miRNA生物标志物在黑色素瘤早期诊断和治疗中的用途的制作方法

mirna生物标志物在黑色素瘤早期诊断和治疗中的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及mirna生物标志物在黑色素瘤早期诊断和治疗中的用途，更具体地，本发明涉及的mirna生物标志物包括mir
‑
431、mir
‑
891b。


背景技术：

2.microrna（mirna）是一类非编码小分子rna（18
‑
25 nt），其与靶基因的3’非翻译区（3’untranslated regions，3’utr）中的互补序列结合，通过降解mrna或抑制蛋白翻译的过程，从而在转录后水平调控基因的表达，与肿瘤的发生、转移、预后等过程密切相关（mueller dw, bosserhoff ak. role of mirnas in the progression of malignant melanoma [j]. cancer, 2009, 101: 551
‑
556.）。mirna以1%的占比调控着30%的人类蛋白质，在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用。越来越多的证据表明，mirna在人类早期的肿瘤中存在差异表达，其可作为抑癌基因或致癌基因从而调控肿瘤的发生、发展和转移（kong yw, ferland
‑
mccollough d, jackson tj, et al. micrornas in cancer management[j]. lancet oncol, 2012, 13(6): 249
‑
258.）。
[0003]
黑色素瘤（melanoma）是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，发生部位常见于皮肤，亦可见于口腔粘膜等处，在皮肤恶性肿瘤中占第三位（约6.8%
‑
20%），在病理上仅次于鳞状细胞癌和基底细胞癌。在全球范围内，黑色素瘤导致75%的患者相关性死亡，死亡率在皮肤恶性肿瘤中居首位，其中侵袭性的黑色素瘤患者的5年生存率仅为15%（gray
‑
schopfer v, wellbrock c, marais r. melanoma biology and new targeted therapy[j]. nature, 2007, 445( 7130) : 851
‑
857.）。目前，黑色素瘤的年增长率约为3%，是发病率增长最快的恶性肿瘤之一（garbe c, peris k, hauschild a, et al. diagnosis and treatment of melanoma: european consensus
‑
based interdisciplinary guideline[j]. cancer, 2010, 46(2): 270
‑
283.）。
[0004]
近年来，随着基因测序、转录组学和生物信息学的发展，越来越多的研究表明mirna是肿瘤发生和发展的关键调节因子，也是人类癌症中有用的诊断和预后的标志物，可指导癌症的治疗（ventura a, jacks t. micrornas and cancer:short rnas go a long way[j]. cell, 2009, 136(1): 586
‑
91），同样的，mirna也被证实参与黑色素瘤的发生和发展的过程中，因此发现新的黑色素瘤相关的mirna，深入了解mirna影响黑色素瘤发生发展的相关分子机制，将会为黑色素瘤的临床治疗提供新的分子靶点。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供mirna生物标志物在黑色素瘤早期诊断和治疗中的用途，所述mirna生物标志物包括mir
‑
431、mir
‑
891b。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一方面，本发明提供了检测生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b表达水平的试剂在制
备诊断黑色素瘤的产品中的应用。
[0007]
进一步，所述生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b在黑色素瘤患者的样本中的表达水平显著下调；优选地，所述样本包括血液、组织、痰液、尿液、胸腔积液；更优选地，所述样本为血液。
[0008]
进一步，所述试剂选自：特异性识别所述生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b的寡核苷酸探针；或特异性扩增所述生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b的引物。
[0009]
进一步，特异性扩增所述生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b的引物的序列分别如seq id no:7
‑
seq id no:8和seq id no:9
‑
seq id no:10所示。
