pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45在大肠杆菌中的融合表达，c为20℃时 pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45在大肠杆菌中的融合表达，d为37℃时pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45 在大肠杆菌中的融合表达，m为蛋白质标记，1为诱导前大肠杆菌细胞，2为诱导 后的大肠杆菌细胞，3为裂解液上清液，4为裂解物沉淀剂；
25.图5为密码子优化后pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45重组表达载体sds
‑
page分析， a为20℃时pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45在大肠杆菌中的融合表达，b为37℃时 pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45在大肠杆菌中的融合表达，m为蛋白质标记，1为诱导前 大肠杆菌细胞，2为诱导后的大肠杆菌细胞，3为裂解液上清液，4为裂解物沉淀 剂；
26.图6为纯化mbp
‑
pe_pgrs45融合蛋白的sds
‑
page分析；
27.图7为factor xa蛋白酶切除mbp的sds
‑
page分析；
28.图8为间接elisa检测多克隆抗体效价。
具体实施方式
29.如无特殊要求，本发明采用的试剂和菌株均为本领域技术人员常规购买所得 即可。
30.本发明提供了一种密码子优化的pe_pgrs45基因，所述pe_pgrs45基因核 苷酸序
列如seq id no.1所示： atgagctttgtgaatgtggccccgcagctggttagtaccgcagccgccgatg ccgcccgcattggtagcgctattaataccgcaaataccgccgcagccgcaacc acccaggtgctggctgcagcccaggatgaagttagtaccgccattgccgcac tgtttggcagtcatggccagcattatcaggcaattagcgcacaggttgccgc ctatcagcagcgctttgttctggccctgagtcaggccggtagtacctatgccg ttgcagaagccgccagtgccaccccgctgcagaatgttctggatgcaattaa tgccccggtgcagagtctgaccggtcgtccgctgattggtgacggcgccaat ggtattgatggtaccggccaggcaggcggtaatggcggctggctgtggggca atggtggcaatggtggtagcggcgccccgggtcaggcaggtggtgcaggtg gtgcggcaggtctgattggtaatggcggtgccggtggtgccggcggtcagg gtttaccgtttgaagccggtgcaaatggcggcgccggtggcgcaggtggttg gttatttggtaatggtggtgccggtggcaatggcggtattggcggcgcaggt accaatctggcaattggtggtcatggcggtaatggtggcaacgccggcctga ttggcgccggtggtaccggtggtgcaggcggtaccggcggtggtgaaccga gtgcaggcgccagtggtggcaatggaggtaatggtggaaatggtggtctgct gattggcaatagcggcgatggtggcgccgcaggcaatggtgccggtattagc cagaatggcccggcaagtggttttggtggcaatgggggccatgccggcacc accggtctgattggcaacggtggcaatggtggagcaggtggtgctggcggt gacgttagcgcagattttggcggcgtgggctttggtggtcagggcggtaatg gaggtgcaggtggcctgctgtatggcaatggtggggcaggcggtaacggtg gtgccgcaggtagcccgggcagtgtgaccgcatttggcggtaatgggggtag cggtggcagcggtggtaatggcggaaatgccctgattggcaatgcaggcgca ggtggcagcgccggtgcaggtggaaatggcgccagcgcaggcaccgccggt ggtagcggtggtgacggtggcaaaggtggtaatggtgggagtgttggcctg attggtaacggtggcaacggcggtaatggtggcgccggcagtctgtttaatg gcgcaccgggctttggtggcccgggcggtagtggtggtgcaagcctgctgg gtccgccgggtctggcaggtaccaacggtgccgatggt。利用本发明所述 pe_pgrs45基因能够获得效价高的多克隆抗体。同时本发明具体实施例中试验结 果表明，该基因的密码子适应指数(cai)从0.73增加到0.90，可见本发明将 pe_pgrs45基因进行密码子优化后，提高了密码子适应指数，增加了本发明所述 pe_pgrs45基因的密码子使用的偏好性和可溶性表达效率。
