一种多脂鳞伞菌株YX1、培养方法及其应用与流程

一种多脂鳞伞菌株yx1、培养方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及食用菌技术领域，特别是涉及一种多脂鳞伞菌株yx1、培养方法及其应用。


背景技术：

2.食用菌是指一类能为人类食用的大型子实体的高等真菌，被人类称为菇、菌、蕈，如人们所熟悉的灵芝、猴头菇、冬虫夏草、香菇、木耳等。科学家研究发现，食用菌营养丰富，含有高蛋白、低脂肪、多种氨基酸、维生素、微量元素、核苷酸、多糖等成分，所含营养物质非常齐全，在食用和保健方面的应用比较广泛。
3.近年来，随着人们生活水平的不断提高，自我保健意识的不断增强，对食用菌营养价值的认知也在不断提升，所以对食用菌品质、口感、营养价值的要求也日益提高。多脂鳞伞（pholiota adiposa）作为一类药食性真菌，夏末至深秋广泛分布于柳树、杨树等树干或根部。富含维生素、碳水化合物、蛋白质及多种矿物元素，营养丰富，食之黏滑爽口，味道鲜美，其在应用方面具有广阔的开发前景。
4.食用菌，其菌丝的生物量直接影响产量，目前主要通过加入添加剂提升菌菇产量。如专利申请“提高双孢蘑菇菌丝生长速度、生物量及产量的方法”（公开号：cn112514735）提供了利用柠檬酸钠溶液或醋酸钠溶液以提高双孢蘑菇菌丝生长速度的方法。使用时将柠檬酸钠、醋酸钠加入培养基中，并通过喷洒磷酸钠和磷酸钾等方式提升双孢蘑菇产量，操作人员劳动强度大，并且喷洒过程中浪费大部分试剂，容易造成水质变化。
5.如能提供一种使用方便、经济有效且对环境友好的食用菌促生方法，将具有更广泛应用的优势。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种多脂鳞伞菌株、培养方法及其应用。
7.作为本发明的第一个方面，在于提供一种多脂鳞伞菌株（pholiota adiposa）yx1，所述多脂鳞伞菌株yx1已于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为cgmcc no.21077。
8.该菌株是从泰山野生森林中采集，通过分离、纯化、培养得到原始菌株，再经过实验室驯化、杂交、选育，鉴定，获得一种药用功能强大且口感上佳的菌株，具有独有性和稀缺性。
9.作为本发明的第二个方面，在于提供所述多脂鳞伞菌yx1的培养方法，包括如下步骤：步骤1、母种培养：将无菌组织块接种于灭菌的母种培养基上，置于温度20~25℃的生化培养箱中培养，得到菌块。
10.母种培养基配方：马铃薯150~250g，葡萄糖15~25g，酵母膏10~20g、硫酸镁1~3g、磷酸二氢钾1~3g，维生素c0.3~0.5mg、琼脂15~20g，水1000ml。ph调整到5.5~6.5，灭菌。
11.此种配方可以使菌丝生长比较纤细，菌丝单位体积内细胞数量比较多，为以后液体培养提供了条件。
12.步骤2、原种培养：将步骤1得到的菌块接种入原种培养基中，置于温度20~25℃培养箱中培养4~5天，期间每隔6~8小时以140~160r/min的转速摇菌20~30min，促进菌丝的生长及大量繁殖。
13.原种培养基配方：马铃薯150~200g/l、葡萄糖15~25g/l、硫酸镁0.5~1.5g/l、蛋白胨8~15g/l、宛氏拟青霉发酵液5%~40%，其余加纯水，ph调整到5.5~6.5。该培养基内营养物质极其丰富，使得菌丝生长旺盛，更容易形成菌丝球。
14.本发明采用内生真菌分离得到的宛氏拟青霉发酵液发酵液作为液体培养基的原料之一，不但增加了多脂鳞伞菌（pholiota adiposa）yx1菌丝生物量，而且降低了原料的成本，为大规模生产提供技术支持。同时，也充分利用了内生真菌的发酵液，可对其他植物起到促生作用，不引入其他试剂，利于生态环境保护。
15.步骤3、栽培袋培养：制作栽培袋，将步骤2所得菌种接种至栽培袋内，子实体生长温度范围10~20℃，3~6天就可以现蕾。现蕾后湿度要控制在65%~85%之间，湿度太低菇头容易开裂，湿度太高菇头容易发黑。培养38~42天，获得子实体。
