一种可检测烟草凝集素蛋白的抗体及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及烟草凝集素蛋白检测技术领域，具体涉及一种可检测烟草凝集素蛋白的抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.烟草凝集素(nictaba，nicotiana tabacum agglutinin)于2002年第一次从烟草叶子中被分离出来，是一种可防治各种病虫害的有效物质。虽然目前国内相关研究极少，但在国外却正在慢慢形成以nictaba为载体、利用烟草天然产物进行病虫害防治的新研究方向。烟草凝集素在烟草植株中各个部位都有分布；叶子中nictaba的含量更高，然而并不是在所有的烟草品种中都可以检测到它的存在。
3.为了更好的将烟草凝集素用于病虫害防治；对于植物中是否含有烟草凝集素的检测是十分必要的；但是目前缺乏专门的检测烟草凝集素的方法。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明首先提供了一种可检测烟草凝集素蛋白的抗体的制备方法；由该方法制备得到的抗体对于测烟草凝集素蛋白的特异性高，可以用于检测烟草凝集素蛋白，为烟草凝集素的检测提供了一种新的途径。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种可检测烟草凝集素蛋白的抗体的制备方法，其包含如下步骤：
7.乳剂1的制备步骤：取抗原、弗氏完全佐剂以及pbs(具体为0.01m的pbs)混合，制备成含抗原的乳剂1；
8.乳剂2的制备步骤：取抗原、弗氏不完全佐剂以及pbs(具体为0.01m的pbs)混合，制备成含抗原的乳剂2；
9.免疫步骤：所述的免疫步骤包括，将乳剂1注射至动物体内对动物进行第一次免疫；第一次免疫结束后，将乳剂2注射至动物体内对动物进行第二次免疫；第二次免疫结束后，将乳剂2注射至动物体内对动物进行第三次免疫；和/或第三次免疫结束后，将乳剂2注射至动物体内对动物进行第四次免疫；
10.抗体纯化步骤：取动物血清，从血清中纯化抗体，即得所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体；
11.其中，乳剂1和乳剂2中的抗原，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
12.优选地，乳剂1的制备步骤中，抗原、弗氏完全佐剂以及pbs的用量比为300～500ug：1ml：1ml；
13.乳剂2的制备步骤中，抗原、弗氏不完全佐剂以及pbs的用量比为300～500ug：1ml：1ml。
14.最优选地，乳剂1的制备步骤中，抗原、弗氏完全佐剂以及pbs的用量比为400ug：1ml：1ml。
15.最优选地，乳剂2的制备步骤中，抗原、弗氏不完全佐剂以及pbs的用量比为400ug：1ml：1ml。
16.优选地，第一次、第二次、第三次以及第四次免疫过程中，注射的抗原量为40～60ug。
17.最优选地，第一次、第二次、第三次以及第四次免疫过程中，注射的抗原量为50ug/只。
18.优选地，免疫步骤中所述的注射是指皮下注射。
19.优选地，免疫步骤中所述的动物为小鼠。
20.优选地，第一次免疫的时间为2～3周；第二次免疫的时间为2周；第三次免疫的时间为1周；第四次免疫的时间为1周。
21.发明人经大量的试验研究表明：采用乳剂1和乳剂2对小鼠进行上述步骤的四次免疫，可以得到更高效价的可检测烟草凝集素蛋白的抗体。
22.优选地，所述的抗体纯化步骤具体包括：
23.(1)用8～12倍柱体积的pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)洗涤平衡层析柱(琼脂糖凝胶4b层析柱)；
24.(2)将动物血清高速离心后的上清液与pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)混合，然后加入到层析柱中；所述上清液与pbs缓冲液的体积比为1:1～2；
25.(3)用8～12倍柱体积的pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)洗脱，至流出液无蛋白检出，关闭层析柱停止洗脱；
26.(4)加入2～4倍柱体积的含柠檬酸的pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)或含柠檬酸和甘氨酸组成的pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)，静置5～10min；接着进行洗脱，收集洗脱液，浓缩洗脱液冻干即得所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体。
27.发明人经大量的研究表明：采用上述层析柱方法可以得到高纯度的可检测烟草凝集素蛋白的抗体。
28.最优选地，步骤(3)中所述的含柠檬酸的pbs缓冲液是指含0.1m柠檬酸的pbs缓冲液；
