重组蛋白结构域及其编码dna、增强tet酶及全基因组dna甲基化检测方法
技术领域
1.本发明专利涉及重组蛋白结构域及其编码dna、增强tet酶及全基因组dna甲基化检测方法,属于生物技术领域。
背景技术:
2.dna胞嘧啶甲基化(5mc)是dna中最常见的碱基修饰方式,约占所有胞嘧啶的1%
‑
8%,被称为“第五种碱基”。dna甲基化与染色质状态和基因转录活跃程度具有明显的相关性,是预测基因表达水平的有效依据。因此,dna甲基化水平检测是临床疾病诊断的有效手段。现有的dna甲基化检测技术主要是依赖于反向筛选的重亚硫酸盐转化法,其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶,再通过pcr扩增转变成胸腺嘧啶。这种方法具有dna损伤大、背景噪音高和准确性低等缺陷。近年来,酶转化法甲基化检测技术因为具备dna损伤小、背景噪音低、准确性高和数据质量好等优点而成为dna甲基化检测领域的重要关注点。
3.dna羟甲基化酶tet是真核生物中普遍存在的一种α
‑
酮戊二酸(α
‑
kg)和fe2 依赖的双加氧酶,在生物进化过程中具有高度的保守性。tet酶是dna去甲基化过程的关键蛋白,可以将5mc通过三步氧化反应(5mc
‑
5hmc
‑
5fc
‑
5cac)转变成5cac。目前的酶转化法dna胞嘧啶甲基化检测技术都是依赖于tet酶催化甲基化胞嘧啶的能力,tet蛋白是酶转化法dna甲基化检测技术的核心蛋白,具有极大的工程改造和应用价值。获得一种高活性的重组tet酶突变体,对于体外dna甲基化技术的发展和在疾病诊断领域的应用,具有重要的价值。
4.本发明提供了增强tet酶活性的重组蛋白结构域,为dna甲基化结合结构域(mbd),mbd1
‑
4的氨基酸序列如seq id 1
‑
4所示。通过mbd与tet酶融合形成的重组蛋白mbd
‑
tet可以显著增强tet酶包括ngtet1、mtet1cd、mtet2cdt、htet1cd和htet2cdt的氧化活性。此外,本发明还提供了适用于mbd
‑
tet的反应缓冲液和简便快速的高通量dna甲基化检测流程,能够有效增强mbd
‑
tet对5mc的氧化活性,提高基于tet酶氧化反应的dna甲基化检测技术的灵敏度和准确性。
技术实现要素:
5.本发明的第一个目的是提供一种可增强tet酶活性的重组蛋白结构域。
6.所述的重组蛋白结构域是dna甲基化结合结构域(mbd),mbd1
‑
4氨基酸序列如seq id 1
‑
4所示,其中mbd1效果最优。
7.以及上述mbd的编码dna,其核苷酸序列如seq id no.10
‑
13中任一项所示。
8.本发明的第二个目的是提供一种增强tet酶,为在ngtet1、mtet1cd、mtet2cdt、htet1cd或htet2cdt的氨基端通过gggs连接肽连接上述的重组蛋白结构域mbd1、mbd2、mbd3或mbd4,ngtet1、mtet1cd、mtet2cdt、htet1cd、的htet2cdt氨基酸序列分别如seq id 5
‑
9所示,其中ngtet1最优。
9.本发明的又一目的是提供一种全基因组dna甲基化检测方法,其特征在于其步骤包括:(1)采用上述的增强tet酶对模板dna进行氧化;(2)还原剂处理,碱中和;(3)dna回收;(4)dna文库构建。
10.优选的,步骤(1)中所述的氧化反应时加入tet酶反应缓冲液,该tet酶反应缓冲液可以提高tet酶氧化5mc反应中5cac产物的占比。
11.优选的,所述tet酶反应缓冲液含有:1
‑
100 mm 3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸钠盐、1
‑
100 mm双(2
‑
羟乙基)氨基
‑
三(羟甲基)甲烷、1
‑
100 mm羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1
‑
300 mm氯化钠、0.1
‑
10 mm抗坏血酸、0.1
‑
10 mm柠檬酸、0.1
‑
20 mmα
‑
酮戊二酸、0.1
‑
20 mm 1,3
‑
丙酮二羧酸、0.1
‑
20 mm三磷酸腺苷、0.1
‑
10 mm四氟对苯醌、0.1
‑
10 mm四氯对苯醌、 0.1
‑
10 mm四溴对苯醌、0.1
‑
10 mm四碘苯醌、0.01
‑
2 mm三(2
‑
羧乙基)膦、0.01
‑
2 mm二硫苏糖醇的一种或多种。
