用于确定犬科动物的微生物组的年龄状态的监测工具和诊断方法与流程

用于确定犬科动物的微生物组的年龄状态的监测工具和诊断方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年1月18日提交的英国专利申请第1900750.9号的优先权，该专利申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开内容涉及用于确定犬科动物微生物组的年龄状态并在其中评估动物健康的监测工具和诊断方法的领域。
技术背景
4.近年来，人们对微生物组及其对健康影响的了解显著增加。微生物组的变化及其与免疫、内分泌和神经系统的相互作用与多种健康状况和疾病相关，从炎症性肠病[1
‑
3]到癌症[4]以及到宿主健康的行为方面[5；6]。
[0005]
微生物组的建立与免疫系统的发育同时发生，并在肠道生理和调节中发挥作用。肠道微生物群的初步建立是新生儿发育的重要步骤，影响婴儿期的免疫发育和整个生命的健康。因此，在人类和许多哺乳动物中，肠道微生物组发育的早期建立阶段发生了多样性的快速增加[7]。
[0006]
成年肠道微生物组可以适应群落结构的巨大变化，并且在人类和其他哺乳动物中，它被认为在整个成年生活中相对稳定。这种“成年微生物组”被认为代表了狗的健康肠道微生物组且具有比其他生命阶段更强的适应力。在生命早期阶段，幼犬具有未发育好的肠道屏障，这包括胃肠道微生物组以及组织学和肠道相关免疫功能。因此，幼年犬(pyppy)和青年犬(young dog)更容易出现诸如腹泻和生病等胃肠道疾病。较老的犬(senior dog)和老年犬(geriatric dog)也更容易出现腹泻和胃肠道并发症，部分原因可能是肠道微生物组的恶化。
[0007]
鉴于微生物组对健康和幸福的重要性，由于肠道屏障和胃肠道健康随着年龄的增长会发生内在变化，因此找到确定动物的微生物组状态的方法很重要，就微生物组的年龄状态而言，可以考虑这种状态。


技术实现要素：

[0008]
本文公开了允许确定犬科动物微生物组生物学年龄状态的诊断方法。如实施例中所示，本公开的方法可以以高精度实现这一点。
[0009]
在一方面，本公开内容提供了一种确定犬科动物的微生物组年龄状态的方法，包括：(a)检测从所述犬科动物获得的样品中的一种或多种细菌分类群(taxa)；(b)使所述样品中的所述一种或多种细菌分类群与对照数据集相关联；和(c)确定所述微生物组年龄。这些方法对于评估犬科动物的健康特别有用，因为微生物组年龄与犬科动物实际年龄之间的差异可以表明其健康状况。例如，在一些实施方案中，成年狗具有青少年微生物组是不希望
的，因为这与不稳定性或低多样性相关并导致相关的健康状况，例如对腹泻的易感性。
[0010]
在另一方面，提供了一种监测犬科动物的方法，包括通过本公开内容的方法在至少两个时间点确定犬科动物的微生物组年龄的步骤。这在犬科动物正在接受治疗以改变微生物组的情况下特别有用，因为它可以监控治疗的进展。在一些实施方案中，所述方法也可用于监测犬科动物的健康，因为从例如成年微生物组到较老年微生物组的快速转变可以指示疾病。本公开内容的这一方面还可用于评估犬科动物的微生物组是否随着动物变老而进展。
[0011]
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括改变微生物组组成的进一步步骤。这可以通过改变饮食、食用功能性食品、服用营养品或药物组合物或含有细菌的制剂来实现。这在本公开内容的方法已经鉴定出与犬科动物的实际年龄不一致的微生物组生物学年龄状态并且犬科动物因此在动物的实际年龄的背景下可能更健康或更不健康的情况下特别有用。
[0012]
在另一方面，还提供了一种监测已经经历饮食改变或接受了能够改变微生物组组成的功能性食物、营养品或药物组合物的犬科动物的微生物组年龄的方法，包括通过根据本公开内容的方法确定微生物组生物学年龄状态。这样的方法允许技术人员确定治疗的成功。在特定的实施方案中，这些方法包括确定治疗前后的微生物组年龄，因为这有助于评估治疗的成功。
[0013]
如上所述，在特定的实施方案中，所公开的主题提供了一种确定犬科动物的微生物组生物学年龄状态的方法，包括：(a)检测从所述犬科动物获得的样品中的一种或多种细菌分类群；(b)使所述样品中的所述一种或多种细菌分类群与对照数据集相关联；和(c)确定所述微生物组的生物学年龄状态。在要求保护的方法的特定实施方案中，所述对照数据集包括犬科动物在不同时期或生命阶段的微生物组数据。在要求保护的方法的另一个实施方案中，所述对照数据集包括来自选自由幼年的犬科动物、成年的犬科动物、较老的犬科动物和老年的犬科动物组成的列表的犬科动物的至少两个生命阶段的微生物组数据。在特定的实施方案中，所述对照数据集包括来自所有幼年的、成年的、较老的和老年的微生物组数据。
[0014]
在要求保护的方法的某些实施方案中，该方法包括量化一种或多种细菌分类群。
[0015]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌分类群是选自由以下所组成的组的属的细菌物种：乳杆菌属(lactobacillus)、土孢杆菌属(terrisporobacter)、苏黎世杆菌属(turicibacter)、拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、异杆菌属(allobaculum)、布劳特氏菌属(blautia)、鲸杆菌属(cetobacterium)、梭菌属(clostridium)、杜氏乳杆菌属(dubosiella)、埃希氏菌属(escherichia)、考拉杆菌属(phascolarctobacterium)、链球菌属(streptococcus)、巨单胞菌属(megamonas)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、梭杆菌属(fusobacterium)、肠球菌属(enterococcus)、拉克氏梭状芽胞杆菌属(lachnoclostridium)、刺骨鱼菌属(epulopiscium)、丹毒丝菌科(erysipelotrichaceae)、多尔氏菌属(dorea)、阿德勒克罗伊茨菌属(adlercreutzia)、厌氧螺菌属(anaerobiospirillum)、罗姆布茨菌属(romboutsia),消化链球菌科(peptostreptococcaceae)以及普雷沃氏菌属(prevotella)，或来自丹毒丝菌科(erysipelotrichaceae)、消化链球菌科(peptostreptococcaceae)或毛螺旋菌科的种
(lachnospiraceae sp.)的科的细菌物种。
[0016]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌分类群是选自由以下所组成的组的细菌物种：产液阿德勒克罗伊茨菌(adlercreutzia equolifaciens)、厌氧螺菌属的种(anaerobiospirillum sp.)、拟杆菌属的种(bacteroides sp.)、布劳特氏菌属的种(blautia sp.)、活泼布劳特氏[瘤胃球菌](blautia[ruminococcus]gnavus)、扭链布劳特氏[瘤胃球菌](blautia[ruminococcus]torques)、卵形布劳特氏菌(blautia obeum)、生产布劳特氏菌(blautia producta)、索氏鲸杆菌(cetobacterium somerae)、梭菌属(clostridium)、隐藏梭菌(clostridiumcelatum)、达卡伦斯梭菌(clostridium dakarense)、平野梭菌(clostridium hiranonsis)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、梭菌属的种(clostridium sp.)、梭菌属的种k39(clostridium sp.k39)、多尔氏菌属的种(dorea sp.)、纽约杜氏乳杆菌(dubosiella newyorkensis)、亚洲肠球菌(enterococcus asini)、铅黄肠球菌(enterococcus casseliflavus)、血过氧化物肠球菌(enterococcus haemoperoxidus)、硫磺肠球菌(enterococcus sulfureus)、丹毒丝菌科的种(erysipelotrichaceae sp.)、大肠埃希氏菌/福氏志贺氏菌(escherichia coli/shigella flexneri)、死亡梭杆菌(fusobacterium mortiferum)、拉克氏梭状芽胞杆菌属的种(lachnoclostridium sp.)、毛螺旋菌科的种(lachnospiraceae sp.)、动物乳杆菌(lactobacillus animalis)、田鼠乳杆菌(lactobacillus apodemi)、格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)、仓鼠乳杆菌(lactobacillus hamsteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)、鼠乳杆菌(lactobacillus murinus)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、台湾乳杆菌(lactobacillus taiwanensis)、巨单胞菌属的种(megamonas sp.)、马赛尼亚美杆菌(niameybacter massiliensis)、消化链球菌科tm5(peptostreptococcaceae tm5)、高氏瘤胃球菌群组的种(ruminococcus gauvreauii group sp.)、普雷沃氏菌属的种(prevotella sp.)、罗姆布茨菌属的种(romboutsia sp.)、非解乳糖链球菌(streptococcus alactolyticus)、黄体链球菌(streptococcus luteciae)、土孢杆菌属的种(terrisporobacter sp.)及其苏黎世杆菌属的种(turicibacter sp.)。
