hsa-miR-190b在制备诊断和/或治疗肿瘤产品中的应用的制作方法

hsa
‑
mir
‑
190b在制备诊断和/或治疗肿瘤产品中的应用
技术领域
1.本发明属于抗肿瘤活性成分技术领域，具体涉及一种靶向e3泛素连接酶的mirna及所述mirna在制备诊断和/或治疗肿瘤产品中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.microrna(mirna)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链rna分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。胞浆中成熟的mirna与多种蛋白共同形成mirna诱导的沉默复合体(mirna
‑
induced silencing complex,mirics)结合于靶mrna的3'
‑
utr区域，阻遏翻译甚至直接降解mrna，抑制基因表达。mirnas参与生理、病理过程，在肿瘤发生和发展中，不同的mirnas分别发挥抑制肿瘤(tumor suppressor mirna，tsmirs)或促进肿瘤作用(oncogenic mirnas，oncomirs)。随着mirna在肿瘤领域研究的不断深入，基于mirna的抗肿瘤治疗方法也在不断发展，目前最多的研究案例包括通过导入mirna mimics或前体补偿缺失的mirna功能或抑制过表达的mirna，以此来增加肿瘤细胞的化疗敏感性。目前研究人员已经鉴定出数千个mirna，明确这些mirna的功能有望提供获得具有治疗前景的活性药物。
4.泛素化是蛋白修饰的一种转录后修饰，长期以来被认为是介导蛋白质被26s蛋白酶体降解的一种机制。近几年来泛素化还被发现与蛋白间相互作用、胞内蛋白转运、dna修复和活化信号分子有关，因此这个研究热点更加受到关注。泛素化反应是由3种酶的连续反应组成的：泛素活化酶(ubiquitin
‑
activating enzyme，e1)、泛素结合酶(ubiquitin
‑
conjugating enzyme，e2)和泛素连接酶(ubiquitin ligase，e3)。pellino
‑
1是一种e3泛素连接酶，1999年最早在果蝇中发现，其家族具有进化保守的3个成员(pellino
‑
1/2/3)。目前peli蛋白特别是peli1(peli1)与疾病相关性的研究刚刚起步，相关报道很少，发现的底物包括irak1、irak4、traf6等有限的蛋白，其抑制剂和激动剂尚未被报道。现有研究已经证实，pellino
‑
1基因敲除小鼠的免疫器官和细胞发育没有异常，但是对lps诱导的内毒素性休克敏感性降低。在实验室自身免疫性脑脊髓炎动物模型中，pellino
‑
1缺陷可以阻止该病的发生，并且在多发性硬化患者中也发现pellino
‑
1的表达升高，提示中枢神经系统炎症与其密切相关。川崎病是一种与感染相关的自身免疫性疾病，韩国进行的一项gwas研究表明，pellino
‑
1基因及所在的染色体2p13.3区是川崎病的遗传易感性区域。kumar等在色素性视网膜炎的家系连锁分析中发现，pellino
‑
1基因是该病的潜在易感基因之一。pellino
‑
1缺陷小鼠的免疫耐受被破坏，会出现狼疮样症状。最新的一项gwas结果报道，人类pellino
‑
1基因与镍过敏皮炎有关。bennett等报道，人主支气管上皮细胞被鼻病毒感染后，中和pellino
‑
1蛋白可以抑制病毒诱导的有害的中性粒细胞炎症，但仍可以控制病毒引起的潜在感染，这为病毒感染治疗提供了新的线索。此外，baines等在哮喘患者中也发现pellino
‑
1基因的表达升高。除此之外，现有研究证实了pellino
‑
1在多种肿瘤中也呈现高表达，对肿瘤发展相关的多项细胞因子具有调节作用。yoon kyung jeon等发现pellino
‑
1与snail/slug蛋白相互作用，影响其泛素化，从而抑制肺癌细胞的转移。li等的最新研究表明pellino
‑
1在三阴乳腺癌(tnbc)中异常高表达，促进tnbc的发生发展和侵袭转移。


技术实现要素：

5.针对上述研究背景，发明人认为，pellino是一类哺乳动物中高度保守的e3泛素连接酶，其表达和磷酸化对炎症、免疫、肿瘤相关的多个信号通路有关。针对pellino
‑
1相关的mirna进行筛选，希望从中获得具有理想生理活性的核酸药物。基于该研究，本发明发现hsa