12.优选的,所述tet酶反应缓冲液还含有铁盐化合物。
13.优选的,所述铁盐化合物的使用浓度为0.1
‑
50 mm,其中1
‑
10 mm最优。
14.优选的,所述铁盐化合物为硫酸亚铁、乙二胺硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、柠檬酸亚铁、氯化亚铁、2,6
‑
双(1,1
‑
双(2
‑
吡啶)乙基)吡啶
‑
氧化铁络合物([fe
iv
(o)(py5me2h)]
2
)中的一种或数种,其中硫酸亚铁和[fe
iv
(o)(py5me2h)]
2
最优。
[0015]
优选的,所述tet酶反应缓冲液中还包括0.001
‑
1%浓度的过氧化氢和0.001
‑
1%浓度的高锰酸钾。
[0016]
优选的,步骤(1)中所述的氧化反应的反应温度为10
‑
40℃,其中30
‑
40℃最优。
[0017]
优选的,步骤(1)中所述的氧化反应的反应时间为0.5
‑
2 h。
[0018]
优选的,步骤(2)中所述的还原剂包括氢化铝锂、氢化硼锂、醋酸硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、三乙基硼氢化锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2
‑
甲基吡啶硼烷、硼氢化钠、氨硼烷锂、吡咯烷并硼氢化锂、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷吗啉络合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4
‑
甲基吗啉硼烷、硼烷三甲胺络合物、5
‑
乙基
‑2‑
甲基吡啶硼烷、n,n
‑
二异丙基乙胺硼烷、硼烷四氢呋喃络合物、硼烷二甲基硫醚络合物中的一种或多种。其中氢化铝锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2
‑
甲基吡啶硼烷、氨硼烷锂、叔丁胺硼烷、硼烷吗啉络合物和硼烷四氢呋喃络合物最佳。
[0019]
优选的,步骤(2)中还原剂的处理浓度为100
‑
2000 mm,其中200
‑
500 mm最佳。
[0020]
优选的,步骤(2)中还原剂的处理温度为20
‑
50℃,其中30
‑
40℃最佳。
[0021]
优选的,步骤(2)中还原剂的处理时间为2
‑
24 h,其中4
‑
12 h最佳。
[0022]
优选的,步骤(2)中所述的碱中和使用的是氢氧化钠或氢氧化钾,在反应体系中的终浓度为0.5
‑
1.5 m。
[0023]
优选的,步骤(3)中所述的dna回收方式指磁珠法回收、柱法回收或抽提沉淀法回收,其中磁珠法回收最优。
[0024]
步骤(4)中的dna建库方法采用常规的双链dna建库或者单链dna建库方法即可。
[0025]
本发明提供了增强tet酶活性的重组蛋白结构域,为dna甲基化结合结构域(mbd),
mbd1
‑
4的氨基酸序列如seq id 1
‑
4所示。通过mbd与tet酶活性结构区域融合形成的重组蛋白mbd
‑
tet可以显著增强tet酶包括ngtet1、mtet1cd、mtet2cdt、htet1cd和htet2cdt的氧化活性。此外,本发明还提供了适用于mbd
‑
tet的反应缓冲液和简便快速的高通量dna甲基化检测流程,能够有效增强mbd
‑
tet对5mc的氧化活性,提高基于tet酶氧化反应的dna甲基化检测技术的灵敏度和准确性,可以应用于疾病诊断,尤其是在疾病诊断和肿瘤早筛领域。
附图说明
[0026]
图1 传统taps和优化后的taps转化率对比示意图。
[0027]
图2 mbd结构域对tet酶活性的影响。
[0028]
图3 mbd融合tet酶对m5c氧化产物占比的影响。
[0029]
图4 传统taps和优化后的taps流程示意图。
[0030]
图5 传统taps和优化后的taps文库产量对比。
[0031]
图6 tet酶处理时间对taps转化率的对比。
[0032]
图7 还原剂种类对taps转化率的对比。
[0033]
图8 还原剂处理时间对taps转化率的对比。
[0034]
图9 mbd
‑