31.本发明提供了一种包含上述密码子优化的pe_pgrs45基因的重组表达载体， 即pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45，所述重组表达载体的基础质粒包括pmal
‑
c5x；所述 基因的核苷酸序列位于所述pmal
‑
c5x的nde i和hind
ꢀⅲ
酶切位点之间。本发明 优选在所述pmal
‑
c5x的nde i和hind
ꢀⅲ
酶切位点处插入上述基因的核苷酸序列， 得到所述重组表达载体。本发明对所述pmal
‑
c5x的来源没有特殊限定，采用本 领域技术人员常规购买所得即可。本发明采用的是pmal
‑
c5x含有his6
‑
mbp标签， 能够发挥分子伴侣作用，可促进蛋白质正确折叠成天然构象，提高蛋白质可溶性 水平；mbp还具有抗蛋白水解作用，可以防止其伴侣蛋白降解，能够提高表达水 平和表达产物的溶解度。此外，pmal表达载体系统在n端含有组氨酸标签，可 以促进蛋白折叠和亲和纯化。
32.本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白的编码基因的序列包括seq idno.1所示的序列，即重组蛋白的编码基因的序列上述密码子优化的pe_pgrs45 基因的序列。在本发明中，所述重组蛋白的氨基酸序列优选如seq id no.8所示： msfvnvapqlvstaaadaarigsaintantaaaattqvlaaaqdevstaiaalf gshgqhyqaisaqvaayqqrfvlalsqagstyavaeaasatplqnvldainapv qsltgrpligdgangidgtgqaggnggwlwgnggnggsgapgqaggaggaa glignggaggaggqglpfeaganggaggaggwlfgnggaggnggiggagtn laigghggnggnagligaggtggaggtgggepsagasggnggnggnggllig nsgdggaagngagisqngpasgfggngghagttglignggnggaggaggdvs adfg
gvgfggqggnggaggllygnggaggnggaagspgsvtafggnggsgg sggnggnalignagaggsagaggngasagtaggsggdggkggnggsvglig nggnggnggagslfngapgfggpggsggasllgppglagtngadg。
33.本发明提供了上述重组表达蛋白的制备方法，包括以下步骤：
34.利用上述重组表达载体转化大肠杆菌后，依次进行培养和诱导，得重组蛋白。
35.本发明对所述转化方式没有特殊要求，采用本领域技术所熟知的即可。本发 明在培养时，采用的培养基优选为含抗生素的lb液体培养基；所述抗生素优选为 氨苄青霉素。在本发明中，所述含氨苄青霉素的lb液体培养基优选包括以下浓度 的组分：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l和卡那霉素50ug/ml。 在本发明中，所述培养的温度优选为20～37℃，进一步优选为25～27℃，更优选为 30～37℃；培养的结束标准为培养所得菌液的od
600
＝0.4～0.6。本发明对所述含抗生 素的lb液体培养基的组分的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所 得即可。
36.本发明在诱导时，采用的培养基优选包括以下浓度的组分：胰蛋白胨10g/l、 酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l、卡那霉素50ug/ml和0.5mm iptg；所述诱导的 温度优选为20～37℃，进一步优选为25～27℃，更优选为30～37℃，最优选为37℃； 所述诱导的转速优选为200r/min；所述诱导培养的时间优选为12h。本发明对所述 培养基的组分的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可。
37.所述诱导后，本发明优选还包括对诱导后所得菌体进行离心和超声破碎，得 到破碎菌体。在本发明中，所述离心的时间优选为15min；所述离心的离心力优选 为8000g。在本发明中，所述超声破碎的功效优选为300w；所述超声破碎的方式 优选为间歇超声破碎；所述间歇超声破碎的具体方式优选为工作8s，间歇8s；所 述间歇超声破碎的时间优选为20min；所述超声破碎的温度优选为4℃；所述超声 破碎时优选将诱导后所得菌体重悬于裂解缓冲液中；所述裂解缓冲液优选包括 20mm tris
‑
hcl、150mm nacl和1mm pmsf；所述裂解缓冲液的ph优选为8.0； 本发明对所述裂解缓冲液的组分的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规 购买所得即可。