16.栽培袋原料配方：棉籽壳65%~70%；麸皮15%~20%；杂木屑10%~15%；石膏0.8%~1%；过磷酸钙0.5%~1%。
17.优选的，步骤2中，宛氏拟青霉菌发酵液含量为10%~20%。
18.更优选的，步骤2中，宛氏拟青霉菌发酵液含量为20%。
19.作为本发明的第三个方面，在于提供所述多脂鳞伞菌yx1作为保健产品的应用。
20.作为本发明的第四个方面，在于提供所述多脂鳞伞菌yx1作为调味品的应用。
21.作为本发明的第五个方面，在于提供所述多脂鳞伞菌yx1的菌棒渣作为饲料添加物的应用。
22.作为本发明的第六个方面，在于提供所述多脂鳞伞菌yx1作为有机底肥的应用。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明提供了一种多脂鳞伞菌yx1，具有新鲜菇的滑嫩肉质、浓郁香味、鲜艳色泽、食之黏滑爽口、味道鲜美的特点，在众多食用菌品种中可以独树一帜；其子实体中氨基酸含量高于现有的多脂鳞伞菌，是一种很好的保健产品和调味品。
24.2、本发明还提供了所述多脂鳞伞菌yx1的培养方法，采用内生真菌分离得到的宛氏拟青霉发酵液发酵液作为液体培养基的原料之一，不但增加了多脂鳞伞菌（pholiota adiposa）yx1菌丝生物量，而且降低了原料的成本，为大规模生产提供技术支持。同时，也充分利用了内生真菌的发酵液，可对其他植物起到促生作用，不引入其他试剂，利于生态环境保护。
25.3、本发明还提供了所述多脂鳞伞菌yx1的菌棒渣作为饲料添加物和有机底肥的应用。
附图说明
26.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
27.图1：yx1菌株菌落形态。
28.图2：yx1菌种的菌丝形态（40
×
0.65和100
×
1.4），其中，左图放大倍率为40
×
0.65，右图放大倍率为100
×
1.4。
29.图3：菌株yx1通过its序列分析建立的系统发育树。
30.图4：本发明实施例3提供的多脂鳞伞菌yx1子实体粉装保健产品中氨基酸含量图。
具体实施方式
31.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
32.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
33.专利号为zl201510059660.1的发明《一种宛氏拟青霉菌株sj1及其应用》提供了一种真菌菌株，该菌株为沙棘内生真菌菌株（paecilomyces variotii）sj1，于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号是cgmccno.10114。该真菌菌株发酵提取物的用途是：促进玉米、水稻等作物生长、根系发育、提高抗冻能力、增加产量。但对于食用菌菌体的促生作用未有相关研究公开。如能将植物内生菌来源的微生物发酵液应用于菌类促生，将具有经济有效、且环境友好的优势。本发明采用该公开专利所描述的内生真菌分离得到的宛氏拟青霉发酵液发酵液作为液体培养基的原料之一，研究用于食用菌的培养过程，并考察其效果和最佳使用方式。
34.实施例1：一种多脂鳞伞菌株（pholiota adiposa）yx1该菌株是从泰山野生森林中采集，通过分离、纯化、培养得到原始菌株，再经过实验室驯化、杂交、选育，鉴定，获得一种药用功能强大且口感上佳的菌株，具有独有性和稀缺性。
35.1.菌株的分离与筛选：选取朵型整齐、子实体大、新鲜的野生多脂鳞伞菇，选用常规的组织分离方法（将子实体用流水冲洗干净，用滤纸吸干水分，再用无菌水冲洗3次，撕开菌伞，取出白色菌肉切出小块，用无菌水冲洗3次）获得无菌组织块。将组织块接种于121℃高温高压灭菌30min后母种培养基上，置于25℃度培养箱培养3～10天后，即可见组织块的边缘长出菌丝，经平板反复分离、纯化，最后得到一株菌，编号为yx1。