[0017]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:32
‑
68中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0018]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测来自选自由考拉杆菌属(phascolarctobacterium)、拟杆菌属(bacteroides)以及埃希氏菌属/志贺氏菌属(escherichia/shigella)组成的组的属的一种或多种细菌物种。
[0019]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测选自由考拉杆菌属的种(phascolarctobacterium sp.)、拟杆菌属的种(bacteroides sp.)以及大肠埃希氏菌/福氏志贺氏菌(escherichia coil/shigella flexneri)所组成的组的一种或多种细菌物种。
[0020]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:32
‑
36中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0021]
在要求保护的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括检测瑞士乳杆菌
(lactobacillus helveticus)、仓鼠乳杆菌(lactobacillus hamsteri)、土孢杆菌属的种(terrisporobacter sp.)、苏黎世菌属的种(turicibacter sp.)、卵形布劳特氏菌(blautia obeum)以及布劳特氏菌属的种(blautia sp.)。
[0022]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:37
‑
41中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0023]
在要求保护的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括检测隐藏梭菌(clostridium celatum)、梭菌属的种(clostridium sp.)、双孢梭菌(clostridium disporicum)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、索氏鲸杆菌(cetobacterium somerae)、约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)、扭链布劳特氏菌(blautia torques)、纽约杜氏乳杆菌(dubosiella newyorkensis)、非解乳糖链球菌(streptococcus alactolyticus)、巨单胞菌属的种(megamonas sp.)以及苏黎世杆菌属的种(turicibacter sp.)。
[0024]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:32和42
‑
50中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0025]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测所有的seq id no:32和42
‑
50。
[0026]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种来自选自由以下所组成的组的细菌属：梭菌属(clostridium)、柯林斯氏菌属(collinsella)、肠球菌属(enterococcus)、真杆菌属(eubacterium)、埃希氏菌属
‑
志贺氏菌属(escherichia
‑
shigella)、黄杆菌属(flavonifractor)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、拉克氏梭状芽胞杆菌属(lachnoclostridium)、毛螺旋菌科(lachnospiraceae)、乳杆菌属(lactobacillus)、派尼梭菌属(paeniclostridium)、片球菌属(pediococcus)、艰难梭菌属(peptoclostridium)、罗姆布茨菌属(romboutsia)、葡萄球菌属(staphylococcus)以及泰泽雷拉菌属(tyzzerella)。
[0027]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种选自由梭菌属的种(clostridium sp.)、柯林斯氏菌属的种(collinsella sp.)、肠球菌属的种(enterococcus sp.)、埃希氏菌
‑
志贺氏菌属的种(escherichia
‑
shigella sp.)、黄杆菌属的种(flavonifractor sp.)、痢疾志贺氏菌(shigella dysenteriae)、拉克氏梭状芽胞杆菌属的种(lachnoclostridium sp.)、毛螺旋菌属的种(lachnospiraceae sp.)、乳杆菌属的种(lactobacillus sp.)、真杆菌属的种(eubacterium sp)、片球菌属的种(pediococcus sp.)艰难梭菌属的种(peptoclostridium sp.)、罗姆布茨菌属的种(romboutsia sp.)、葡萄球菌属的种(staphylococcus sp.)和泰泽雷拉菌属的种(tyzzerella sp.)所组成的组。
[0028]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:3
‑
31中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0029]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌属于活泼布劳特氏菌瘤胃球菌(blautia[ruminococcus]gnavus)的物种。
[0030]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:20的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0031]
在要求保护的方法的某些实施方案中，检测和/或量化至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种或至少28种不同的分类群。
[0032]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法包括检测或量化活泼瘤胃球菌属(ruminococcus gnavus)、埃希氏菌属的种(escherichia sp.)、葡萄球菌属(staphylococcus)以及黄杆菌属(flavonifractor)。
[0033]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:13、16、17、20以及29中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0034]
在要求保护的方法的某些实施例中，该方法进一步包括检测或量化罗姆布茨菌属的种(romboutsia sp.)、艰难梭菌属的种(peptoclostridium sp.)、拟杆菌属的种(bacteroides sp.)、巨单胞菌属的种(megamonas sp.)以及柯林斯菌属的种(collinsella sp.)。