[0010]
另一方面，本发明提供了一种诊断黑色素瘤的产品。
[0011]
进一步，所述产品包含检测待测样本中生物标志物的试剂，所述生物标志物为mir
‑
431和mir
‑
891b；所述产品包括试剂盒、芯片；所述试剂盒包括特异性结合mir
‑
431和mir
‑
891b的引物、探针或芯片；所述芯片包括固相载体、附着在固相载体上的特异性识别mir
‑
431和mir
‑
891b的探针。
[0012]
进一步，所述芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制备方法进行制备。
[0013]
进一步，作为一种可选择的实施方式，所述试剂盒包含与mirna生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b特异性结合的一种或多种探针。作为进一步的实施方式，所述试剂盒还包含洗涤溶液，作为进一步的实施方式，所述试剂盒还包含进行杂交实验的试剂、核酸分离或纯化的工具、检测工具以及阳性对照和阴性对照，作为更进一步的实施方式，所述试剂盒还包含使用所述试剂盒的说明书，所述说明书中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对黑色素瘤的发生或发展情况进行判断、以及对治疗方案进行选择。这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。
[0014]
进一步，所述产品通过rt
‑
pcr、实时定量pcr、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测所述生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b的表达水平。
[0015]
本发明所述的rt
‑
pcr，是指逆转录聚合酶链式反应，本发明所述的实时定量pcr，是指实时定量聚合酶链式反应，pcr通常使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；rt
‑
pcr则将逆转录酶用于从mrna制备互补的dna（cdna），然后将cdna通过pcr扩增以产生dna的多个拷贝。
[0016]
本发明所述的原位杂交，是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程，原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
[0017]
本发明所述的芯片检测，是指基因芯片检测，又称生物芯片检测，它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进
而对靶分子的序列和数量进行分析。
[0018]
进一步，本发明所述的待测样本包括血液、组织、痰液、尿液、胸腔积液；优选地，所述样本为血液。
[0019]
进一步，本发明所述的待测样本来源于受试者。
[0020]
进一步，所述受试者是指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物（特别是高等灵长类动物）、绵羊、狗、啮齿类动物（如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。
[0021]
进一步，在本发明的具体实施例中，所述受试者优选为人。
[0022]
本发明所述的生物标志物的“表达水平”或“表达量”，是指生物学样品中的可检测的所述生物标志物的水平，这些可通过本领域技术人员已知的任何检测方法进行检测，在本发明的具体实施例中，所述生物标志物包括mir
‑
431、mir
‑
891b，优选地，所述生物标志物为mir
‑
431和mir
‑
891b。
[0023]
本发明所述的“下调”，是指mirna相对于对照而言，mirna的表达显示降低至少10%或更多，例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，下调的mirna包括与从正常个体分离的样品相比，从以患有黑色素瘤为特征的个体分离的样品中对应mirna的表达水平降低的mirna。
[0024]
本发明中所述的“促进剂”或“升高生物标志物表达水平的促进剂”，是指mirna mimincs，mirna mimics是一种模拟生物体内源的mirna，运用化学合成的方法合成，能增强内源性mirna的功能。mirna mimics模拟细胞中内源性成熟mirna的高水平表达，以增强内源性mirna的调控作用，是mirna功能研究的一大利器。mirna mimics是一种简单高效的mirna研究工具，只需用转染试剂包裹即可转染进入细胞，无需构建载体的繁琐操作，无需病毒防护方面的担忧，用转染对照即可观察其转染效率。mirna mimics的转染效果，可从靶基因的rna表达水平，蛋白表达水平，细胞功能等方面检测。这些实验能够获得mirna的生物学功能数据，及应用于mirna的靶基因验证方面。通常这些实验涉及到mirna mimics的转染。
[0025]