36.母种培养基配方：马铃薯150~250g，葡萄糖15~20g，酵母膏10~20g、硫酸镁1~3g、磷酸二氢钾1~3g，维生素c0.3~0.5mg、琼脂15~20g，水1000ml。ph调整到5.5~6.5，灭菌。
37.2.菌株yx1的形态及生物学特性测定：将菌株yx1在加富pda培养基上，25℃培养一周，直径35~70mm，菌落致密且厚，绒状，形状规则，边缘羊毛状。初为乳白色，后变为米黄色，最终变为黄褐色。担孢子光滑，卵圆
形至椭圆形，6~7.5mm
×
3~4.5mm，q=1.6，芽孔微小，壁薄，具1~2个油滴，孢子印锈色。菌丝直径2~4mm，黄色至肉桂色，壁光滑至微糙，具锁状联合。该菌具有鳞伞属的特征，初步判定为多脂鳞伞菌（pholiota adiposa），该菌的菌落形态如图1所示；不同放大倍率下的菌株的菌丝形态如图2所示其中，左图放大倍率为40
×
0.65，右图放大倍率为100
×
1.4。
38.3.菌株yx1的分子生物学鉴定：以its1和its4为引物，对从分离获得的真菌yx1菌株进行了扩增，并对扩增产物进行了测序；its1的序列如序列表seq id no.1所示。
39.its4的序列如序列表seq id no.2所示。
40.扩增产物的序列如序列表seq id no.3所示。
41.基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用mega6.0软件通过ml算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树，如图3所示。
42.结果表明yx1真菌与多脂鳞伞菌（pholiota adiposa）的同源相似性达到98%。
43.通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，最终鉴定结果：菌株yx1为多脂鳞伞菌（pholiota adiposa）。
44.将筛选分离得到的菌株命名为多脂鳞伞菌（pholiota adiposa）yx1，已于2020年12月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为cgmcc no.21077。
45.实施例2：多脂鳞伞菌株yx1的培养方法步骤1、母种培养：将无菌组织块接种于灭菌的母种培养基上，置于温度20~25℃的生化培养箱中培养，得到菌块。
46.母种培养基配方：马铃薯150~250g，葡萄糖15~25g，酵母膏10~20g、硫酸镁1~3g、磷酸二氢钾1~3g，维生素c0.3~0.5mg、琼脂15~20g，水1000ml。ph调整到5.5~6.5，灭菌。
47.此种配方可以使菌丝生长比较纤细，菌丝单位体积内细胞数量比较多，为以后液体培养提供了条件。
48.步骤2、原种培养：将步骤1得到的菌块接种入原种培养基中，置于温度20~25℃培养箱中培养4~5天，期间每隔6~8小时以140~160r/min的转速摇菌20~30min，促进菌丝的生长及大量繁殖。
49.原种培养基配方：马铃薯150~200g/l、葡萄糖15~25g/l、硫酸镁0.5~1.5 g/l、蛋白胨8~15g/l、宛氏拟青霉发酵液5%~40%，其余加纯水，ph调整到5.5~6.5。该培养基内营养物质极其丰富，使得菌丝生长旺盛，更容易形成菌丝球。
50.本发明采用内生真菌分离得到的宛氏拟青霉发酵液发酵液作为液体培养基的原料之一，不但增加了多脂鳞伞菌（pholiota adiposa）yx1菌丝生物量，而且降低了原料的成本，为大规模生产提供技术支持。同时，也充分利用了内生真菌的发酵液，可对其他植物起到促生作用，不引入其他试剂，利于生态环境保护。
51.宛氏拟青霉发酵液制备方法：将公开专利提供的沙棘内生真菌分离得到的宛氏拟青霉（paecilomyces variotii）菌株sj1接到pda发酵培养基上，25℃培养一周，琼脂挖块接