[0035]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:10、15、22、26以及27中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0036]
在要求保护的方法的某些实施方案中，该方法进一步包括检测或量化梭菌属的种(clostridium sp.)、巨单胞菌属的种(megamonas sp.)、派尼梭菌属的种(paeniclostridium sp.)、泰泽雷拉菌属的种(tyzzerella sp.)、罗姆布茨菌属的种(romboutsia sp.)以及布劳特氏菌属的种(blautia sp.)。
[0037]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种具有16s rdna，所述16s rdna与seq id no:3、4、8、9、14、18、19、21、23和24中任一项的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性。
[0038]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述细菌物种通过dna测序、rna测序、蛋白质序列同源性或指示所述细菌物种的其他生物标记来检测。
[0039]
在要求保护的方法的某些实施例中，犬科动物的微生物组生物学年龄状态与其生物年龄相比较，并且当存在差异时通知犬科动物的主人。
[0040]
在一个替代实施方案中，所公开的主题提供了一种监测犬科动物的方法，包括在至少两个时间点通过任一前述权利要求的方法确定动物的微生物组生物学年龄状态的步骤。在某些实施方案中，两个时间点相隔6个月。
[0041]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述对照数据集代表幼年的犬科动物的微生物组、成年的犬科动物的微生物组、较老的年犬科动物的微生物组或老年的犬科动物的微生物组。
[0042]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述样品是粪便样品或来自胃肠道的样品。在要求保护的方法的某些实施方案中，所述样品是回肠、空肠、十二指肠或结肠样品。
[0043]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括改变饮食改变、补充剂、功能性食品、营养品或药物组合物或运动/身体活动方案的微生物组施用的组成。
[0044]
在一个替代实施方案中，所公开的主题提供了一种监测已经接受能够改变所述微生物组组成的饮食改变、补充剂、功能性食品、营养品或药物组合物或运动/身体活动方案的犬科动物的微生物组生物学年龄状态的方法，包括通过前述权利要求中任一项所述的方法确定微生物组生物学年龄状态。在某些实施方案中，微生物组年龄在组合物施用之前和之后确定。
[0045]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述组合物包含细菌。
[0046]
在要求保护的方法的某些实施方案中，所述犬科动物是狗。
附图说明
[0047]
图1：细菌分类群(otu)按重要性得分排序，描述样品分配到适当研究组(生命早期、断奶期间或幼犬期后期(快速生长期))的一致性。roise＝稀有(rares)和噪音(noise)。
[0048]
图2：模型中使用的otu数量逐次增加的累积灵敏度和正预测值，且otu按年轻动物(<2岁)的重要性顺序排列。
[0049]
图3a和图3b：图3a和图3b分别显示了按重要性分数排序的细菌分类群(otu)，描述了将样品分配给适当犬类研究组(成年的犬、较老的犬和老年的犬)的一致性。
[0050]
图4：在成年生命阶段的预测模型中，按重要性顺序排列的otu数量连续增加的累积灵敏度和正预测值。
[0051]
图5：按重要性顺序排列的连续增加的otu数量的准确度得分。
[0052]
图6：plsda相关图，用于使用对检测生物年龄最有影响的15个分类群针对对照组的狗和测试样品的相对丰度数据进行聚类(样品在y轴上按组表示，且红色分配给成年的样品；绿色给较老的犬以及蓝色表示来自老年的犬的样品)。粪便样品以单独的水平行表示，并根据相似性进行聚类，而细菌otu则由热图中的各个列表示。相关图中的颜色编码表示相关的程度和方向。
[0053]
图7a和图7b：图7a和图7b均显示门水平汇总数据，显示了两项独立研究中门比例随时间的变化。
[0054]
图8a
‑
图8h：图8a到图8h提供了队列中八只代表性犬的堆叠条形图，展示了每个采样点丰度分类群的分布。图8a
‑
图8h中的每一个都代表了单只狗的不同数据集。
[0055]
图9：基于25个otu的细菌丰度数据相似性的偏最小二乘判别分析(pls
‑
da)相关图，显示对样品聚类的影响最大(投影得分中的变量重要性>1)。
[0056]
图10对应于表1.3，表1.3提供了按重要性排序的基于otu的相对丰度的，用于给微生物组分配年龄组的累积预测分数。p＝位置。
[0057]
图11对应于表2.3，表2.3提供了可用于确定犬科动物微生物组年龄的细菌分类群。
[0058]
图12对应于表2.4，表2.4提供了指示犬科动物健康微生物组的各种细菌物种的丰度范围。
[0059]
图13对应于表4，表4提供了在用抗生素治疗后在肠道中检测到的细菌分类群。
具体实施方案
[0060]
微生物组的生物年龄状态
[0061]
本公开内容的方法可用于确认来自犬科动物的微生物组的生物年龄状态。通过将样品中的细菌分类群和任选地它们的相对丰度与对照数据集进行比较，可以将微生物组分配到特定的“年龄”或“生命阶段(lifestage)”或“生命阶段(life stage)”。通常，对照数据集将代表具有已知微生物组组成的犬科动物微生物组和犬科动物年龄多样性范围。例如，可以分析来自特定年龄组(幼年的、成年的、较老的、老年的)的许多犬科动物的微生物组组成。此外或可选择地，可以在生命阶段内或不同生命阶段中的每隔一段时间从同一犬科动物分析微生物组组成。对所有测试个体的不同年龄组表现出高度特异性的细菌分类群然后可以用作对照数据集。对照数据集也可以基于对单个个体的分析。对照数据集也可以基于对同一个体在不同生命阶段的分析。在特定的实施方案中，表1.1、表1.2、图10(表1.3)以及表2.1、表2.2和图11(表2.3)中所示的数据集用作本公开内容的方法中的对照数据集。
[0062]
在一些实施方案中，微生物组的生物年龄状态通过下述来确定：比较样品中的微生物组与具有已知微生物组的年龄(对照微生物组)的微生物组组成并基于与对照的相似性来确定微生物组的生物年龄状态。因此，在一些实施方案中，对照数据集可以包括处于不同生命阶段的犬科动物的典型微生物组。在特定的实施方案中，对照数据集包括来自幼年的犬科动物、成年的犬科动物、较老的犬科动物和老年的犬科动物的微生物组数据。微生物组的生物年龄状态可以通过识别与犬科动物的微生物组最相似的对照微生物组并将相应的生命阶段分配给犬科动物来确定。这些微生物组数据可以通过上述方法获得。
[0063]
在一些实施方案中，检测和/或量化一种或几种细菌分类群(例如，少于3种、4种、5种、8种、10种、15种、20种、25种或30种)。在特定的实施方案中，分析最少两种细菌分类群，因为目前公开的主题已经表明这样的方法具有良好的灵敏度。这些通常是允许明确分配到一个(或可能两个)不同生命阶段的细菌。在这些实施方案中，评估的一种或多种细菌分类群基于显示这些指示特定生命阶段的数据集。因此，在这些实施方案中，感兴趣分类群的检测和基于这些数据的微生物组生物年龄状态的后续分配构成了使样品中的分类群与对照数据集相关联。
[0064]
当前公开的主题已经发现某些细菌分类群高度指示犬科动物微生物组的生物年龄状态。表1.1中显示的细菌分类群在将样品合适地分配给幼犬期的不同生命阶段的狗方面具有高度一致性。在一些实施方案中，本公开内容的方法因此允许确定犬科动物幼犬(canid puppy)或青年狗(young dog)的微生物组的生物年龄状态。特别地，本公开内容的方法可以用于确定犬科动物的微生物组是否等同于产后早期幼犬期(出生到约12天之间)、中间幼犬时期(约17天到约31天之间)或后期(快速生长阶段)幼犬时期，诸如约38天至约52天之间所看到的。然后，结果可以被评估以确定微生物组的生物年龄状态是否与犬科动物的实际年龄一致。如果没有，可以采取改变微生物组的生物年龄状态的步骤，如下所述。
[0065]
在一些实施方案中，对在本公开内容的方法中分析的细菌分类群进行量化。当前公开的主题已经发现肠道和粪便微生物组内不同细菌分类群的相对丰度随着狗的狗龄增长而变化，如下面的实施例中详细讨论的。因此，微生物组中检测到的细菌分类群的组合和丰度可以确定狗中微生物组的生物年龄状态，如下面的实施例的中详细讨论的。
[0066]
本公开内容的方法通常通过检测基因序列或其他生物标记来检测和/或量化一种或多种不同的细菌分类群，例如一种或多种细菌属和/或一种或多种细菌物种。
[0067]
除了本文所述的那些技术之外，允许技术人员检测和量化细菌分类群的技术是本