另一方面，本发明提供了生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b在制备治疗黑色素瘤的药物组合物中的应用。
[0026]
进一步，所述药物组合物包括升高mir
‑
431和mir
‑
891b表达水平的促进剂；所述升高mir
‑
431表达水平的促进剂的序列如seq id no:1
‑
seq id no:2所示；所述升高mir
‑
891b表达水平的促进剂的序列如seq id no:3
‑
seq id no:4所示。
[0027]
另一方面，本发明提供了一种用于治疗黑色素瘤的药物组合物。
[0028]
进一步，所述药物组合物包括升高mir
‑
431和mir
‑
891b表达水平的促进剂；所述升高mir
‑
431表达水平的促进剂的序列如seq id no:1
‑
seq id no:2所示；所述升高mir
‑
891b表达水平的促进剂的序列如seq id no:3
‑
seq id no:4所示。
[0029]
进一步，本发明所述的促进剂可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。
[0030]
进一步，合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。
[0031]
进一步，合适的非消化道施用途径包括血管内施用（例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注），组织周围和组织内注射（例如肿瘤周围和肿瘤内注射），皮下注射或沉积，包括皮下输注（例如利用浸透压泵），直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置（例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物），和吸入。优选地，通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。
[0032]
进一步，本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选地，将药剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中，更优选地，将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。
[0033]
进一步，本发明所述的药物组合物还可以包含传统的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括：稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、ph调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲剂（例如氨基丁三醇盐酸盐）、补加螯合剂（例如dtpa或dtpa
‑
双酰胺等），或钙螯合剂复合物（例如钙dtpa、canadtpa
‑
双酰胺），或者，任选地，补加钙或钠盐（例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙）。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。
[0034]
进一步，固体组合物作为本发明所述的药物组合物的形式之一，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
[0035]
进一步，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10%
‑
95%，优选25%
‑
75%的本发明前述的双链分子（即促进剂中包含的双链分子）；进一步，用于气雾剂（吸入）施用的药物组合物可以包含0.01
‑
20wt%、优选1
‑
10wt%的包被于脂质体中的一种或多种本发明前述的双链分子（即促进剂中包含的双链分子），以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。
[0036]
除上述之外，本发明所述的药物组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本发明前述的双链分子（即促进剂中包含的双链分子）的体内功能。例如，本发明所述的药物组合物中还可以包含常规的用于黑色素瘤治疗或化疗的药物。
[0037]
另一方面，本发明提供了生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b在筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选物质中的应用。
[0038]
另一方面，本发明提供了一种筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选物质的方法。
[0039]
进一步，所述方法包括如下步骤：(1) 将测试物质与含有或表达mir
‑
431和mir
‑