38.所述超声破碎后，本发明优选还包括对超声破碎后所得破碎菌体进行离心， 得到重组蛋白；所述离心的条件优选为8000g离心15min。
39.所述离心后，本发明优选还包括对所述重组蛋白所得重组蛋白进行纯化，得 到纯化重组蛋白；本发明对所述纯化的步骤没有特殊限定，采用本领域技术人员 所熟知的方法即可。在本发明具体实施例中，所述纯化优选包括以下步骤：将重 组蛋白进行第一层析、裂解和第二层析，得到纯化重组蛋白(pe_pgrs45蛋白)。 本发明在第一层析和第二层析时，优选采用ni
‑
nta层析柱；所述层析的进样速度 优选为0.5ml/min。
40.所述第一层析后裂解前，本发明优选还包括对层析后所得层析重组蛋白进行 洗涤、洗脱和透析，去除未结合蛋白。在本发明中，所述洗涤用洗涤缓冲液优选 包括以下浓度的组分：tris 20mmol/l、咪唑20mmol/l和nacl 0.15mol/l；所述 洗涤缓冲液的ph优选为8.0；所述洗涤缓冲液的用量优选为100ml。在本发明中， 所述洗脱用洗脱缓冲液优选为洗脱，所述含250mm咪唑洗脱缓冲液优选包括以下 浓度的组分：tris 20mmol/l，咪唑250mmol/l和nacl 0.15mol/l；所述含250mm 咪唑洗脱缓冲液的ph优选为8.0；所述含250mm咪唑洗涤缓冲液的用量优选为 20ml。在本发明中，所述透析优选在透析袋中进行；所述透析采用的透析液优选 为factor xa蛋白酶工作液；所述factor xa蛋白酶工作液优选包括
以下浓度的组 分50mm tris、1mm cacl2和0.1％tween
‑
20；所述factor xa蛋白酶工作液的ph 优选为8；所述透析的温度优选为4℃；所述透析的时间优选为12h；所述透析过 程中优选换2次factor xa蛋白酶工作液；本发明利用透析能够去除咪唑。
41.在本发明中，所述裂解优选在factor xa蛋白酶作用下进行；所述factor xa 蛋白酶与透析后所得透析蛋白的质量比优选为1：(10～50)，更优选为1：20； 所述裂解的温度优选为4℃；所述裂解的时间优选为36h；本发明利用factor xa 蛋白酶以酶切的形式去除透析后所得透析蛋白(mbp
‑
pe_pgrs45)中的mbp， 释放pe_pgrs45蛋白。
42.本发明提供了一种高效价的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
43.以前述技术方案所述重组蛋白为抗原免疫宿主，得抗pe_pgrs45的多克隆抗 体；所述宿主优选为新西兰大白兔。
44.本发明对所述免疫的方法没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式 即可；在本发明具体实施例中，所述免疫的方法优选采用皮下多点免疫；所述免 疫采用的试剂优选包括重组蛋白和弗氏不完全佐剂；所述弗氏不完全佐剂优选包 括液体石蜡和羊毛脂；所述石蜡和羊毛脂剂的体积比优选为2:1；所述免疫采用的 试剂中重组蛋白和弗氏不完全佐剂优选为等体积比；所述免疫的频率优选为2周/ 次；所述免疫的时间优选为6周。
45.本发明具体实施例采用间接elisa检测本发明所述多克隆抗体的效价，结果 表明本发明所述多克隆抗体最大效价为1:256000。可见本发明所述多克隆抗体可 以诱导新西兰大白兔产生高效价抗体，所以本发明所述多克隆抗体能够用于检测 和治疗结核病。
46.本发明提供了上述制备方法制备得到的多克隆抗体在制备诊断结核病试剂盒 的应用。
47.本发明提供了一种用于诊断结核病的试剂盒，包括上述制备方法制备得到的 多克隆抗体。
48.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种密码子 优化的基因、重组表达载体、重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用进行详细 地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
49.实施例1
50.pe_pgrs45的序列分析
51.结核分枝杆菌pe_pgrs45基因有1386bp核苷酸，编码39.3kda氨基酸。通 过在ncbi数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行blast序列对比分析， 我们分析发现pe_pgrs45主要存在于致病性分枝杆菌，例如结核分枝杆菌(m. tuberculosis)、牛分枝杆菌(m.bovis)、非洲分枝杆菌(m.africanum)、卡耐提 分枝杆菌(m.canettii)和山羊分枝杆菌(m.caprae)中，(图1)，暗示pe_pgrs45 可能是结核分枝杆菌毒力因子。
52.实施例2
53.pe_pgrs45基因密码子优化
54.密码子优化对蛋白质翻译速率和总蛋白产量有重要影响，pe_pgrs45基因具 约有20％稀有密码子，以及多个串联或三联稀有密码子(图2)，这些稀有密码子 可能导翻译致缓慢或提前终止，进而可能导致蛋白质产量低或不表达。参照结核 分枝杆菌h37rv株(geneid：888215)pe_pgrs45(rv2615c)基因序列，根据 大肠杆菌密码子偏好性用e.coli codon usage analyzer 2.1 (http://www.faculty.ucr.edu/～mmaduro/codonusage/