领域公知的。例如，这些包括聚合酶链反应(pcr)、量化pcr、16s rdna扩增子测序、鸟枪法测序、宏基因组测序、illumina测序和纳米孔dna测序技术。在特定的实施方案中，细菌分类群通过16s rdna序列的测序来确定。其他方法将包括鸟枪测序以确定特征性非16s rdna基因序列或用于识别物种的其他代谢物和生标记物。
[0068]
在一些实施方案中，细菌分类群通过对v4
‑
v6区进行测序来确定，例如使用illumina dna测序技术。这些方法可以使用引物319f：caagcagaagacggcatacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct(seq id no:1)和806r:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct(seq id no:2)。
[0069]
在进一步的实施方案中，细菌物种可以通过本领域已知的其他方式检测，例如rna测序、蛋白质序列同源性或指示细菌物种的其他生物标记。
[0070]
然后可以使用测序数据来确定样品中不同细菌分类群的存在或不存在。例如，序列可以以约98％、约99％或100％同一性聚类，然后可以评估细菌分类群(例如，代表总序列超过0.01％或0.05％的丰富的分类群)的相对比例。用于确定细菌分类群和生物标记或细菌或生物标记组合的描述性质的将样品分配给特定研究组例如年龄范围的能力的合适技术是本领域已知的，并且包括例如逻辑回归分析；偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminate analysis，plsda)或随机森林分析和其他多变量方法。然后根据它们对特定微生物组的年龄的特异性对细菌分类群或生物标记进行排序。
[0071]
本领域技术人员将理解，不需要每次执行根据本公开内容的方法时都准备对照数据集。相反，技术人员可以如下所述分析样品，并比较结果与数据库，所述数据库显示犬科动物的微生物组成，所述犬科动物具有针对动物年龄的已知健康微生物组，或者针对动物的生命阶段或年龄的平均组成和多样性，。
[0072]
细菌分类群
[0073]
当前公开的主题已经发现某些细菌对于在本公开内容的方法中确定犬科动物的微生物组的年龄特别有用。这些包括考拉杆菌属(phascolarctobacterium)、拟杆菌属(bacteroides)、梭菌属(clostridium)(特别是产气荚膜梭菌(clostridium perfringens))和埃希氏菌属/志贺氏菌属(escherichia/shigella)的属的细菌。这些属中特别有用的物种包括考拉杆菌属的种(phascolarctobacterium sp.)、拟杆菌属的种(bacteroides sp.)和大肠埃希氏菌/福氏志贺氏菌(escherichia coli/shigella flexneri)。在一些实施方案中，被检测的序列与seq id nos:32、33、34、35和/或36的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的同一性。
[0074]
前面段落中讨论的细菌物种在确定犬科动物的微生物组的生物年龄状态方面显示出最高的准确度，如图11(表2.3)所示。当前公开的主题进一步表明，当检测到和/或量化更多种分类群时，准确度增加。因此，在一些实施方案中，检测和/或量化前面段落中提到的所有分类群。例如，与seq id no:32、33、34、35和/或36的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列被检测和/或量化。此外，或可选择地，本公开内容的方法可以分析如下讨论的一种或多种细菌分类群。
[0075]
用于区分成年、较老年和老年微生物组的另外的细菌分类群包括来自选自由下述组成的组的属的物种：乳杆菌属(lactobacillus)、土孢杆菌属(terrisporobacter)、苏黎世杆菌属(turicibacter)、拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、异杆
nos：37
‑
41的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，本公开内容的方法可以进一步包括检测和/或量化与seq id no：42
‑
46、seq id no：47
‑
51、seq id no：52
‑
56、seq id no：57
‑
61、seq id no：62
‑
66和/或seq id no：67
‑
68的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，本公开内容的方法检测和/或量化与seq id no：32
‑
68的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
[0077]
本公开的主题进一步发现，布劳特氏[瘤胃球菌](blautia[ruminococcus])属的细菌，且特别是活泼布劳特氏[瘤胃球菌]物种确定早期生命(断奶前、断奶和断奶后)的不同阶段时的年轻犬科动物的微生物组年龄时特别有用。因此，在某些实施方案中，本文公开的方法包括检测和/或量化与seq id no:20的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或具有100％同一性的序列。
[0078]
当前公开的主题已经发现埃希氏菌属和/或志贺氏菌属的细菌在检测本公开内容的时特别有用。这些细菌还表现出对幼犬期早期生命阶段的特异性，如上所述，并且因此可以区分年轻狗微生物组发育的不同阶段。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括检测和/或量化与seq id no:16和/或17的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
[0079]
其他有用的细菌属和种包括葡萄球菌属(staphylococcus)(葡萄球菌属的种(staphylococcus sp.))、黄杆菌属(flavonifractor)(黄杆菌属的种(flavonifractor sp.))、罗姆布茨菌属(romboutsia)(罗姆布茨菌属的种(romboutsia sp.))、艰难梭菌属(peptoclostridium)(艰难梭菌属的种(peptoclostridium sp.))、拟杆菌属(bacteroides)(拟杆菌属的种(bacteroides sp.))、巨单胞菌属(megamonas)(巨单胞菌属的种(megamonas sp.))以及柯林斯氏菌属(collinsella)(柯林斯氏菌属的种(collinsella sp.))。在一些情况下，该方法还包括检测和/或量化与序列seq id no:29、和/或13、和/或15、和/或22、和/或26、和/或10和/或27的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
[0080]
前面段落中讨论的细菌分类群对幼犬期的各个阶段显示出最高的特异性，如上文所定义，因此可以有利地用于本公开的方法中。因此，在一些实施方案中，本公开的方法包括检测和/或量化下述属的所有物种：布劳特氏[瘤胃球菌](blautia[ruminococcus])(活泼布劳氏[瘤胃球菌]种(blautia[ruminococcus]gnavus))、埃希氏菌属/志贺氏菌属(escherichia/shigella)(埃希氏菌属的种/志贺氏菌属的种(escherichia spp./shigella spp.))、黄杆菌属(flavonifractor)(黄杆菌属的种(flavonifractor spp.))、罗姆布茨菌属(romboutsia)(罗姆布茨菌属的种(romboutsia spp.))。它们可以进一步包括检测和/或量化艰难梭菌属(peptoclostridium)(艰难梭菌属的种(peptoclostridium spp.))、拟杆菌属(bacteroides)(拟杆菌属的种(bacteroides spp.))、巨单胞菌属(megamonas)(巨单胞菌属的种(megamonas spp.))以及柯林斯氏菌属(collinsella)(柯林斯氏菌属的种(collinsella spp.))。这些实施方案可包括检测和/或量化与seq id no:20、16、17、29和13的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的所有序列。在进一步的实施方案中，该方法进一步包括检测和/或量
化与seq id no:15、22、26、10和27的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的所有序列。
[0081]