891b的细胞接触；(2) 检测所述细胞中mir
‑
431和mir
‑
891b的表达水平；与该测试物质不存在时检测到的mir
‑
431和mir
‑
891b的表达水平进行比较，选择可升高mir
‑
431和mir
‑
891b表达水平的测试物质为候选物质。
[0040]
本发明公开的生物标志物mir
‑
431和mir
‑
891b的序列均可在mirbase数据库（http://microrna.sanger.ac.uk/）中进行查询，其中，mir
‑
431的序列如seq id no:13所示，mir
‑
891b的序列如seq id no:14所示；
mir
‑
431的序列：uccugcuuguccugcgaggugucuugcaggccgucaugcaggccacacugacgguaacguugcaggucgucuugcagggcuucucgcaagacgacauccucaucaccaacgacg（seq id no:13）mir
‑
891b的序列：ccuuaauccuugcaacuuaccugagucauugauucaguaaaacauucaauggcacauguuuguuguuagggucaaaaga（seq id no:14）进一步，本发明所述的mir
‑
431和mir
‑
891b选自：mir
‑
431和mir
‑
891b初始mirna，mir
‑
431和mir
‑
891b前体mirna，mir
‑
431和mir
‑
891b成熟mirna。
[0041]
进一步，本领域技术人员应当知道，本发明实施例中的mir
‑
431和mir
‑
891b包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整mir
‑
431和mir
‑
891b核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
[0042]
进一步，本领域人员熟知，为了保证mirna的稳定性，可以在mirna的一端或者两端增加保护性碱基，如tt，也可对mirna碱基进行修饰，但是不影响mirna的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响mir
‑
431和mir
‑
891b功能的条件下，对mir
‑
431和mir
‑
891b进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0043]
附图说明
[0044]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1显示mir
‑
431、mir
‑
891b在对照组和黑色素瘤组之间差异表达的结果图，其中，a图：mir
‑
431，b图：mir
‑
891b；图2显示mir
‑
431、mir
‑
891b对黑色素瘤的诊断效能验证的roc曲线结果图，其中，a图：mir
‑
431，b图：mir
‑
891b；图3显示mir
‑
431 mir
‑
891b联合对黑色素瘤的诊断效能验证的roc曲线结果图；图4显示mir
‑
431、mir
‑
891b的相对表达量的结果图，其中，a图：mir
‑
431，b图：mir
‑
891b；图5显示mir
‑
431、mir
‑
891b、mir
‑
431 mir
‑
891b联合对黑色素瘤细胞凋亡率的影响的结果图，其中，a图：空白对照组，b图：阴性对照组，c图：mir
‑
431 mimics组，d图：mir
‑
891b mimics组，e图：mir
‑
431 mimics mir
‑
891b mimics组。
[0045]
具体实施方式
[0046]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0047]
实施例1 筛选黑色素瘤中差异表达的基因1、数据来源和处理
在基因表达综合数据库（gene expression omnibus，geo）中搜索公共基因表达数据和完整的临床注释，从geo数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载黑色素瘤（melanoma）基因表达数据集gse20994，所述数据集中包括健康对照者和黑色素瘤患者的血液样本数据，所述数据集的样本量为case：normal=35：22，并利用注释文件对其注释，多个探针对应同一个基因的取平均值作为其表达量，然后获得基因表达矩阵文件。
[0048]
2、差异表达分析使用r软件中的“limma”包对上述数据进行差异表达分析，其中，差异表达基因的筛选标准均为：|log2fc|>0.5，adj.p value<0.05。
[0049]
3、实验结果实验结果显示，筛选得到的差异表达的基因共有397个，其中，上调的差异表达基因有190个，下调的差异表达基因有207个，其中，本发明涉及的生物标志物mir
‑
431、mir
‑
891b在黑色素瘤患者的血液样本中的表达均显著下调，结果见表1和图1a、图1b。
[0050]
表1 mir
‑
431、mir
‑
891b的差异表达结果实施例2 mir
‑
431、mir
‑
