1.本发明涉及一种组合物，含有或由(a)泊洛沙胺；和(b)(i)逆转录病毒载体和或(ii)脊椎动物细胞组成。2.本文中引用了大量文件，包括专利申请及制造商手册。这些文件的披露虽然不被认为与本发明的可专利性有关，但在此以整体引用的方式纳入本发明中。更具体的，所有引用的文件都通过相同程度的引用来纳入，就像每个单独的文件都明确地、单独地指明是通过引用来纳入的一样。
背景技术：
：：3.对于大部分细胞，特别是原代细胞的遗传修饰，优选的方法是通过病毒载体的介导转导。尤其是，使用逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。具有水泡性口炎病毒(vsv‑g)的糖蛋白的假型慢病毒(lv)载体稳定地整合到增殖和非增殖细胞的染色体中(布克林斯基(bukrinsky)等，1993；伯恩斯(burns)等，1993；芬克(funke)等，2008)。lv的安全特性得到了改进，如第三代分裂基因组慢病毒的包装设计和转移载体3'长末端重复序列(ltr)的缺失等，使lv成为许多研究者青睐的系统(杜尔(dull)等，1998)。经转导的慢病毒细胞几乎不显示应激信号通路的激活或任何其他表型改变，因此有望在基因治疗和免疫治疗中得到广泛应用(格鲁伯(gruber)等，2000；鲁阿斯(rouas)，2002)。4.目前而言，在研究及临床实验中，涉及将lv基因有效传递到靶细胞的转导条件存在很大差异(米林顿(millington)等，2009)。众所周知，正常的淋巴细胞和原发性肿瘤，以及淋巴系的细胞系难以有效转导(阿纳斯塔索夫(anastasov)等，2009)(阿纳斯塔索夫(anastasov)等，2010)。为了大规模转导病人细胞，向原代细胞的高基因转移率和能够产生高滴度病毒颗粒的能力是临床试验的先决条件。由于大规模生产这些病毒是十分复杂和昂贵的(乌姆(wurm)等，2010)，对慢病毒转导率的每一项改进都将导致对病毒产量需求的减少，并将进一步有助于降低临床试验的成本。5.可以通过各种不同的策略实现更高的基因转移效率：通过超速离心法(伯恩斯(burns)等，1993)或超滤法(阿纳斯塔索夫(anastasov)等，2009)浓缩病毒上清液也是一种可能提高基因转移效率的方法。其他被频繁使用的、用于提高基因转移率的方法为添加不同的试剂，例如聚阳离子或阳离子脂质体。但是，大部分这些辅助疗法对于细胞而言是有毒的，限制了其用于原发灶的敏感的靶细胞(乌姆(wurm)等，2010)。在其他选项中，凝聚胺(一种线性聚阳离子聚合物)在大范围的靶细胞中提高了基因转导率，成为了本领域中一种主流的转导辅助试剂(卡斯特罗(castro)等，1988；海塞(hesse)，埃贝桑(ebbesen)和克里斯滕森(kristensen)，1978)。可惜，凝聚胺仅可作用于很短的应用时间，以及低于10ug/ml的浓度(取决于靶细胞的类型)，可用于避免细胞毒副作用和/或跨膜电位的显著调节(奥宾，尔德和帕特森(aubin,weinfeld,andpaterson)，1988)，这限制了其在敏感细胞，例如造血细胞中的使用。6.另一种提高病毒转导效率的常规方法为使用纤维连接蛋白，能够促进慢病毒和靶细胞共定位的重组人纤维连接蛋白片段(李(lee)等，2009)。7.vectofusin‑1是一种相对较新的病毒转导增强子。它源于lha4肽族，是一种富含组氨酸的阳离子两亲性肽(弗纳德(fenard)等，2013)。它的作用是促进病毒和细胞膜之间的贴壁和融合，并被证明可以改善人类造血干细胞和祖细胞(hspcs)的转导(弗纳德(fenard)等，2013；因戈劳(ingrao)等，2014)。8.进一步的，将病毒添加到细胞后，直接离心接种(通常称为“旋转接种(spinoculation)”)被转导的细胞也可以加强转导(郭(guo)等，2011)。研究表明，离心诱发动态肌动蛋白和丝切蛋白的活性，导致hiv‑1受体和cd4和cxcr4共同受体的上调(郭(guo)等，2011)。旋转接种也可以与转导增强子共同使用以进一步增强转导效率。9.然而，另一种将治疗相关的物质传递到细胞的方法是将其包装成生物大分子或聚合物。对于如细胞外因子的蛋白质，已被证明将其包装成脂质体或磷脂和胆固醇可以增强稳定性和活性，从而提高在靶细胞上的生物活性(莫雷尔(morrell)等，2008；蒂伊叙兹(tüysüz)等，2017)。核酸也可以通过直线的(卡巴诺夫·朱和阿拉霍夫(kabanov,zhu,andalakhov)2005；勒米厄和盖琳(lemieuxandguerin)2000；马哈詹(mahajan)等，2017；宋(song)等，2014)和支链的两亲性共聚物实现非病毒式转移至细胞。