当前公开的主题进一步确定了巨单胞菌属的种(megamonas sp.)、布劳特氏菌属(blautia)以及平野梭菌(clostridium hiranonsis)的增加与幼犬的健康微生物组有关。此外，目前公开的主题已经发现，异杆菌属(allobaculum)、消化链球菌属(peptostreptococcus)以及双歧杆菌属(bifidobacterium)分类群的增加与成年微生物组有关。
[0082]
如图10(表1.3)所示，当前公开的主题发现如果检测和/或量化多于一种细菌分类群，则特异性增加。因此，在一些实施方案中，检测和/或量化两种或更多种细菌分类群(例如细菌属和/或细菌种)。该方法的特异性随着更多细菌分类群被检测和/或量化而增加。因此，在一些实施方案中，本公开的方法可以包括检测图10(表1.3)中描述的5种或更多种、15种或更多种、20种或更多种、或25种或更多种细菌分类群。在一些实施方案中，该方法包括检测图10(表1.3)中鉴定的所有细菌分类群或所有细菌属或细菌种。例如，在一些实施方案中，该方法包括检测与seq id no：3
‑
31的序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。
[0083]
当检测到与本文鉴定的16s rdna序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的序列时，该序列可来自同一物种或密切相关物种的细菌。例如，当序列与seq id no:x的序列具有约95％的同一性时，该序列将优选源自与获得seq id no:x的细菌相同属的细菌或优选来自同种。例如，在seq id no:32的情况下，细菌将优选属于梭菌属，并且最优选属于产气荚膜梭菌属的种。
[0084]
犬科动物
[0085]
本公开的方法可用于确定犬科动物的微生物组年龄。该属包括家犬(canis lupus familiaris)、狼、郊狼、狐狸、豺、野狗，并且本公开可用于所有这些动物。在一些实施方案中，受试者是家犬，在本技术中简称为狗。
[0086]
此外，在一些实施方案中，犬科动物是健康的。如本技术所用，“健康的”是指尚未被诊断患有已知与微生物组有关的疾病的犬科动物。此类疾病的实例包括但不限于慢性和急性腹泻肠易激综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病和炎症性肠病。在特定的实施方案中，犬科动物没有患生态失调。
[0087]
本公开内容的方法的一个优点是它们允许技术人员确定犬科动物的微生物组生物学年龄状态是否对应于其生理年龄或实足年龄。例如，技术人员可以确定成年狗是否具有代表成年生命阶段健康狗的微生物组，并在微生物组年龄或生命阶段与实际年龄不一致的情况下采取适当的步骤。
[0088]
有许多不同品种的家犬，它们表现出不同的习性。不同的品种也有不同的预期寿命，较小的狗品种通常比大型品种预期要活得更长。因此，不同品种在其生命中的不同时间点被认为是青年犬、成年犬、较老年犬或老年犬。下面的表1.0中提供了不同生命阶段的总结。
[0089]
表1.0
[0090][0091]
玩具型、小型、中型和大型品种之间的区别是本领域已知的。特别地，玩具品种包括不同的品种，包括但不限于阿芬平猎犬、澳洲丝毛梗、比熊犬、博洛尼亚犬、查尔斯王骑士猎犬、吉娃娃、中国冠毛犬、棉花面纱犬、英国玩具梗、布鲁塞尔格里芬犬、哈瓦那犬、意大利灵缇犬、日本狮子犬、查理士王小猎犬、罗成犬(小狮子犬)、马耳他犬、迷你杜宾犬、巴比伦犬、北京犬、博美犬、哈巴狗、俄罗斯玩具犬和约克夏犬。
[0092]
小型品种平均比玩具品种大，平均体重可达10公斤左右。非限制性示例品种包括法国斗牛犬、比格犬、腊肠犬、彭布罗克威尔士柯基犬、迷你雪纳瑞犬、骑士查理王猎犬、狮子狗和波士顿梗犬。
[0093]
中型犬种的平均体重约为11公斤至约26公斤。这些犬种包括但不限于斗牛犬、可卡犬、喜乐蒂牧羊犬、边境牧羊犬、巴吉度猎犬、哈士奇犬和达尔马提亚犬。
[0094]
大型品种是指平均体重至少约为27公斤的品种。非限制性例子包括大丹犬、那不勒斯獒犬、苏格兰猎鹿犬、波尔多犬、纽芬兰犬、英国獒犬、圣伯纳德犬、莱昂伯格犬和爱尔兰猎狼犬。
[0095]
杂种品种一般可根据体重分为玩具狗、小型狗、中型狗和大型狗。
[0096]
样品
[0097]
本公开内容的方法通常使用粪便样品或来自犬科动物胃肠腔的样品。粪便样品很方便，因为它们的收集是非侵入性的，并且还允许在一段时间内轻松重复采样个体。然而，其他样品也可以与本文公开的方法一起使用，包括但不限于回肠、空肠、十二指肠样品和结肠样品。
[0098]
在一些实施方案中，样品是新鲜样品。在进一步的实施方案中，在用于本公开的方法中之前，将样品冷冻或通过其他方式稳定，例如添加到保存缓冲液中，或通过使用诸如冷冻干燥的方法脱水。
[0099]
在本公开内容的方法中使用之前，在一些实施方案中，样品被处理以提取dna。分离dna的方法是本领域公知的，例如参考文献[8]。合适的方法包括，例如，qiaamp power faecal dna试剂盒(qiagen)。
[0100]
改变微生物组
[0101]
在一些实施方案中，本公开内容的方法可以包括改变微生物组组成的进一步步骤。微生物组的组成可以通过向犬科动物施用能够改变微生物组组成的膳食改变、功能性食品、补充剂或营养品或药物组合物来改变。此类功能性食品、营养品、活的生物治疗产品(lbp)和药物组合物是本领域众所周知的并且包含细菌[9]。它们可以包含选自由下述组成的组的单个细菌物种：双歧杆菌属的种(bifidobacterium sp.)，例如动物双歧杆菌(b.animalis)(例如动物双歧杆菌动物亚种(b.animalis subsp.animalis)或动物双歧杆
菌乳亚种(b.animalis subsp.lactis))、两歧双歧杆菌(b.bifidum)、短双岐杆菌(b.breve)、长双歧杆菌(b.longum)(例如长双歧杆菌婴儿亚种(b.longum subsp.infantis)或长双歧杆菌长亚种(b.longum subsp.longum))、假长型双歧杆菌(b.pseudolongum)、青春型双岐杆菌(b.adolescentis)、链状双歧杆菌(b.catenulatum)或假链状双歧杆菌(b.pseudocatanulatum)；乳杆菌属(lactobacillus)的单一细菌种类，例如嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、胃窦乳杆菌(l.antri)、短乳杆菌(l.brevis)、干酪乳杆菌(l.casei)、人阴道乳杆菌(l.coleohominis)、卷曲乳杆菌(l.crispatus)、弯曲乳杆菌(l.curvatus)、发酵乳杆菌(l.fermentum)、格氏乳杆菌(l.gasseri)、约氏乳杆菌(l.johnsonii)、粘膜乳杆菌(l.mucosae)、戊糖乳杆菌(l.pentosus)、植物乳杆菌(l.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、清酒乳杆菌(l.sakei)、唾液乳杆菌(l.salivarius)、类干酪乳杆菌(l.paracasei)、北里乳杆菌(l.kisonensis)、类消化乳杆菌(l.paralimentarius)、恶味乳杆菌(l.perolens)、蜜蜂乳杆菌(l.apis)、加纳乳杆菌(l.ghanensis)、糊精乳杆菌(l.dextrinicus)、深圳乳杆菌(l.shenzenensis)、哈尔滨乳杆菌(l.harbinensis)；或片球菌属(pediococcus)的单一细菌种类，例如小片球菌(p.parvulus)、洛丽片球菌(p.lolii)、乳酸片球菌(p.acidilactici)、阿根廷片球菌(p.argentinicus)、克氏片球菌(p.claussenii)、戊糖片球菌(p.pentosaceus)或斯氏片球菌(p.stilesii)；或肠球菌属(enterococcus)的相似物种，例如粪肠球菌(e.faecium)，或芽孢杆菌属(bacillus)物种例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、印度芽孢杆菌(b.indicus)或克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)。此外，可以使用这些和其他细菌物质的组合。施用给犬科动物的饮食改变、功能性食品、补充剂、营养组合物或药物组合物的量可以是有效影响微生物组组成变化的量。
[0102]
在犬科动物的微生物组的年龄与其实际年龄不一致的情况下，可以执行改变微生物组组成的另外的步骤。例如，本公开内容的方法可以揭示成年狗具有代表较老年狗或老年狗的微生物组组成和多样性。如上所讨论，与成年微生物组相关的特征被认为是最健康的微生物组特征，且因此在这些情况下，较老年狗非常需要改变饮食和/或施用功能性食物、营养品、lbp或药物组合物以将微生物组转变回成年微生物组的组成/状态。
[0103]
类似地，在其他实施方案中，可能需要改变微生物组，使得微生物组的生物学年龄状态与犬科动物的实际年龄不一致。例如，处于较老年或老年生命阶段的患有复发性腹泻的较老的狗可以受益于接受饮食改变、功能性食物、营养品、lbp或药物组合物，以将微生物组转变成代表成年狗的微生物组。