891b诊断效能的验证1、实验方法使用r包“proc”执行接收器工作特性（roc）分析，绘制roc曲线，分别对实施例1中筛选得到的差异表达基因mir
‑
431、mir
‑
891b、mir
‑
431 mir
‑
891b作为检测变量的auc值、敏感性和特异性进行分析，判断上述指标mir
‑
431、mir
‑
891b、mir
‑
431 mir
‑
891b对黑色素瘤的诊断效能，在判断单个mirna的诊断效能时，直接使用mirna的表达量进行分析。首先调用proc包，然后读入目的mirna构建的表达量矩阵，运行绘制roc曲线的命令，其中命令采用for循环，同时涉及添加auc、thres（阈值）、smooth（拟合曲线）的命令。在判断mirna联合的诊断效能时，首先是使用glmnet对mirna进行logistics回归分析，利用建立的logistic回归模型，使用predict函数观察某个预测变量在各个水平对结果概率的影响，计算预测概率，绘制预测结果的roc曲线，对mir
‑
431、mir
‑
891b、mir
‑
431 mir
‑
891b的诊断效能进行分析。
[0051]
2、实验结果结果见表2和图2a、图2b、图3，从结果中可以看出mir
‑
431、mir
‑
891b两者联合应用于黑色素瘤的诊断中具有较高的准确性、敏感性以及特异性，auc值为0.913，显著优于单个基因mir
‑
431、mir
‑
891b的诊断效能，表明了mir
‑
431、mir
‑
891b两者联合具有更好的诊断效能。
[0052]
表2 mir
‑
431、mir
‑
891b、mir
‑
431 mir
‑
891b的诊断效能结果
实施例3 mir
‑
431、mir
‑
891b的表达与黑色素瘤细胞的凋亡的关系研究1、实验材料实验中涉及到的主要实验器材和实验试剂及耗材见表3和表4。
[0053]
表3 实验中涉及的主要器材表4 实验中涉及的主要试剂2、细胞来源黑色素瘤细胞a375购自于中国科学院上海细胞生物研究所，引进后在本实验室长期培养。a375培养基为以dmem 10% fbs 1% p/s solution，37℃、5% co2、95%空气、饱和湿度的条件下进行培养。
[0054]
3、细胞培养(1) a375黑色素瘤细胞复苏细胞复苏法使用的是水浴锅内快速融化的方法。实验之前进行防护，穿戴好手套及防护面具，从液氮中取出一支a375黑色素瘤细胞冻存管，注意观察标签名称、冻存日期等信息，确定是需要的细胞，然后快速放入已经备好的37℃的水浴锅中，整个过程一定要快速，最好在1 min时间内把冻存液完全融化，此时注意无菌操作防止感染，特别注意瓶盖处防护，完成融化后使用吸管把冻存的细胞转移到离心管中，加入pbs缓冲溶液均匀吹打，保证完全融入pbs缓冲溶液中，然后把离心管放入离心机中，调整转速1000 rpm/min，时间维持5 min左右，取出上清，保留离心管底层的物质，加入适量dmem完全培养基重新悬浮，按照1:2种植于t25培养瓶中，每个培养瓶中加入dmemf完全培养基5 ml，于镜下可见悬浮的圆形的细胞，代表已经把细胞转移成功，然后放入含有5% co2、37℃恒温的细胞孵育箱中进行培
养；(2) a375黑色素瘤细胞换液a375黑色素瘤细胞开始贴壁的时间一般是大约4
‑
6 h左右，一般一天的时间就可以完全贴壁，贴壁后的细胞呈多边形，可以根据观察培养液的颜色及镜下观察情况进行换液，注意dmem完全培养基要在37℃恒温水浴锅中提前预热，可以用巴氏管吸取上面的陈旧培养液，尽可能不要接触培养皿的下部，防止底层细胞造成划痕，细胞生长不均匀。然后沿着侧壁慢慢加入37℃水浴预热的pbs缓冲溶液进行清洗，去除一些坏死的细胞，可以用37℃水浴预热的pbs冲洗三次，最后在培养皿中加入37℃水浴预热的5 ml dmem完全培养基，放入5% co2、37℃恒温孵育箱培养。整个过程注意无菌操作，巴氏管接触外界后要及时丢弃，过程干净利索，不宜过长时间；(3) a375黑色素瘤细胞传代约2
‑
3天，a375黑色素瘤细胞就可以达到80%
‑
100%的细胞融合，此时进行细胞传代。实验之前要进行个人防护，在提前消毒30 min的超净工作台中，使用巴氏管，吸弃陈旧的培养液，使用37℃水浴预热的pbs冲洗三次，加入1 ml浓度为0.25%胰蛋白酶，放入37℃恒温孵育箱中，计时1 min左右，为明确细胞是否完全被消化，可以在倒置显微镜下观察，如果见圆形的细胞大部分悬浮，就可停止胰蛋白酶消化，加入1
‑
2 ml的37℃水浴预热的5
‑
10 ml dmem/f
‑
12完全培养基，同时及时吹打细胞，使细胞完全悬浮溶液中，然后转移到离心管中，配平离心机，调整转速1000 rpm/min，离心时间5 min左右，按照1:3
‑
1:5的比例进行传代，培养皿放入5
‑
10 ml dmem/f
‑
12完全培养基，放入37℃、5% co2的细胞恒温孵育箱中进行培养。
[0055]
4、细胞转染(1) 取处于对数生长期的a375细胞，生长状态良好的细胞，用培养基将细胞密度调整到1
×
105/ml，接入6孔板，每孔2 ml细胞悬液，每组各两孔，37℃培养过夜；(2) 转染前2小时，换成无血清培养基；(3) 转染步骤，对于每个转染样品，均按如下所述的方法进行准备：1) 转染前一天将细胞计数，取1 ml加入6孔板中，使得孔板的细胞密度不低于2