29.所述的含柠檬酸和甘氨酸组成的pbs缓冲液是指含0.7m柠檬酸和0.3m甘氨酸组成的pbs缓冲液。
30.发明人经大量的研究表明：pbs缓冲液的组成对于能否制备得到高纯度的可检测烟草凝集素蛋白的抗体起着至关重要的作用；当采用含0.1m柠檬酸的pbs缓冲液进行洗脱时，可以富集得到高纯度和高效价的可检测烟草凝集素蛋白的抗体。进一步研究表明：当采用含0.7m柠檬酸和0.3m甘氨酸组成的pbs缓冲液进行洗脱时，可以富集得到更高纯度和更高效价的可检测烟草凝集素蛋白的抗体。
31.本发明还提供一种由上述制备方法制备得到的可检测烟草凝集素蛋白的抗体。
32.优选地，所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体具有seq id no：2或/和seq id no：3所述的氨基酸序列。
33.本发明还提供一种上述可检测烟草凝集素蛋白的抗体在检测烟草凝集素蛋白中的应用。
34.有益效果：本发明首次制备得到了一种可检测烟草凝集素蛋白的抗体；该可检测
烟草凝集素蛋白的抗体对于烟草凝集素蛋白具有较高的特异性；因此，可以将本发明所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体用于检测烟草凝集素蛋白；本发明所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体成功制备，为烟草凝集素蛋白的检测提供了一种新的检测途径；此外，采用本发明所述方法制备得到可检测烟草凝集素蛋白的抗体还具有较高的纯度以及效价；且该方法操作简单、制备成本低。
具体实施方式
35.以下结合实施例对本发明进行进一步解释，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
36.实施例1可检测烟草凝集素蛋白的抗体的制备
37.(1)取抗原(其氨基酸序列如seq id no：1所示)、弗氏完全佐剂以及pbs(具体为0.01m的pbs)混合，制备成含抗原的乳剂1；其中抗原、弗氏完全佐剂以及pbs的用量比为400ug：1ml：1ml；
38.(2)取抗原(其氨基酸序列如seq id no：1所示)、弗氏不完全佐剂以及pbs(具体为0.01m的pbs)混合，制备成含抗原的乳剂2；其中，抗原、弗氏不完全佐剂以及pbs的用量比为400ug：1ml：1ml；
39.(3)将乳剂1采用皮下注射的方式注射至balb/c小鼠体内对balb/c小鼠进行第一次免疫；第一次免疫结束后，将乳剂2采用皮下注射的方式注射至balb/c小鼠体内对balb/c小鼠进行第二次免疫；第二次免疫结束后，将乳剂2采用皮下注射的方式注射至balb/c小鼠体内对动物进行第三次免疫；第三次免疫结束后，将乳剂2采用皮下注射的方式注射至balb/c小鼠体内对动物进行第四次免疫；
40.其中，第一次、第二次、第三次以及第四次免疫过程中，注射的抗原量为50ug/只；第一次免疫的时间为3周；第二次免疫的时间为2周；第三次免疫的时间为1周；第四次免疫的时间为1周；
41.(5)取balb/c小鼠血清，从血清中纯化抗体，即得所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体；从血清中纯化抗体的具体步骤如下：
42.5.1)用10倍柱体积的pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)洗涤平衡层析柱(具体为琼脂糖凝胶4b层析柱)；
43.5.2)将动物血清高速离心后的上清液与pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)混合，然后加入到层析柱中；所述上清液与pbs缓冲液的体积比为1:1；
44.5.3)用10倍柱体积的pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)洗脱，至流出液无蛋白检出，关闭层析柱停止洗脱；
45.5.4)加入2倍柱体积的含0.7m柠檬酸和0.3m甘氨酸组成的pbs缓冲液(具体为0.01m的pbs缓冲液)，静置5min；接着进行洗脱，收集洗脱液，浓缩洗脱液冻干即得所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体。所述的可检测烟草凝集素蛋白的抗体具有seq id no：2所述的氨基酸序列。
46.实施例2基本效价检测
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间接elsia
47.(1)抗原包被：用包被液稀释抗原到指定浓度(无单独说明为1ug/ml)，100μl/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜。
48.(2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗1次。
49.(3)封闭：加200μl/孔封闭液，37℃放置2h.