[0104]
本公开内容的方法还可用于评估如上所述的治疗的成功。为此，犬科动物可以接受能够改变微生物组组成的饮食改变、功能食品、补充剂、lbp、营养品或药物组合物，或运动/身体活动方案。在施用通过营养或锻炼的治疗后(例如在约1天、2天、5天、1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月等之后)，可以使用本公开内容的任何方法评估微生物组的年龄。在某些实施方案中，在施用饮食改变、功能性食物、补充剂、lbp、营养品或药物组合物，或运动/身体活动方案之前和之后确定微生物组的生物学年龄状态。
[0105]
监控
[0106]
在一些实施方案中，本公开内容的方法执行一次以确定犬科动物的微生物组状态
并与按时间计算的年龄比较。本公开内容的方法还可以被执行不止一次，例如两次、三次、四次、五次、六次、七次或超过七次。这允许随着时间的推移监测微生物组的年龄。例如，若犬科动物正在接受治疗以改变微生物组或处于代表生命阶段之间的转变的年龄以追踪未来进行干预(如治疗)的需要，这可能很有用。第一次执行该方法时，确定微生物组的年龄，并在干预(如治疗)诸如饮食改变或施用补充剂、功能性食物营养品或药物组合物，或运动/身体活动方案后，重复该方法以评估组成或干预(如治疗)对微生物组的影响。也可以在犬科动物接受治疗后第一次确定微生物组的年龄状态，然后重复该方法以评估微生物组的生物学年龄状态是否发生变化。
[0107]
本文所述的方法可相隔几天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月或超过36个月重复。
[0108]
治疗
[0109]
在一些实施方案中，本公开内容的方法还可涉及用于治疗犬科动物的方法。犬科动物可以具有与其实际年龄不一致的微生物组年龄，如成年犬具有较老的或老年的犬的微生物组组成和多样性。在其他实施方案中，本公开内容的方法可以涉及用于治疗犬科动物以改变犬科动物的微生物组的年龄至低于犬科动物的实际年龄的方法。用于治疗的这些方法包括(i)通过根据本文公开的任何方法确定微生物组的年龄来确定犬科动物需要治疗，和(ii)向犬科动物施用能够改变微生物组的组成的如本文公开的饮食改变、功能性食物、补充剂、营养品或药物组合物。施用给犬科动物的饮食改变、功能性食物、补充剂、营养组合物或药物组合物的量可以是有效影响微生物组组成的改变或有效改善与具有不健康微生物组状态的犬科动物相关的任何症状的量。任选地，在一些实施方案中，该方法进一步包括在施用饮食改变、功能性食物、补充剂、营养品或药物组合物后确定微生物组年龄以评估治疗的有效性。
[0110]
概述
[0111]
本说明书中使用的术语在本领域中、在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们的普通含义。某些术语在下文或说明书中的其他地方讨论，以在描述本发明的方法和组合物以及如何制备和使用它们时为从业者提供额外的指导。
[0112]
除非另有说明，否则本公开内容的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，参考文献[10
‑
17]等。
[0113]
提及两个核苷酸序列之间的百分比序列同一性意味着，当比对时，在比较两个序列时该百分比的核苷酸是相同的。这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如在参考文献[18]的第7.7.18节中描述的那些。优选的比对是使用下述确定的：blast(基本局部比对搜索工具)算法或smith
‑
waterman同源性搜索算法，使用仿射间隙搜索且间隙开放罚分为12，间隙扩展罚分为2，blosum矩阵为62。smith
‑
waterman同源搜索算法在参考文献[19]中公开。比对可以在整个参考序列上进行，即它可以在本文公开的序列的100％长度内进行。
[0114]
定义
[0115]
如本文所用的，当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，词汇“一个(a)”或“一个(an)”的使用可以表示“一个”，但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或
超过一个”的含义一致。更进一步，术语“具有”、“包含(containing)”和“包含(comprising)”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。此外，术语“包括”涵盖“包含”以及“由
……
组成”，例如，“包括”x的组合物可仅由x组成或可包括额外的东西，例如x y。
[0116]
术语“约”或“近似”是指在由本领域技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准偏差内。可替代地，“约”可以表示给定值的最多20％、或者可替代地最多10％、或者可替代地最多5％、或者仍然可替代地最多1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，该术语可表示在一个数量级内，优选在一个值的5倍以内，更优选在2倍以内。在某些实施方案中，与数值x相关的术语“约”是可选的并且意味着例如x
±
10％。
[0117]
术语“有效治疗”或物质的“有效量”是指足以产生有益或期望结果(包括临床结果)的治疗或物质的量，并且因此，“有效治疗”或“有效量”取决于其应用的上下文。在施用组合物(例如，饮食改变、功能性食物、补充剂、营养组合物或药物组合物)以改变具有不健康微生物组的犬科动物的微生物组组成的情况下，有效量为足以使微生物组的健康状态恢复到健康状态的量，这是根据本文公开的方法之一确定的。在某些实施方案中，如本文所述的有效治疗还可包括以足以减少与不健康微生物组相关的任何症状的量施用治疗。减少可以是约0.01％、约0.1％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约99％的不健康微生物组的症状的严重程度减少。有效量可以一次或多次施用。此处描述的有效治疗的可能性是治疗有效的概率，即足以改变微生物组，或治疗或改善消化紊乱和/或炎症，以及减轻症状。
[0118]
如本文所用的，并且如本领域所熟知，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果，包括临床结果的方法。出于本主题的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻或改善、病症程度的减轻、病症的稳定(即不恶化)状态、预防疾病、疾病进展的延迟或减缓，和/或疾病状态的改善或缓解。在某些实施方案中，降低可以是约0.01％、约0.1％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约99％的并发症或症状的严重程度降低。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。
[0119]“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。必要时，本公开的定义中可以省略“基本上”一词。
[0120]
除非特别说明，包括多个步骤的过程或方法可以包括在方法开始或结束时的附加步骤，或者可以包括附加的中间步骤。此外，如果合适，可以组合、省略或以替代顺序执行步骤。
[0121]
本文描述了本公开内容的方法的各种实施方案。可以理解的是，每个实施方案中指定的特征可以与其他指定的特征组合以提供进一步的实施方案。特别地，在此强调为合适的、典型的或优选的实施方案可以彼此组合(除非它们是相互排斥的)。
[0122]
实施例
[0123]
通过参考以下实施例将更好地理解当前公开的主题，该实施例作为本发明的示例提供，而不是作为限制。
[0124]
实施例1：检测狗(幼犬)粪便微生物组或幼龄阶段微生物群的生物学年龄的方法
[0125]
粪便微生物群的数据是通过分析39只幼犬的、在12个时间点采集的新鲜产生的粪便样品中的微生物群获得的。这些时间点分组为：幼犬产后早期(2、4、6、8、10、12天)；幼犬中期(断奶期间)17、24和31天，以及幼犬(断奶后)后期(快速生长期)后期38、45和52天。
[0126]
方法
[0127]
在使用引物序列(319f:caagcagaagacggcatacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct(seq id no:1)和806r:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct(seq id no:2)对v4
‑
v6区域进行illumina测序后，得到的dna序列以98％同一性被聚类，然后评估丰富的分类群(表示>0.001的总序列)的相对比例。重要性得分是使用2000个随机森林计算的，每个森林有2000棵树，使用每棵树的默认变量数(变量数的平方根)和排列重要性得分计算。从这1000个随机森林中计算出每个otu的平均等级，其中1是最重要的，此外还有标准差、最大和最小排名。