种于装有50mlpda培养液的250ml三角烧瓶，于25℃，180r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10%量接种入装有150ml发酵培养基的500ml三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，再将种子液离心过滤，得宛氏拟青霉发酵液。
52.pda培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。
53.发酵培养基配方：马铃薯提取液1.0l，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g，琼脂17.0g。
54.引用公开专利zl201510059660.1提供的宛氏拟青霉菌种sj1的分离方法为：
①ꢀ
健康的野生沙棘样品采集后立即处理、洗净，然后将根切成小段，用75%的酒精冲洗，用10%巴氏消毒液洗18分钟，最后用无菌水冲洗4次；
②ꢀ
将上述消毒过的根在无菌条件下分别切割成0 .5cm长的小段接种于孟加拉红培养基平板上，置于28℃度培养箱培养5天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板（孟加拉红培养基）反复分离、纯化，最后得到宛氏拟青霉（paecilomyces variotii）菌株sj1。
55.步骤3、栽培袋培养：制作栽培袋，将步骤2所得菌种接种至栽培袋内，子实体生长温度范围10~20℃，3~6天就可以现蕾。现蕾后湿度要控制在65%~85%之间，湿度太低菇头容易开裂，湿度太高菇头容易发黑。培养38~42天，获得子实体。
56.栽培袋原料配方：棉籽壳65%~70%；麸皮15%~20%；杂木屑10%~15%；石膏0.8%~1%；过磷酸钙0.5%~1%。
57.实施例3：多脂鳞伞菌yx1子实体转化产品3.1 烘干产品：采集新鲜子实体放入温度为30~35℃的烘干机中进行烘干处理2~4小时，再逐步升温至40~60℃进行烘烤10~14小时，60
‑
65℃条件下烘烤1~2小时。烘干产品便于贮存、运输、销售。食用前将烘干子实体用35~40℃温水浸泡3~4小时，多脂鳞伞子实体保持新鲜菇的滑嫩肉质、浓郁香味、鲜艳色泽，食之黏滑爽口，味道鲜美，在众多食用菌品种中可谓独树一帜。
58.3.2 粉装保健产品：烘干后子实体经过25000~30000r/min的粉碎机磨成100~300目粉装产品。富含多糖、氨基酸、甾醇类物质，可以磨成粉，提取多糖等产品。多脂鳞伞菌yx1子实体中氨基酸含量检测结果如图4所示，其中，精氨酸arg、亮氨酸leu、苯丙氨酸phe、赖氨酸lys、异亮氨酸lle、苏氨酸thr、酪氨酸tyr、缬氨酸val、脯氨酸pro等多种类的氨基酸在多脂鳞伞菌yx1子实体中含量丰富，远高于现有的多脂鳞伞菌，这些氨基酸具有抗疲劳、降血糖、预防肿瘤、肾炎、高血压等作用，是一种很好的保健产品。
59.3.3 粉装调味品：筛选出烘干后的多脂鳞伞子实体的菌柄，经过25000~30000r/min的粉碎机磨成100~300目粉装产品。其富含氨基酸、维生素、多种矿物元素，具有鲜美的味道，添加适量的食盐，做成调味品。烹、炒、炖、煮均可食用，无需添加其他调味品，均能保证食品的浓郁鲜香。
60.3.4 菌棒渣的应用3.4.1 作为饲料添加物：将菌棒渣用粉碎机打碎，添加到动物饲料里，为动物提供多糖和氨基酸等营养物
质。
61.3.4.2作为有机底肥：将菌棒渣中加入有益微生物进行堆沤处理，发酵充分后将以底肥施入土壤中，为作物提供丰富的有机质和中微量元素。
62.实施例4：多脂鳞伞菌yx1培养方法的对比实验4.1实验方法：本实验共设计6各处理，每个处理3个重复。每500ml三角瓶中加入200ml液体培养基。每个三角瓶中接种入5个直径5mm的菌块，置于温度20~25℃和转速140~160r/min的培养箱中培养4~5天，测定菌丝生物量（生物量测定：准备一套空的三角瓶并配上漏斗和滤纸，将发酵后的菌液过滤到三角瓶中，再将过滤出的菌丝体移入烘干恒重的培养皿（m0）中，记录总重量（m1）。再放入60℃烘箱中烘至恒重，烘干后称总重（m2）。生物量计算公式为：生物量（g/l）=（带干菌体培养皿重量m2