usage.htm)，在氨基酸序列不改 变的条件下，对pe_pgrs45基因进行密码子优化，送南京钟鼎生物技术有限公司 合成，得到核苷酸seq id no.1所示的pe_pgrs45基因。
55.同时密码子适应指数(cai)可以用来评估外源基因在宿主细胞内的表达水平， 最优范围是0.8～1.0。在确保氨基酸序列不改变的情况下，使用大肠杆菌偏爱密码 子优化基因序列，通过在线稀有密码子分析工具 (http://www.genscript.com/cgi
‑
bin/tools/rare_codon_analysis)分析发现，密码子优 化后pe_pgrs45的cai从0.73增加到0.90，能够增加可溶性表达效率。
56.实施例3
57.重组表达载体的构建
58.将密码子优化后pe_pgrs45基因克隆至pmal
‑
c5x基础质粒中，得到 pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45重组表达载体，其中，克隆过程如下：克隆过程中pcr采 用的引物如表1所示，pcr反应条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，56℃ 退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃继续延伸10min；pcr反应体系： 模板(密码子优化后pe_pgrs45基因，seq id no.1)：0.5μl，上游引物：0.5μl， 下游引物：0.5μl，dntp：0.5μl，dna聚合酶：0.5μl，5
×
buffer：5μl，去离子 水：17.5μl，总体积：25μl；采用限制性内切酶nde i和hind iii对pe_pgrs45 和pmal
‑
c5x进行双酶切，双酶切体系条件如表4所述；对酶切产物回收后使用 t4 dna连接酶过夜连接(16℃，连接12h)，连接体系为：2μl的pmal
‑
c5x、 8μl的pe_pgrs45、1μl的t4 dna ligase、2μl的10
×
t4 dna ligase buffer和 7μl的ddh2o，所用引物和限制性酶切位点见表1，所述限制性内切酶均购自 takara公司。将连接产物转化到top10感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)， 其中转化的步骤为：1.取连接产物5μl加入到100μl大肠杆菌top10感受态细胞， 充分混匀后，冰上放置30min；2.42℃，热激90s；3.立即置冰上3min；4.加入900μl 提前预温lb液体培养基；5.37℃，150rpm/min，震荡培养1h；6.取100μl培养液， 涂板至lb固体培养板；7.37℃，倒置，培养16h。
59.挑取上述转化后得到的阳性菌落，采用限制性内切酶nde i和hind iii进行双 酶切(酶切体系如表5所示)和测序鉴定，测序鉴定结果见图3。
60.对比例1
‑161.按照实施例3的方式构建重组表达载体，区别在于，基质质粒为pet28a，所 用限制性内切酶为nco i和xho i，双酶切体系详见表2，所得重组表达载体为 pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45。
62.对比例1
‑263.按照实施例3的方式构建重组表达载体，区别在于，基质质粒为pet32a，所 用限制性内切酶为nco i和xho i，双酶切体系条件详见表3，所得重组表达载体为 pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45。
64.表1构建重组表达载体所用引物
[0065][0066]
注：单下划线序列表示限制性内切酶位点。
[0067]
表2 pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45的双酶切体系和程序
[0068]
组分用量pet
‑
28a
‑
pe_pgrs4515μlnco i1.5μlxho i1.5μl10
×
k buffer5μl0.1％bsa5μlddh2o14μl程序37℃，双酶切12h
[0069]
表3 pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45的双酶切体系和程序
[0070]
组分用量pet
‑
32a
‑
pe_pgrs4515μlnco i1.5μlxho i1.5μl10
×
k buffer5μl0.1％bsa5μlddh2o14μl程序37℃，双酶切12h
[0071]
表4 pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45的双酶切体系和程序
[0072]
组分用量pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs4515μlnde i1.5μlhind iii1.5μl10
×
k buffer5μlddh2o24μl程序37℃，双酶切12h
[0073]