‑
mir
‑
190b对pellino
‑
1具有良好的特异性，有望成为作为一种抗肿瘤活性成分应用于相关药物的研发或疾病的诊断或治疗。
6.基于上述研究目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明第一方面，提供以下任意一项核酸物质在制备诊断和/或治疗pellino
‑
1相关疾病产品中的应用；
8.(1)hsa
‑
mir
‑
190b；
9.(2)hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p；
10.(3)相比(1)或(2)中的mirna序列具有一个或多个核糖核苷酸分子添加、缺失或替换后的衍生核酸物质，所述衍生核酸物质与(1)或(2)具有相同或基本相同的生理活性。
11.第一方面所述的技术方案中，所述hsa
‑
mir
‑
190b的全长序列如下：
12.11
‑
ugauauguuugauauuggguug
‑
32；
13.本发明经过深入的研究和反复的试验发现，与pellino
‑
1正相关的多数mirna生物活性较低，经测试，hsa
‑
mir
‑
190b对pellino
‑
1的特异性最好，具有半数以上的碱基能够结合，抑制pellino
‑
1蛋白翻译并诱导mrna降解。
14.进一步的，本发明还对hsa
‑
mir
‑
190b中的有效区域进行了针对性的研究，通过模型预测，所述mirna 5p段的22个碱基对中，18个碱基对能够与pellino
‑
1的mrna结合(如图1所示)，与pellino
‑
1具有更好的结合效果，在体内、体外均表现出良好的肿瘤抑制活性。
15.需要说明的是，第一方面所述核酸物质，还表示具有与hsa
‑
mir
‑
190b或hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p具有相同核糖核苷酸序列的rna物质。本领域技术人员获取所述rna物质的方式主要通过合成方式，如化学合成方法，具体的实例如亚磷酰胺法或亚磷酸三酯法。
16.还需要说明的是，上述“一个或多个核糖核苷酸分子的添加、取代或缺失”是指hsa
‑
mir
‑
190b所示核糖核苷酸序列进行一个或多个核糖核苷酸分子的添加、取代或缺失后仍然能够结合pellino
‑
1的衍生核酸；所述“一个或多个核糖核苷酸分子”是1
‑
5个，优先1
‑
4个；更为优选的，为1
‑
3个核糖核苷酸分子的取代、缺失或添加而形成的且具有上述生理活性的衍生核酸。另外，本发明所述衍生核酸物质还广泛地包括通过化学或遗传修饰后获得衍生的衍生核酸物质。所述修饰方法包括采用生物素、放射性同位素、荧光剂等进行标记。
17.优选的，所述pellino
‑
1相关疾病具体指pellino
‑
1表现为高表达的疾病。
18.因此，本发明进一步的方案中，所述疾病为肿瘤、炎症或免疫系统疾病。
19.更进一步的，所述肿瘤为肺癌、结直肠癌、食管癌、黑色素瘤、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌、甲状腺癌、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、脑瘤中
的一种。
20.更进一步的，所述炎症为包括但不限于结肠炎、肺炎、肝炎中的一种，具体的实例如，脂肪性肝炎、溃疡性结肠炎、肺炎、支气管炎。
21.更进一步的，所述免疫系统疾病为包括但不限于免疫性脑脊髓炎、川崎病、哮喘等。
22.本发明较为优选的一种实施方式中，提供上述核酸物质在诊断和/或治疗抗肿瘤产品中的应用。
23.该系列的实施方式中，所述诊断肿瘤的产品优选为包括但不限于诊断试剂、诊断试剂盒等。现有研究表明，pellino
‑
1表达对肿瘤的发展具有促进作用，有研究证实，三阴性乳腺癌细胞系中的pellino
‑
1蛋白表达量更高，这意味着本领域可以依靠pellino
‑
1与hsa
‑
mir
‑
190b的亲和性对待测样品中的pellino
‑
1的含量进行定性或定量的测定。上述诊断试剂或诊断试剂盒一种可行的实施方式中，将荧光素标记的hsa
‑
mir
‑
190b作为荧光检测探针，对待测样品中pellino
‑
1的含量进行指示。
24.所述治疗肿瘤的产品优选为包括但不限于抗肿瘤药物、保健品或抗肿瘤模型药剂中的一种。