×
105个；2) 对于每孔细胞，用250 μl的无血清培养基稀释10 μl的100 nm的mimics，室温孵育5 min；3) 对于每孔细胞，用250 μl的无血清培养基稀释5 μl lipo2000，室温孵育5 min；4) 将步骤2)和步骤3)中的液体混合，室温孵育20 min；5) 将预先分好的贴壁细胞换成无血清培养基，加入上述复合物，在37℃，5% co2中培养6小时，再换成加血清的生长培养基，继续在37℃，5% co2中培养48小时。收集细胞样本，pbs洗两次，弃去液体，进行后续rna的提取；将实验设置为3个组：空白对照组（a375黑色素瘤细胞）、阴性对照组（mimics
‑
nc组）和实验组（mimics组）。
[0056]
其中，针对mir
‑
431的mimics的序列信息如下：正义链为5
’‑
ugucuugcaggccgucaugca
‑3’
（seq id no:1）
反义链为5
’‑
ugcaugacggccugcaagaca
‑3’
（seq id no:2）针对mir
‑
891b的mimics的序列信息如下：正义链为5
’‑
ugcaacuuaccugagucauuga
‑3’
（seq id no:3）反义链为5
’‑
ucaaugacucagguaaguugca
‑3’
（seq id no:4）mimics
‑
nc的序列信息如下：正义链为5
’‑
uuuguacuacacaaaaguacug
‑3’
（seq id no:5）反义链为5
’‑
caguacuuuuguguaguacaaa
‑3’
（seq id no:6）5、qpcr检测细胞中mir
‑
431、mir
‑
891b的表达水平(1) 样本总rna的提取（trizol法）1) 取适量待测样本加入液氮后研磨粉碎；2) 用1 ml trizol将研磨样本转移到1.5 ml ep管中；3) 向1.5 ml ep管中加入500 μl酚氯，仿振荡混匀后，静止5分钟；4) 4℃ 12000 rpm离心10分钟，小心吸取上清于一新的1.5 ml ep管中；5) 向分离出的上清中加入700 μl异丙醇，充分混匀；6) 4℃ 12000 rpm离心10分钟，小心弃上清；7) 用75%乙醇洗涤沉淀一次，室温晾干；8) 50 μl depc水溶解rna沉淀；9) 琼脂糖凝胶电泳检测。
[0057]
(2) 总rna质量检测1) 使用核酸浓度测定仪测定rna浓度和纯度，测量前先用溶解rna用的depc水调零，操作方法如下：抬起样品臂，把样品加到检测基座上；放下样本臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。在上下两个光纤之间会自动拉出一个样品柱，然后进行检测；当检测完成后，抬起样品臂，并用干净的无尘纸把上下基座上的样品擦拭干净；2) 浓度测定：260 nm处读值为1表示40 ng rna/
µ
l。样品rna浓度计算公式为：a260 x 40 ng/
µ
l；3) 纯度检测：rna溶液的a260/a280的比值是一种rna纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。
[0058]
(3) 逆转录合成cdna逆转录使用invitrogen的逆转录试剂盒superscript iii；反应体系1的建立见表5，混匀，离心，65℃，5分钟，结束后置于冰上；表5 反应体系1的组成反应体系2的建立见表6；表6 反应体系2的组成
混匀，离心，置于42℃，水浴60分钟；取出后置于85℃，反应10分钟，灭活逆转录酶，反应结束后将产物置于
‑
20℃待用。
[0059]
(4) 实时荧光定量检测首先设计qpcr的扩增引物，具体引物序列如下：mir
‑
431：正向引物为5
’‑
tgtcttgcaggccgtcatg
‑3’
（seq id no:7）；反向引物为5
’‑
ctcaactggtgtcgtg
‑3’
（seq id no:8）；mir
‑
891b：正向引物为5
’‑
tgcaacttacctgagtcat
‑3’
（seq id no:9）；反向引物为5
’‑
ctcaactggtgtcgtg
‑3’
（seq id no:10）；u6内参引物：正向引物为5
’‑
gcttcggcagcacatatactaaaat
‑3’
（seq id no:11）；反向引物为5
’‑
cgcttcacgaatttgcgtgtcat
‑3’
（seq id no:12）；real time pcr反应体系建立见表7；表7 real time pcr反应体系体系混匀后，瞬离，置于荧光定量pcr仪上进行检测，按照表8所述的条件进行反应；表8 realtime pcr反应条件
对各组样本的相对定量结果进行分析，其中，mir
‑
431、mir
‑
891b相对表达量的计算公式如下：6、细胞凋亡实验本实施例中采用流式细胞术检测mir
‑
431、mir
‑
891b、mir
‑
431 mir
‑
891b的表达对a375黑色素瘤细胞凋亡的影响，首先收集未经转染、转染mir