[0128]
还通过将随机森林拟合到具有连续更多otu(按重要性顺序)的数据来计算正预测值和特异性。使用r版本3.5.1和ranger库进行分析。
[0129]
该方法涉及通过诸如qiaamp power faecal dna试剂盒(qiagen)等方法从新鲜产生的粪便样品中提取dna，随后使用分子生物学技术评估下述(表1.1和2.1)细菌分类群组合的检测率和丰度。生物体的组合和丰度允许检测微生物组的生物学年龄，并评估在动物粪便中观察到的微生物组成分是否描述了相对于动物实际年龄的未成熟或比预期更老的微生物组。在提取dna后，并通过16s rdna扩增子、鸟枪法、宏基因组、illumina、纳米孔或其他dna测序技术等技术对粪便dna进行dna测序，并评估描述表1.1中生物体的序列或与表1.2中的序列具有95％以内同一性的dna序列的相对丰度。简而言之，从测试样品获得的序列数据被聚类成具有98％
‑
100％同一性的序列组，然后使用来自代表>0.001％总序列的聚类的参考序列来1)通过数据库同源物分配分类法、基因功能或通过dna数据库(例如greengenes或silva或ncbi非冗余核苷酸序列数据库)的同源性搜索来确定生物标记的性质，以便与数据库中保存的物种的已知dna序列进行比较或2)与下表1.2中给出的dna序列进行比较。
[0130]
然后用表1.2中描述的组合中鉴定的生物体、序列或生物标记的数量和丰度以它们最适合的组来描述样品的生物学年龄。
[0131]
结果
[0132]
重要性评分用于对细菌分类群(otu)进行排序，以确定它们在将样品分配到定义为早期生命、断奶期间或幼犬后期(快速生长期)的正确研究组方面具有一致性(表1.1和图1)。还计算了模型中使用的otu数量按从数据分析得出的重要性顺序连续增加的灵敏度和正预测值(图2)。在大约28个otu处达到了灵敏度和阳性预测的平稳期。因此，前28个otu被确定为最适合定义幼犬期微生物群的生物学年龄(表1.1)。
[0133]
表1.1：细菌分类群(otu)按重要性评分排序，这些评分描述它们在将样品分配到适当研究组(早期、断奶期间或幼犬后期(快速生长期))的一致性。p＝位置。
[0134]
[0135][0136]
然后用从表1.2中描述的组合中鉴定的生物体、序列或生物标记的数量和丰度以它们最适合的组来描述样品的生物学年龄。
[0137]
表1.2：dna序列按重要性评分排序，这些评分描述了它们在将样品分配到适当研究组(早期、断奶期间或幼犬期后期(快速生长期)时的一致性)。
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146][0147]
图10(表1.3)提供了基于otu的相对丰度的、按重要性排序的微生物组分配给年龄组的累积预测分数。p＝位置
[0148]
实施例2
‑
一种检测成年和成熟生命阶段微生物组生物学年龄的方法
[0149]
在41只年龄在3.8至15.0岁之间的成年比格犬中分析了粪便微生物群。研究群组包括分配到成年组(3.8至6.2岁)的13只动物、分配到较老年组(8.2至12.9岁)的20只狗和分配到老年组(14.6至15.0岁)的8只狗。
[0150]
方法
[0151]
在从粪便样品中提取dna并使用dna寡核苷酸引物(序列319f:caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct和806r:aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct)对v4
‑
v6区域进行illumina测序后，得到的dna序列以98％同一性被聚类，并且然后评估丰富的分类群(表示>0.001的总序列)以确定它们的相对比例。重要性得分是使用2000个随机森林计算的，每个森林有2000棵树，使用每棵树的默认变量数(变量数的平方根)和排列重要性得分计算。从这2000个随机森林中计算出每个otu的平均排名(位置[p])，其中1在确定样品适合年龄时最重要(图3a和图3b)。
[0152]
还通过将随机森林拟合到具有按重要性顺序采集的连续更多otu的数据来计算正预测值、特异性和准确性(图4)。使用r版本3.5.1和ranger库进行分析。
[0153]
该方法涉及通过诸如qiaamp power faecal dna试剂盒(qiagen)等方法从新鲜产生的粪便样品中提取dna，且随后使用分子生物学技术评估下述(表2.1和2.2)细菌分类群组合的检测率和丰度。检测到的生物体的组合和丰度允许评估微生物组的生物学年龄，并评估在动物粪便中观察到的微生物组成分是否描述了相对于动物实际年龄的未成熟或比预期更老的微生物组。在dna提取后，并通过16s rdna扩增子、鸟枪法、宏基因组、illumina、纳米孔或其他dna测序技术等技术对dna进行和测序，并评估描述表1中生物体的序列或与表2.2中的序列具有95％以内同一性的dna序列的相对丰度。简而言之，从测试样品获得的序列数据被聚类成具有98％
‑
100％同一性的序列组，然后使用来自代表>0.001％总序列的聚类的参考序列来1)通过数据库同源物分配分类法、基因功能或通过dna数据库(例如greengenes或silva或ncbi非冗余核苷酸序列数据库)的同源性搜索来确定生物标记的性质，以便与数据库中保存的物种的已知dna序列进行比较或2)与下表2.2中给出的dna序列进行比较。
[0154]
然后用从表2.2中描述的组合中鉴定的生物体、序列或生物标记的数量和丰度以它们最适合的组来描述样品的生物学年龄
[0155]
表2.1：细菌分类群(otu)按重要性评分排序，这些评分描述了它们在将样品分配给适当年龄组成年的(3.8
‑
6.2岁)、20只狗分配给较老的组(8.2
‑
12.9岁)和8只狗分配给老年组(14.6
‑
15.0岁)时的一致性。p＝位置
[0156]
[0157]
[0158][0159]
表2.2：dna序列按重要性评分排序，这些评分描述它们在将样品分配到狗的适当生命阶段组(成年组、较老的组和老年组)时的一致性。s＝seq id no。
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172][0173]
实施例3
‑
一种检测微生物组生物学年龄的方法(数据来自对成年的犬、较老的犬和老年的犬的研究)
[0174]
在41只年龄在3.8至15.0岁之间的成年比格犬队列中分析了粪便微生物群。研究队列包括分配到成年的组(3.8
‑
6.2岁)的13只动物、分配到较老的组(8.2
‑
12.9岁)的20只狗和分配到老年的组(14.6
‑
15.0岁)的8只狗。
[0175]
方法
[0176]
在从粪便样品中提取dna并使用dna寡核苷酸引物(序列319f:caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct和806r:aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct)对v4
‑
v6区域进行illumina测序后，得到的dna序列以98％同一性被聚类，然后评估丰富的分类群(表示>0.001的总序列)以确定它们的相对比例。针对样品与存在的otu(细菌分类群)的检测和丰度之间的相关性使用偏最小二乘判别分析(plsda)分析了细菌分类群数据。
[0177]
方法
[0178]
该方法涉及使用以下细菌分类群的组合来检测微生物组的生物学年龄。dna测序后，从测试样品获得的相对丰度数据与对照数据集聚类，且样品所在的聚类(图6)描述了样品的生物学年龄。图6中给出了支持检测微生物组与对照样品相比的生物年龄的示例分析。该图展示了犬科动物老年微生物组样品的分离。
[0179]
表3.1：在偏最小二乘分析中，具有投影中变量重要性(vip)得分>1的细菌分类群(otu)有助于分离生命阶段组。p＝plsda顺序
[0180]
分类群也可以由以下dna序列描述(涵盖与以下序列具有100％至98％相似性/同一性的这些dna序列的任何生物体)。
[0181]
表3.2.在偏最小二乘分析中对分离生命阶段组最有影响的细菌分类群的dna序列。s＝序列号
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186][0187]
实施例4：幼犬微生物群布劳特氏菌属的种(blautia spp.)、平野梭菌(clostridium hiranonsis)和巨单胞菌属(megamonas)
[0188]
最近对幼犬粪便微生物群的一项研究描述了在健康幼犬生命第一年粪便中检测到的细菌群落的变化。在健康幼犬生命第一年的粪便中检测到的微生物群表明了在断奶前
的时段内最常见的细菌类型属于变形菌门(图7a和图7b)。断奶后，检测到来自厚壁菌门的细菌最丰富。断奶后细菌群落的多样性也增加了。
[0189]