25.本发明的一种具体的实施方式中，提供hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p在制备抗肺癌药物中的应用。
26.本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述组合物中，hsa
‑
mir
‑
190b、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p和/或其衍生核酸作为活性成分。
27.优选的，所述药物组合物中，所述活性成分应当是治疗有效剂量，可以是预防、抑制或缓解疾病的有效剂量。
28.本发明第三方面，提供一种肺癌治疗药物，所述肺癌治疗药物中包括hsa
‑
mir
‑
190b、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p和/或第二方面所述药物组合物。
29.优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的辅料。
30.本发明第四方面，提供一种肺癌的治疗方法，所述治疗方式包括将想有需要的个体施用hsa
‑
mir
‑
190b、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p、第二方面所述组合物、第三方面所述肺癌治疗药物。
31.优选的，所述“施用”表示采用服用、吸入、注射或介入治疗等手段将含有hsa
‑
mir
‑
190b、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p的药物制剂递送至病灶部位。
32.优选的，所述个体包括意指任意动物包括哺乳动物，最优选为人类。
33.以上一个或多个技术方案的有益效果是：
34.hsa
‑
mir
‑
190b首次报道于2007年，随后极少有被文献提及。其5p链由22个碱基对组成，不含有胞嘧啶，本发明对其作用的研究具有开拓性的价值。
附图说明
35.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
36.图1为实施例1中所述hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p与pellino
‑
1的mrna结合模型；
37.图2为实施例1中所述pellino
‑
1相关小rna对pellino
‑
1的mrna表达抑制作用；
38.图3为实施例1中所述hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对pellino
‑
1蛋白表达量的抑制作用；
39.图4为实施例1中所述流式细胞术检测hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对肺癌细胞凋亡的促进作用；
40.图5为实施例1中所述流式细胞术分析结果统计图；
41.图6为实施例1中所述annexin v\pi双染法检测hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对肺癌细胞凋亡的促进作用；
42.图7为实施例1中所述hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对肺癌细胞a549移植瘤的体内抑制作用。
具体实施方式
43.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
44.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
45.正如背景技术所介绍的，本领域针对pellino
‑
1相关的研究较为空白，现有研究结果证实了，pellino
‑
1的高表达与肿瘤、炎症、免疫系统疾病等多种疾病相关。为了进一步明确pellino
‑
1的作用机制，开发具有肿瘤抑制活性的小分子，本发明针对pellino
‑
1具有结合活性的mirna进行筛选，并提供了hsa
‑
mir
‑
190b在诊断、治疗抗肿瘤相关产品中的应用。
46.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
47.本实施例中为了验证hsa
‑
mir
‑