‑
431 mimics、转染mir
‑
891b mimics、同时转染mir
‑
431 mimics和mir
‑
891b mimics的a375黑色素瘤细胞，对细胞进行洗涤后用乙醇进行固定，并进行细胞的重悬和细胞过滤，并采用pi染液进行染色，之后采用流式细胞仪进行检测；其中，在细胞凋亡检测中，流式细胞术检测结果图中的不同象限代表不同的意义，q1
‑
1 (annexinv
‑
fitc)
‑
/pi 代表坏死细胞，q1
‑
2 (annexinv fitc) /pi 代表中晚期凋亡的细胞，q1
‑
4 (annexinv
‑
fitc) /pi
‑
代表早期凋亡的细胞，q1
‑
3 (annexinv
‑
fitc)
‑
/pi
‑
代表正常的活细胞，各象限的百分数分别代表对应细胞所占的比例，细胞总凋亡率=中晚期凋亡率 早期凋亡率。
[0060]
7、实验结果转染的结果显示，以空白对照组mir
‑
431的表达水平作为参比设为1，相比于空白对照组mir
‑
431的表达量（相对表达量为1）与转染mimics
‑
nc的阴性对照组（nc组）mir
‑
431的表达量，转染mir
‑
431 mimics的实验组的mir
‑
431的表达量显著上调，且差异具有统计学意义（p＜0.05），而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异（见图4a）；转染的结果显示，以空白对照组mir
‑
891b的表达水平作为参比设为1，相比于空白对照组mir
‑
891b的表达量（相对表达量为1）与转染mimics
‑
nc的阴性对照组（nc组）mir
‑
891b的表达量，转染mir
‑
891b mimics的实验组的mir
‑
891b的表达量显著上调，且差异具有统计学意义（p＜0.05），而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异（见图4b）；细胞凋亡实验的结果显示，转染mir
‑
431 mimics的实验组的细胞的总凋亡率（10.28%）显著高于空白对照组（3.11%）和阴性对照组（3.01%）（见表9和图5a、图5b、图5c），表明mir
‑
431能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力，升高mir
‑
431的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡；细胞凋亡实验的结果显示，转染mir
‑
891b mimics的实验组的细胞的总凋亡率（10.00%）显著高于空白对照组（3.11%）和阴性对照组（3.01%）（见表9和图5a、图5b、图5d），表明mir
‑
891b能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力，升高mir
‑
891b的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡；细胞凋亡实验的结果显示，共同转染mir
‑
431 mimics和mir
‑
891b mimics的实验组的细胞的总凋亡率（25.28%）显著高于单独转染mir
‑
431 mimics的实验组（10.28%）和单独转染mir
‑
891b mimics的实验组（10.00%）（见表9和图5c、图5d、图5e）；此外，对各组的细胞抑制率进行计算，计算得到的结果见表10，利用金氏公式表达式q=e
a b
/(e
a
e
b
‑
e
a
×
e
b
)判断二者联合使用后的效果是否优于单独使用的效果，其中，e
a b
为mir
‑
431 mimics mir
‑
891b mimics对黑色素瘤细胞的抑制率，e
a
为mir
‑
431 mimics对黑色素瘤细胞的抑制率，e
b
为mir
‑
891b mimics对黑色素瘤细胞的抑制率；若q=0.85
‑
1.15之间为单纯叠加，1.15＜q＜20为协同，q＞20为显著协同，q＜0.85为拮抗，即q＞1.15时即可判定mir
‑
431 mimics和mir
‑
891b mimics两者对黑色素瘤细胞的凋亡促进作用为协同效果，而非单纯叠加；根据表10计算得到的细胞抑制率的结果，利用金氏公式计算增效q值，评价mir
‑
431 mimics和mir
‑
891b mimics两者联用的效应是否强于单独的效应，代入计算得到的细胞抑制率的结果可知，q=e
a b
/(e
a
e
b
‑
e
a
×
e
b
)=0.2217/(0.0717 0.0689
‑
0.0717
×
0.0689)=1.630，即q=1.630，q＞1.15，表明了mir
‑
431 mimics和mir
‑
891b mimics两者对黑色素瘤细胞的凋亡促进作用为协同效果，进一步证明了mir
‑
431 mimics和mir
‑
891b mimics两者联合为协同治疗，而非单纯的叠加效果。
[0061]
表9 细胞凋亡实验的结果统计表10 各组的细胞抑制率的计算结果上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。