50.(4)洗涤：用洗涤液洗3次。
51.(5)加待测样品(实施例1制备得到的抗体)：以每孔100ul加入待测样(样品需要稀释的，按比例稀释好)，温育1h。
52.(6)洗涤：弃掉待测样品，用洗涤液洗3次。
53.(7)加酶标二抗抗体：加入hrp标记羊抗鼠igg(1:10000，酶稀稀释)，100μl/孔，37℃孵育40min。
54.(8)洗涤：用洗涤液洗5次。
55.(9)显色：加新鲜配制的底物溶液90μl/孔，37℃暗处放置15min
56.(10)终止反应、比色：加50μl/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。
57.结果表明：待测样品测定孔中的吸光值>阴性对照孔均值3倍以上，这说明本发明制备得到的可检测烟草凝集素蛋白的抗体为阳性；且具有较高的效价。
58.实施例3 western blot实验
59.(1)聚丙烯酰胺凝胶的制备
60.1.1)配制浓度为15％的分离胶溶液：依次加入去离子水2.3ml、30％丙烯酰胺5ml、ph8.8的tris 2.5ml、10％过硫酸铵100μl、10％sds 100μl、temed 6μl(加入temed后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)；
61.1.2)迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，小心地在分离胶溶液上覆盖—层异丙醇；
62.1.3)分离胶聚合完全后，尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体；
63.1.4)配制浓度为5％的浓缩胶溶液：依次加入去离子水2.7ml、30％丙烯酰胺670μl、ph8.8的tris 500μl、10％过硫酸铵40μl、10％sds 40μl、temed 6μl(加入temed后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)；
64.1.5)快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子(小心避免混入气泡)；
65.1.26)浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液。
66.2样品的制备
67.2.1)细胞培养至107，收集细胞至15ml离心管，2000rpm离心5min，去上清；
68.2.2)培养基洗两遍，2000rpm离心5min，去上清；
69.2.3)收集细胞后加入1mlpbs，0.1％np40，冰上裂解10min；
70.2.4)10000rpm离心5min，取上清，加入等体积2
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loading buffer，沸水煮5min，分装后
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20℃保存；
71.3电泳
72.3.1)把需检测的实施例1制备得到的抗体样品(10μl)和2
×
(或者6
×
)loading buffer(10μl)混合，用移液枪慢慢将15μl混合物加至样品槽中，预染maker一般加10μl；
73.3.2)打开电源，采用200v的电压，电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝
胶底部；
74.3.3)切断电源，取出凝胶，用r250考马斯亮蓝浸泡凝胶染色，沸水煮5min；
75.3.4)取出染色的凝胶，用自来水浸泡凝胶脱色，沸水煮约20min，观察脱色后的蛋白质条带；
76.4转膜
77.4.1)取胶后讲胶剪成适当大小并浸入转膜buffer中；
78.4.2)将pvdf膜浸泡于甲醇1min后转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜buffer中(pvdf膜和滤纸均剪成与胶相同大小)；
79.4.3)用转膜buffer淋洗石墨电极，铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；
80.铺上膜，滴少许转膜buffer；铺上胶，再滴少许转膜buffer(注意不要产生气泡)；
81.4.4)最后铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；
82.4.5)盖上电极，电压调至最大，以1.5ma/cm2凝胶体积转膜1.5h(负载电压不宜超过1v/cm2)；
83.5封闭
84.5.1)将膜取出，pbst洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)；
85.5.2)将膜取出，浸没于封闭液中37℃，2h或4℃过夜(封闭液为1％酪蛋白或2％ova)
86.6结合抗体
87.6.1)将膜取出，pbst洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)；
88.6.2)将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的一抗稀释液中，37℃，1h(一般一抗稀释1：1000)；
89.6.3)将膜取出，pbst洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)；
90.6.4)将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的二抗抗稀释液中，37℃，1h
91.(羊抗小鼠
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hrp 1：3000
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1：5000，羊抗兔
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hrp 1:15000)；
92.7曝光
93.7.1)将a、b发光液等比例稀释混合(各500ml)，将膜至于保鲜膜上，ab混合液均匀滴至膜上，盖上保鲜膜，静止1min；
94.7.2)打开保鲜膜，用滤纸吸干表面残留液体，至于保鲜膜内固定于暗盒中
95.7.3)将暗盒至于暗室中，取出胶片迅速至于暗盒内膜上，关闭暗盒，根据所见荧光强度曝光(一般曝光时间为1min，若条带较弱可选择压片过夜)；
96.7.4)打开暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中1min；
97.7.5)取出胶片，去离子水漂洗后侵入至定影液中1min；
98.7.6)取出胶片，去离子水漂洗后晾干，标定marker，分析实验结果。
99.结果表明：实施例1制备得到的抗体与烟草凝集素蛋白发生反应与空载体不发生反应，而空白对照组与烟草凝集素蛋白也不发生反应；这说明实施例1制备得到的抗体对烟草凝集素蛋白具有特异性。
100.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制；本领域技术人员对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均属于本发明要求保护的范围。