ngtet1和优化流程对taps检测dna甲基化效果的比较。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。序列表中,seq id no.1是mbd1的氨基酸序列,seq id no.2是mbd2的氨基酸序列,seq id no.3是mbd3的氨基酸序列,seq id no.4是mbd4的氨基酸序列,seq id no.5是ngtet1的氨基酸序列,seq id no.6是mtet1cd的氨基酸序列,seq id no.7是mtet2cdt的氨基酸序列,seq id no.8是htet1cd的氨基酸序列,seq id no.9是htet2cdt的氨基酸序列,seq id no.10是mbd1的核苷酸序列,seq id no.11是mbd2的核苷酸序列,seq id no.12是mbd3的核苷酸序列,seq id no.13是mbd4的核苷酸序列。
[0036]
所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0037]
实施例1:mbd
‑
tet各重组蛋白酶比活性的测试。
[0038]
使用epigentek的epigenase 5mc
‑
羟化酶tet活性/抑制分析试剂盒(荧光法)按照说明书的流程来测定各mbd
‑
tet重组蛋白的酶比活性。
[0039]
改造后的酶活效果示意图见图1,结果见图2,融合mbd的tet酶能够显著增强各tet酶的活性。
[0040]
实施例2:mbd
‑
tet各重组蛋白酶对5mc oligo的氧化能力的测定。
[0041]
在本实施例中,测定了mbd
‑
tet酶对5mc的氧化产物占比,具体实施方式如下:表1组分用量5mcoligo1
‑
100ng10
×
tet酶反应缓冲液3μl10μm各tet酶2
‑
10μl
补ddh2o至30μl10
×
tet酶反应缓冲液包含1
‑
100 mm 3
‑
(n
‑
吗啉基)丙磺酸钠盐、1
‑
100 mm双(2
‑
羟乙基)氨基
‑
三(羟甲基)甲烷、1
‑
100 mm羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1
‑
300 mm氯化钠、0.1
‑
10 mm抗坏血酸、0.1
‑
10 mm柠檬酸、0.1
‑
20 mmα
‑
酮戊二酸、0.1
‑
20 mm 1,3
‑
丙酮二羧酸、0.1
‑
20 mm三磷酸腺苷、0.1
‑
10 mm四氟对苯醌、0.1
‑
10 mm四氯对苯醌、 0.1
‑
10 mm四溴对苯醌、0.1
‑
10 mm四碘苯醌、0.01
‑
2 mm三(2
‑
羧乙基)膦、0.01
‑
2 mm二硫苏糖醇、0.1
‑
50 mm亚铁盐(硫酸亚铁、乙二胺硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、柠檬酸亚铁、氯化亚铁、2,6
‑
双(1,1
‑
双(2
‑
吡啶)乙基)吡啶
‑
氧化铁络合物([fe
iv
(o)(py5me2h)]
2
))和0.001%
‑
1%的过氧化氢或高锰酸钾等。
[0042]
37℃反应0.5
‑
2 h。
[0043]
反应结束后,加入1 ul终止反应液,50℃反应3
‑
10 min。使用磁珠法或者qiaquick nucleotide removal kit (qiagen)回收dna进行lc
‑
ms/ms分析。5mc、5hmc、5fc和5cac含量占比分析流程见hideharu hashimoto et al(nature,2013)。
[0044]
表2实验结果如表2和图3所示, 融合mbd的tet酶能够显著增强各tet酶的活性,最终氧化产物5cac要显著高于未融合mbd的tet酶。其中,mbd1
‑
ngtet1的最终氧化产物的占比最大,可达到90.4%,要明显高于其他几个mbd功能结构域。
[0045]
实施例3:基于mbd1
‑
ngtet1的简便高通量测序方法。
[0046]
在实施例2中,我们验证了ngtet1在氧化5mc过程中产生的最终产物5cac占比最
多,且融合了mbd1的ngtet1能够显著提高氧化产物中5cac的占比,这些结果表明mbd1
‑
ngtet1蛋白具有应用在基于tet蛋白的高通量dna甲基化检测技术taps(liu y, siejka
‑
zieli
ń
ska p, et al. nature biotechnology, 2019)上的潜力。但是,目前的taps技术流程操作复杂、耗时长、损失大,难以实现大范围工业化。我们根据mbd
‑
ngtet1及相应的tet酶反应缓冲液优化的taps流程和处理条件,极大简化了taps的操作,缩短了taps的处理时长,提高了taps检测dna甲基化的灵敏度和准确性。具体实施方式如下:(1)mbd1