结果如图3所示，将pe_pgrs45基因分别克隆到pet
‑
28a、pet
‑
32a和pmal
‑
c5x载体中，用限制性内切酶nco i和xho i分别对pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45和 pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45重组表达载体进行双酶切鉴定以及限制性内切酶nde i和 hind iii对pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45重组表达载体，进行双酶切鉴定，结果显示， 在约1500bp位置处有特异性条带，与预期结果大
小一致。测序结果显示与密码子 优化后核苷酸序列100％相同，证明成功构建pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45、 pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45和pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45重组表达载体。
[0074]
实施例4
[0075]
将对比例1
‑
1所得重组表达载体pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45、对比例1
‑
2所得重组表 达载体pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45、实施例3所得重组表达载体pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45 分别转化至表达菌株大肠杆菌bl21(de3)(北京天根生化科技有限公司)，挑 取阳性单菌落接种到3ml含抗生素lb液体培养基(其中，用于 pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45的抗生素为卡那霉素抗性，含抗生素lb液体培养基为胰蛋白 胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，卡那霉素50ug/ml；用于 pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45和pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45的抗生素为氨苄霉素抗性，含抗生 素lb液体培养基为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，氨苄霉素 100ug/ml)，37℃过夜活化。
[0076]
按照体积比1:100比例，分别接种到相对应的30ml新鲜含抗生素lb液体培 养基中，震荡培养至od
600
＝0.6。加入终浓度0.5mm iptg，分别在20℃和37℃， 200r/min，震荡诱导培养12h，诱导蛋白表达，得到诱导后的大肠杆菌细胞。
[0077]
在8000g离心力条件下离心15min，收集菌体；然后进行超声破碎(300w， 工作8s，间歇8s，共20min)后，再于8000g离心力作用下离心15min，收集诱 导后的裂解液上清液和为裂解物沉淀剂。
[0078]
然后用12％sds
‑
page分别对上述的裂解液上清液和为裂解物沉淀剂以及诱 导前的大肠杆菌细胞、诱导后的大肠杆菌细胞进行凝胶电泳检测分析，测试结果 图4和图5所示。
[0079]
由图4和图5可知，本发明以pet
‑
28a(his6)、pet
‑
32a(trx)和pmal
‑
c5x (his6
‑
mbp)作为融合标签，其中，pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45和pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45 表达载体在超声破碎后上清和沉淀中，均未观察到明显条带(图4中a～d)。 pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45表达载体iptg诱导后，在82kda处有明显特异性条带(包 含pe_pgrs45蛋白39kda和mbp蛋白43kda)，与预期蛋白大小一致(图5 中a～b)。可见pet
‑
28a
‑
pe_pgrs45和pet
‑
32a
‑
pe_pgrs45在20℃和37℃均不 能诱导表达pe_pgrs45蛋白。重组表达载体pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45在20℃和37℃ 均能可溶性表达pe_pgrs45蛋白，且在37℃诱导表达水平高于20℃，可能因为 低温度使mbp
‑
pe_pgrs45蛋白表达下降。因此，在后续实验中选择 pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45表达载体，37℃，大量诱导表达。
[0080]
实施例5
[0081]
实施例3所得重组表达载体pmal