190b及hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p的活性，按照表1序列合成了hsa
‑
mir
‑
190b及hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p核苷酸分子。
48.表1、hsa
‑
mir
‑
190b的序列
[0049][0050]
实施例1
[0051]
1、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对肺癌细胞ic
50
测定
[0052]
采用mtt法检测has
‑
mir
‑
190b
‑
5p对lo2细胞的增殖抑制作用。在96孔板上以约5
×
103个/孔的密度接种处于对数生长期的h1299、a549及2b细胞。待细胞粘附后，用rpmi1640培养基将0
‑
40nmol/l的has
‑
mir
‑
190b加入平板。等待48h使细胞孵化。将15μl mtt(5g/l)添加在每个孔中孵育4h使之形成甲瓒。然后，每孔中添加dmso 150μl。用酶标仪测定570nm的吸光度。通过与未处理的细胞比较，计算ic
50
值，假设未处理的细胞为100％的细胞存活率。每项试验独立进行，一式三份。
[0053]
经检测，hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对肺癌细胞的ic
50
如表2所示：
[0054]
表2hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对肺癌及正常肺细胞的ic
50
[0055][0056]
2、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p对pellino
‑
1的mrna、蛋白表达量的抑制；
[0057]
首先通过数据库，将与pellino
‑
1共表达正负相关性最高的几种mirna：1289、190b、452、516送到公司合成mimics(即成熟体片段)，均采用5p片段。以10nm浓度加入a549细胞中，培养24h后检测pellino
‑
1的mrna表达水平，筛选后发现mir
‑
190b
‑
5p具有抑制pellino
‑
1的mrna表达的作用，随后用0、5、10、20nm浓度的190b
‑
5p加入a549细胞中培养24h后检测pellino
‑
1蛋白表达量，显示出mir
‑
190b
‑
5p能够浓度依赖性的抑制pellino
‑
1的蛋白表达。
[0058]
(1)总rna提取及实时定量pcr实验
[0059]
总rna提取：细胞于6孔板中处理，相应时间后，弃上清，pbs清洗三遍(每遍3ml)。加入trizol裂解液，冰上裂解20分钟。反复吹打，转移至ep管中，静置10分钟。加入200μl氯仿，颠倒混匀至上层无色，静置15分钟。4℃，12000g，离心15min。上清液移入新ep管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10min。4℃，12000g，离心10min。弃上清，加1ml 75％冰乙醇，重悬。4℃，7500g，离心5min。弃上清，干燥rna。加10μl depc水，于
‑
80℃保存。使用前取rna 1μl，加99μl depc水，用核酸测定仪测总rna浓度。将测定浓度并定浓度后的rna于65℃水浴5min，冰上冷却。合成cdna时，应用以下反应液体系：
[0060]
逆转录反应体系：37℃，15min
→
98℃，5min
→
4℃，10min。将cdna于
‑
80℃保存。
[0061]
实时定量pcr：以cdna为模板，确定内参，进行扩增。按以下体系将反应物加入96孔板中：
[0062]
以(95℃，2min
→
60℃，15s
→
72℃，20s)为扩增条件进行45个循环，得到结果以备分析。
[0063]
(2)蛋白提取及western blot实验
[0064]
总蛋白提取步骤：细胞于6孔板中处理，相应时间后，弃上清，pbs清洗三遍(每遍3ml)。添加ripa裂解液(含1％蛋白酶解抑制剂)，冰上裂解30分钟。细胞刮刀收集破碎细胞及蛋白，12000g离心20分钟，去除沉淀物，上清转移至准备好的新ep管中。利用标准牛血清蛋白及bca蛋白浓度测定试剂盒，绘制蛋白浓度标准曲线。基于标准曲线，测定所提取的总蛋白浓度。各组蛋白利用裂解液定量稀释至相同浓度，按上样缓冲液：蛋白体积＝1：4比例加入western上样缓冲液。