‑
ngtet1对模板dna进行氧化:表3组分用量controldnacpgmethylatedpuc191
‑
100ng10
×
tet酶反应缓冲液3μl10μm各tet酶2
‑
10μl补ddh2o至30μl37℃处理0.5
‑
2 h。
[0047]
(2)还原剂处理,碱中和:加入6
‑
12 μl醋酸钠和100
‑
4000 mm还原剂(包括氢化铝锂、氢化硼锂、醋酸硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、三乙基硼氢化锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2
‑
甲基吡啶硼烷、硼氢化钠、氨硼烷锂、吡咯烷并硼氢化锂、叔丁胺硼烷、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷吗啉络合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4
‑
甲基吗啉硼烷、硼烷三甲胺络合物、5
‑
乙基
‑2‑
甲基吡啶硼烷、n,n
‑
二异丙基乙胺硼烷、硼烷四氢呋喃络合物、硼烷二甲基硫醚络合物)。室温反应4
‑
12 h。反应结束后,加入5
‑
30 ul 3 m naoh,混匀。
[0048]
(3)dna回收:磁珠法回收:加入1.6 x dna hieff ngs
®ꢀ
dna selection beads,室温孵育5
‑
10 min后。将pcr管置于磁力架上。待溶液澄清后吸去上清。80%的乙醇清洗磁珠两次后,吸干上清。室温静置3
‑
5 min后,加入21 ul ddh2o洗脱。
[0049]
柱法回收:使用zymo research的dna clean & concentrator
‑
5按照说明书进行dna回收。
[0050]
抽提沉淀法:加入等体积dna抽提试剂混匀后12000x g离心10 min,取上清后,加入1/10体积3 m 醋酸钠和等体积异丙醇。
‑
80℃处理2 h后,12000x g 4℃离心20 min。75%预冷无水乙醇清洗沉淀一次室温晾干,溶解于21 ul ddh2o。
[0051]
(4)dna文库构建:使用翌圣生物的hieff ngs
®ꢀ
fast tagment dna library prep kit for illumina进行dna文库构建。
[0052]
传统taps和优化后的taps流程对比见图4。结果如图5
‑
图9所示,优化后的taps能够显著提高文库的产量(图5)。融合mbd1的ngtet1能够显著增强taps流程的转化率,且在处理1h后基本达到最高值(98%以上)(图6)。不同还原剂对taps的转化率不同(图7),其中,氢化铝锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2
‑
甲基吡啶硼烷、氨硼烷锂、叔丁胺硼烷、硼烷吗啉络合物和硼烷四氢呋喃络合物处理能够达到最高转化率(超过98%)。还原剂的处理时间在4h
‑
8h时接近达到最高值(98.5%以上)。因此,我们检测了mbd
‑
ngtet1、优化tet酶反应缓冲液、优化还原
剂和优化taps流程对dna甲基化检测的影响,发现mbd
‑
ngtet1、优化tet酶反应缓冲液、优化还原剂都能够显著提高taps检测dna甲基化的效率和准确性(图9)。优化流程并不会降低taps检测dna甲基化的效率和准确性(图9)。这些说明优化后的taps准确性更好、效率更高、灵敏度更强。
[0053]
综上,本发明提供了增强tet酶活性的重组蛋白结构域,为dna甲基化结合结构域(mbd),mbd1
‑
4的氨基酸序列如seq id 1
‑
4所示。通过mbd与tet酶融合形成的重组蛋白mbd
‑
tet可以显著增强tet酶包括ngtet1、mtet1cd、mtet2cdt、htet1cd和htet2cdt的氧化活性。此外,本发明还提供了适用于mbd
‑
tet的反应缓冲液和简便快速的高通量dna甲基化检测流程,能够有效增强mbd
‑
tet对5mc的氧化活性,提高基于tet酶氧化反应的dna甲基化检测技术的灵敏度和准确性,可以应用于疾病诊断,尤其是在疾病诊断和肿瘤早筛领域。
再多了解一些
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