‑
c5x
‑
pe_pgrs45在n端含有组氨酸标签(6 his
‑
tag)和麦芽糖结合蛋白(mbp)，实施例4以该重组表达载体得到的重组蛋 白为所得带组氨酸融合蛋白，采用ni
‑
nta层析柱纯化带组氨酸融合蛋白。具体步 骤如下：将实施例4收集得到的菌体重悬于裂解缓冲液(20mm tris
‑
hcl，150mmnacl，1mm pmsf，ph 8.0)中，超声破碎(300w，工作8s，间歇8s，20min)， 8000g离心力作用下离心15min，收集上清液，将上清液以0.5ml/min上样到 ni
‑
nta层析柱(novagen公司)。用100ml洗涤缓冲液(tris 20mmol/l，咪唑 20mmol/l，nacl 0.15mol/l，ph8.0)洗涤去除未结合的蛋白。最后，用20ml含 250mm咪唑洗脱缓冲液(tris 20mmol/l，咪唑250mmol/l，nacl 0.15mol/l，ph8.0)， 洗脱层析后所得mbp
‑
pe_pgrs45蛋白。将纯化后蛋白转移到透析袋中，4℃，过 夜透析，以去除咪唑，对mbp
‑
pe_pgrs45蛋白进行sds
‑
page电泳。
[0082]
电泳结果如图6所示，纯化后mbp
‑
pe_pgrs45蛋白纯度为91％。
[0083]
实施例5
[0084]
mbp
‑
pe_pgrs45蛋白裂解和纯化
[0085]
pmal
‑
c5x基础质粒在融合蛋白mbp和pe_pgrs45蛋白之间含有factor xa 蛋白酶酶位点。将纯化mbp
‑
pe_pgrs45蛋白与factor xa蛋白酶共孵育，酶切后 mbp
‑
pe_pgrs45蛋白上样至ni
‑
nta层析柱。因为mbp蛋白n端有组氨酸标签， 所以切除后的mbp蛋白结合到ni
‑
nta层析柱，流出来蛋白是切除mbp蛋白后 的pe_pgrs45蛋白(重组蛋白)，具体步骤如下：
[0086]
将实施例4得到的纯化后mbp
‑
pe_pgrs45蛋白装入透析袋，在factor xa蛋 白酶工作液(50mm tris，1mm cacl2、0.1％tween
‑
20，ph 8.0)中透析过夜(12h)， 期间更改2次factor xa蛋白酶工作液。透析后，加入factor xa蛋白酶，其中， factor xa蛋白酶与透析后所得透析蛋白的质量比为1：20，4℃，孵育36h，得裂 解混合物。将上述裂解混合物通过ni
‑
nta层析柱，其中，factor xa蛋白酶可以 将mbp
‑
pe_pgrs45酶切成mbp和pe_pgrs45两部分，mbp的n端含有组氨 酸标签，可以和ni
‑
nta层析柱结合，而pe_pgrs45不含有组氨酸标签标签，可 以流出，即为除mbp的pe_pgrs45蛋白，因此，流出液即为去除mbp的 pe_pgrs45蛋白，即重组蛋白，对该重组蛋白进行sds
‑
page电泳。
[0087]
电泳结果如图7所示，泳道1为酶切后ni
‑
nta层析柱吸附蛋白，在约43kd 处有明显特异性条带，与mbp蛋白预期大小一致，泳道2为酶切后流出液，在约 39kda处有明显特异性条带，与pe_pgrs45蛋白预期大小一致。表明成功将 mbp
‑
pe_pgrs45蛋白mbp切除，纯化后pe_pgrs45蛋白条带单一，满足后续 实验需求。
[0088]
实施例6
[0089]
pe_pgrs45多克隆抗体制备与鉴定
[0090]
取400μg实施例5所得纯化pe_pgrs45蛋白与等体积弗氏不完全佐剂(石蜡： 羊毛脂剂＝2:1)混合，皮下多点免疫新西兰大白兔，每2周免疫一次，共免疫6 周，免疫4次，免疫3只，注射量为400μg/只/次。以免疫前血清作为阴性对照， 利用间接elisa法测定血清效价，具体操作如下：
[0091]
(1)抗原包被：取pe_pgrs45蛋白(5μg/ml)，按照100μl/孔，包被96 孔板，4℃过夜。弃内液，pbst洗涤3次，37℃，5％脱脂奶粉封闭1h。
[0092]
(2)取pe_pgrs45多克隆抗体(0.12mg/ml)，用pbs稀释至0.12μg/ml， 以1:1000起始，倍比稀释，稀释至1:512000，以100μl/孔的量添加到步骤(1) 的孔中，37℃，孵育1h。弃内液，pbst洗涤3次，加入hrp标记的山羊抗兔igg (1:5000)，100μl/孔，37℃，孵育1h；加入tmb显色溶液，100μl/孔，37℃， 避光15min，酶标仪检测a450nm吸光度值。间接elisa检测结果如图8所示， 多克隆抗体最大效价确定为1:256000。
[0093]
由上述可知，本发明提供了的核苷酸序列如seq id no.1所示的pe_pgrs45 基因。利用本发明所述pe_pgrs45基因能够获得效价高的多克隆抗体。本发明具 体实施例中试验结果表明，该基因的密码子适应指数(cai)从0.73增加到0.90。
[0094]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟 悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此 本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。