[0065]
western步骤：于制胶器上固定玻璃夹板，检漏。
[0066]
首先弃去检漏用去离子水，将配置好的分离胶搅拌混匀，用注射器加入两块玻璃板中。敲除气泡，利用异丙醇压齐。回收异丙醇，配置浓缩胶，搅拌均匀，用移液器加至分离胶上层，插入制胶10孔梳，待凝固后拔出梳子。胶板转移至电泳槽内，将1
×
电泳液加入至没过玻璃板。每孔加入20μl待测蛋白，于适宜位置加入3μl protein marker。安装好电极，调节电源电压至80v，恒压电泳50分钟。准备冰水浴，在冰水浴中调节电压至180v，恒压电泳50
分钟(至蛋白刚到达电泳槽底部)。取出胶板，准备电转液、硝酸纤维素膜。将所需要的凝胶切下，按照负极
‑
海绵
‑
滤纸
‑
凝胶
‑
硝酸纤维素膜
‑
滤纸
‑
海绵
‑
正极的顺序将电转装置组装好。将电转装置放入电转槽中，180ma横流电转2.5小时。将硝酸纤维素膜取出，按照marker位置裁剪相应条带，于8％脱脂牛奶中封闭1小时，tbs漂洗一次。将膜置入抗体孵育盒中，加入对应一抗，4℃慢摇过夜。tbst洗脱三次，tbs清洗一次，每次5分钟。将膜转移至对应二抗中室温孵育1小时。tbst洗脱三次，tbs清洗一次，每次5分钟。将膜置于暗匣中，平涂ecl发光液，将医用底片压于膜上显影。底片分别用显影液、定影液及清水润洗，晾干，扫描以备分析。
[0067]
结果如图2和3所示，可以看出，相比其他小rna190b
‑
5p片段能够显著抑制pellino
‑
1蛋白的表达。
[0068]
3、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p促进肺癌细胞凋亡实验；
[0069]
本实施例中，通过流式细胞术检测hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p促进肺癌细胞的凋亡作用：
[0070]
(1)制备单细胞悬液。
[0071]
(2)调整细胞悬液的浓度为5
×
104/ml，每孔1.0ml接种至6孔培养板中。
[0072]
(3)在5％co2培养箱中37℃培养24h，吸出液体，加入相应浓度的has
‑
mir
‑
190b，继续培养48h。
[0073]
(4)吸弃各孔中的原液体，加入冷pbs清洗，胰酶消化液消化收集细胞(拍照用时不消化)，pbs洗涤两次，最后加入pbs缓冲液悬浮细胞并对其进行计数。
[0074]
(5)取5～10
×
104pbs悬浮细胞，2000rpm离心5min，沉淀(细胞)加入195ul annexin v
‑
fitc结合液轻轻重悬细胞。
[0075]
(6)加入5ul annexin v
‑
fitc，轻轻摇匀。
[0076]
(7)加入10ul碘化丙啶(pi)染色液，轻轻摇匀。
[0077]
(8)室温、避光孵育10～20min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
[0078]
(9)实验重复进行三次。
[0079]
检测结果如图4
‑
6所示。
[0080]
4、hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p的体内抑制活性
[0081]
构建稳定转染敲低peli1和高表达has
‑
mir
‑
190b
‑
5p的a549细胞系，将balb/c小鼠随机分为四组：阴性对照组，阳性对照组，高表达190b组(trans
‑
hsa
‑
mir
‑
190b
‑
5p)和敲低peli1组。将构建好的细胞系与未转染的a549细胞皮下接种至balb/c小鼠体内，一周后，阳性对照组灌胃给与25mg/kg的5
‑
氟尿嘧啶，其余各组给与等量pbs，21天后处死并剥离肿瘤组织，进行称重及拍照。
[0082]
结果如附图7所示，在体内模型中，高表达190b
‑
5p组小鼠体内肿瘤生长相比对照组被显著抑制。从图中可以看出，相比敲低peli1组，高表达190b
‑
5p对于肿瘤具有更好的抑制效果。针对这一结果，发明人猜测可能由于mir
‑
190b
‑
5p还具有潜在的其它抗肿瘤机制，相比单纯的敲低peli1，高表达190b
‑
5p对于肿瘤具有更好的抑制效果。
[0083]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。