‑
培养皿净重量m0）/发酵液总体积。）处理1：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l，其余加纯水。
63.处理2：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁1g/l、蛋白胨10g/l、其余加纯水。
64.处理3：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁1g/l、蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l，维生素b11g/l，其余加纯水。
65.处理4：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁1g/l、蛋白胨10g/l、宛氏拟青霉发酵液5%，其余加纯水。
66.处理5：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁1g/l、蛋白胨10g/l、宛氏拟青霉发酵液10%，其余加纯水。
67.处理6：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁1g/l、蛋白胨10g/l、宛氏拟青霉发酵液20%，其余加纯水。
68.处理7：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁1g/l、蛋白胨10g/l、宛氏拟青霉发酵液30%，其余加纯水。
69.处理8：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、硫酸镁1g/l、蛋白胨10g/l、宛氏拟青霉发酵液40%，其余加纯水。
70.处理9：马铃薯150g/l、葡萄糖15g/l、硫酸镁0.5g/l、蛋白胨8g/l、宛氏拟青霉发酵液10%，其余加纯水。
71.处理10：马铃薯150g/l、葡萄糖25g/l、硫酸镁1.5g/l、蛋白胨15g/l、宛氏拟青霉发酵液20%，其余加纯水。
72.4.2结果及分析表1不同处理菌丝生物量及增长率比较处理菌丝生物量（g/l）菌丝生物量增长率.84
±
0.03e/21.09
±
0.04d29.6831.58
±
0.05ab88.1041.43
±
0.04c70.0851.57
±
0.01ab86.8261.60
±
0.03a90.80
71.52
±
0.07abc80.8781.46
±
0.07bc73.3391.55
±
0.01abc84.05101.59
±
0.00ab88.81本结果采用spss进行差异显著性分析，显著水平α=0.05。其中，a、ab、bc、abc、c、d、e为标记字母。根据差异对比规则，a与ab（都有a），或者ab和bc（都有b）其对应处理结果都没有显著差异。
73.表2菌丝生物量显著性分析平方和自由度均方f显著性组间1.76390.19637.5250.000组内0.104200.005总计1.86729由表1和表2可以看出，处理3与处理5、7、8、9、10四个处理之间有差异但差异不显著，处理6与处理1、2、4三个处理之间差异显著，处理3~10比处理1、2的液体培养基配方明显增加菌丝体的生物量，处理3、处理6和处理10的液体培养基配方显著增加菌丝体的生物量，增长率高达88.10%、90.80%和88.81%。
74.处理3和处理6培养基的差别在于酵母浸粉、维生素b1与宛氏拟青霉发酵液，由处理4~10液体培养基中菌丝体的生物量均较高可知，宛氏拟青霉发酵液处理的菌丝量促生效果较好，而且发酵液是宛氏拟青霉提取液制备过程中的附产品，其制备成本远远低于这酵母浸粉和维生素b1的价格，作为生物发酵原料更为环保，所以对多脂鳞伞菌（pholiotaadiposa）大规模生产具有深远的意义。
75.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。