幼犬微生物群的初始元素可能来自母体源，且包括金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)和长双歧杆菌(bifidobacterium longum)(已知它们能够利用母体乳汁中存在的寡糖)以及狭义梭菌1属的种(clostridium sensu stricto 1sp.)等。这些分类群的存在表明它们能够利用新生儿肠道的环境，考虑到可以从母乳中获得营养来源，并且可以耐受各种环境应激物例如不利的ph值。
[0190]
断奶后，许多物种在新生儿肠道中变得更加普遍。最显著的示例是巨单胞菌属的种(megamonas sp.)和布劳特氏菌属的种(blautia sp.)，两者都是复杂碳水化合物的多产发酵剂和短链脂肪酸的产生者。一般而言，这些物种与健康的肠道微生物群有关，因为它们会产生短链脂肪酸，并且它们在腹泻犬[20,21]和犬科动物ibd[22]中的丰度降低。在此之后，观察到平野梭菌(clostridium hiranonsis)的大量持续增加，使得从第52天开始直到第360天的最终采样点，它成为所有采样点中最丰富的分类群。该物种还与健康的肠道微生物群有关，参与胆汁酸的解偶联，且在犬科动物慢性肠病的情况下减少[22]，并且据报道具有通过次级胆汁酸抑制病原体艰难梭菌(clostridium difficile)的能力[23]。总的来说，断奶后布劳特氏菌属的种(blautia spp.)、平野梭菌(clostridium hiranonsis)和巨单胞菌属的种(megamonas spp.)的丰度增加表明幼犬和成年犬的微生物群健康。
[0191]
实施例5：异杆菌属(allobacullum)、消化链球菌属(peptostreptococcus)和核心双歧杆菌(core bifidobacterium)、乳杆菌属(lactobacillus)以及肠球菌属(enterococcus)。
[0192]
在一项针对因胃肠道失调的临床症状而接受甲硝唑预防疗程的22只狗的研究中，在治疗之前、期间和之后评估了粪便微生物群。该研究旨在评估甲硝唑治疗狗粪便微生物群的程度、变异性和寿命。甲硝唑治疗与队列中腹泻的减少有关。通过16s rrna基因扩增子测序对粪便微生物群的评估显示，在治疗期间和治疗后紧接着，香农多样性降低并改变了群落组成。虽然动物接受了甲硝唑，但在整个队列中观察到核心微生物群，该核心微生物群由分配给乳酸菌(双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳杆菌属(lactobacillus)和肠球菌属(enterococcus))的otu(序列类型)主导。这种代表与甲硝唑治疗相关的生物体的核心微生物群被富集，用于分配给双歧杆菌属、乳杆菌属和肠球菌属的操作分类单元。在停止治疗后4周左右，粪便微生物群的多样性和种类丰富度增加到治疗后的稳定水平。微生物多样性的增加与个体微生物群落组成内的明显进化有关，其特征在于otu和属分类学水平上的特征一致。甲硝唑治疗与微生物多样性减少、核心微生物群的建立和保守特征相关，这些特征表明在重建个体微生物多样性期间，肠道微生物群落组成的进化具有一致的层次结构。与甲硝唑治疗相关的核心微生物群因分配给乳酸菌的序列而富集，这些序列暗示着先天抵抗力和执行对肠道微生物组功能必不可少的活动的能力。治疗期间和治疗后紧接着的微生物群组成由来自乳杆菌属、双歧杆菌属和肠球菌属的乳酸菌主导。因此，这些被认为与人类胃肠道健康相关的菌属的相对丰度的增加可能是导致生态失调的临床解决的原因，并且根据它们在整个队列中的一致表现推断，可以代表天然抗甲硝唑的健康的核心微生物群，并且能够执行微生物组的功能并恢复肠道微生物群和生理机能。在完成抗生素预防后的1
‑
2周内，代表属发生了明显的变化，分配给异杆菌属(allobaculum)、梭菌属(clostridium)和消化
链球菌属的种(peptostreptococcus spp.)的序列类型丰度增加，并且分配给布劳特氏菌属(blautia)的otu也增加。因此，这些细菌形成了第一个重新定殖肠道的生物体。
[0193]
通过对堆积图的目视评估，乳酸菌占主导地位的治疗和第一次恢复时间点(t＝2和t＝3)之后是在治疗完成前后续时间点。消化链球菌属(peptostreptococcus)和异杆菌属(allobaculum)，在恢复到类似于基线阶段观察到的复杂性之前(图8a
‑
图8h)。这个otu子集最好地描述了那些在推动将样品分离成与治疗阶段相关的聚类最有影响的，该分离基于它们在队列中粪便样品中的相对丰度概况。该子集包括分配给异杆菌属的9个otu，分配给乳杆菌属的3个otu，分配给s24
‑
7的3个otu，以及来自克里斯滕森菌属(christensenella)、消化链球菌属(peptostreptococcus)、罗姆布茨菌属(romboutsia)、摩根氏菌属(morganella)、阿德勒克罗伊茨菌/非消化糖杆菌属(adlercreutzi/asaccharobacter)、肠球菌属(enterococcus)和丁酸球菌属(butyricicoccus)的单个otu以及归入瘤胃球菌科(ruminococcaceae)的2个otu(图9和图13(表4))。在甲硝唑治疗期间和之后紧接着，三个主要otu的相对丰度对聚类有影响，这些都归于乳杆菌属(lactobacillus)。此外，在不到30％的样品中检测到的另外两个较小的otu也影响了样品对抗生素的聚类，以及基于vip评分的抗生素治疗后2
‑
3天的首次采样。这些otu被归入肠球菌属(enterococcus)和摩根氏菌属(morganella)(肠杆菌科(enterobacteriaceae family))。在治疗后的前两周内对早期恢复阶段有影响的第二聚类中的所有otu普遍存在，在超过群体中的30％被检测到。在抗生素治疗完成后的早期恢复阶段，这些驱动样品聚类的otu的分类学分配描述了来自瘤胃球菌科(ruminococcaceae)和异杆菌属(allobaculum)的2个otu，以及来自爱格士氏菌科(eggerthellaceae)丁酸球菌属(butyricicoccus)、梭杆菌属(fusobacterium)、罗姆布茨菌属(romboutsia)和消化链球菌属(peptostreptococcus)的各一个。最后，由plsda vip评分定义的第三个聚类包含抗生素治疗完成后28天的基线和治疗后阶段的样品。otu在该聚类中以增加的丰度表示，并且普遍存在于超过30％的样品集，包括4种丹毒丝菌属的种(erysipelotrichaceae sp.)，分配给异杆菌属(allobaculum)和来自s24
‑
7组的2个otu，可能是muri菌属的种(muribaculaceae sp.)。在不到30％的样品中检测到另一组较低流行的otu，包括分配给丹毒丝菌科(erysipelotrichaceae)、异杆菌属(allobaculum)/ileibacterium的3个otu，以及分配给s24
‑
7组和克里斯滕森菌属(christensenella)的各一个otu。因此，聚群1和聚群2(表4)代表了基本核心微生物群，其中包含与恢复临床健康相关的健康相关物种。
[0194]
图8的详细说明
[0195]
队列中八只代表性狗的堆积条形图展示了每个采样点丰富的分类群的分布。显示了由16s rrna基因v4区域的dna序列确定的属水平的系统发育分配。丰度表示为相对于样品总序列的比例。在green genes数据库(版本12_10)中未分配最近命中的序列被整理到
‘
未知’组中；用于可视化的低丰度序列和代表样品中少于0.001％序列的序列分别被分配到其他组和稀有组。治疗前阶段：t＝1
–
基线；治疗阶段：t＝2
–
施用抗生素；恢复阶段：t＝3
–
第1周早期；t＝4
–
第1周后期；t＝5
–
第2周；t＝6
–
第4周；t＝7
–
第6周；t＝8
–
第8周；t＝9
–
第3个月；t＝10
–
第4个月；t＝11
–
第5个月；t＝12
–
第6个月。整个研究中最丰富的八个分类群的属名称。观察到的由于低丰度而无法表达的分类群被归类为其他；那些不常见的被称为稀有；未分类的属是未知的。
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[0222]
尽管已经详细描述了当前公开的主题及其优点，但是应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本技术的精神和范围的情况下，可以在本技术中进行各种改变、替换和变更。此外，本技术的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方案。作为本领域普通技术人员将容易地从当前公开的主题理解，目前存在的或以后将开发的与本文公开的对应实施方式执行基本相同的功能或实现基本相同的结果的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤，可以根据当前公开的主题予以利用。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤包括在它们的范围内。
[0223]
对于本技术通篇引用的任何专利、专利申请、出版物、产品描述和协议，所有这些的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本技术。