进一步的，多种共聚物已经被证明有助于溶解疏水性药物胶束，以将其传递至靶细胞(阿卡霍夫(alakhov)等，1999；阿尔瓦雷斯·洛伦佐(alvarez‑lorenzo)等，2010；基亚佩塔和索斯尼克(chiappettaandsosnik)，2007；埃鲁科娃(erukova)等，2000)。这些聚合的物质除其他外，包括聚乙二醇(peg)、聚环氧丙烷(ppo)、聚乳酸(pdlla)、泊洛沙姆和泊洛沙胺。将药物封装在胶束的疏水内芯内可显著增加药物的溶解性、稳定性和被靶细胞吸收的能力。10.cas9蛋白质sgrna核糖核蛋白(rnp)的复合物已经被证明对有效的基因修饰，同时将潜在的脱靶效应降至最低有价值(冈迪(gundry)等，2016)。非病毒聚合物传递系统(如泊洛沙胺和其他聚合物)可作为有价值的工具，将rnp传递到靶细胞中，以纠正体外和体内遗传缺陷(可汗(khan)等，2016)。11.近期，已经进一步开发出了的非逆转录病毒载体，并被用于基于包膜疱疹病毒的基因转导载体，这样的包膜疱疹病毒包括hsv‑1、恒河巨细胞病毒(rhcmv)和mcmv，其神经基因转导能力和作为疫苗载体的良好特性而受到高度关注(汉森(hansen)等，2011年；马可尼(marconi)、曼塞维吉(manservigi)和爱泼斯坦(epstein)，2010年；莫尔(mohr)等，2010年)。近期，源自属于沙粒病毒科的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(lcm)病毒的病毒载体在同源和异源疫苗接种方案中诱发了有效的免疫应答(温格苏(wingerath)等，2017年)。技术实现要素：12.本发明所要解决的技术问题为提供一种用于病毒载体转导细胞的改进手段和方法。13.通过提供权利要求书中所描述的实施例实现上述技术问题的解决方案。14.相应地，本发明的第一方面，涉及一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)逆转录病毒载体和/或(ii)脊椎动物细胞。15.有关于所述第一方面，本发明提供一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)包膜病毒载体和/或(ii)脊椎动物细胞。16.有关于所述第一方面，本发明提供一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)逆转录病毒载体和(ii)脊椎动物细胞。17.进一步的，本发明提供一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)逆转录病毒载体和(ii)脊椎动物细胞；其中，所述泊洛沙胺的浓度范围为从约0.1至约40mg/ml。18.术语“泊洛沙胺”有其学术既定的含义。本发明涉及含中心1,2‑乙二胺的两亲性嵌段共聚物，其中，任一氮原子的两价被基团取代，每个所述基团均包含多个环氧乙烷和/或环氧丙烷构筑块。进一步解释地，所述基团包含大量通过醚键连接的环氧乙烷和/或环氧丙烷构筑块，其优选实施例如下式(i)所示。虽然，本发明在这方面没有要求，优选地，所述基团中的每一个都包含环氧乙烷和环氧丙烷构筑块。在所述构筑块包括环氧乙烷和环氧丙烷的程度上，所述基团优选考虑分为两部分，即仅由环氧丙烷构筑块组成的部分和仅由环氧乙烷构筑块组成的第二部分。同样地，本发明在这方面也没有要求。因此，还可以想象的是，一个或多个基团为，其中的环氧乙烷和环氧丙烷构筑块是交替排列的链，或者其中的环氧乙烷和环氧丙烷构筑块是随机排列的链。19.在所述取代基具有上述定义的二分结构的程度上，即，一部分仅由环氧乙烷单元结构组成和第二部分仅由环氧丙烷构筑块组成，则优选考虑由环氧丙烷构筑块组成的部分直接与氮原子结合，以及由环氧乙烷构筑块组成的部分位于远离氮原子的位置(也被称为“序贯泊洛沙胺”(sequentialpoloxamines))。如下所示的式(i)的优选实施例中也描述了这一特征。20.尽管不是特别优选的，但在本发明范围内，在单个泊洛沙胺分子内的四个如上所述的取代基各自具有不同的结构。例如，所有四个取代基可以都是环氧乙烷和环氧丙烷构筑块(不同的)的无规共聚物。在另一实施例中，两个基团可具有二分结构，其中的近氮端部分由环氧丙烷构筑块组成，且远氮端部分由环氧乙烷构筑块组成，另外两个基团可仅由环氧乙烷构筑块或环氧丙烷构筑块组成。21.在上述的一类分子中，氮原子上的三价被占据。氮原子上的四价被占据，并且氮原子带正电荷也在本发明的所述范围内。在这种情况下，优选存在一个或多个反离子，使物质的组合物呈电中性。占据所述泊洛沙胺的一个或两个氮原子的第四价的基团优选为氢、低级烷基、低级烯基或低级炔基。本文中的术语“低级”优选地指cl到c6(在烯基和炔基的情况下指c2到c6)，优选为cl到c4(在烯基和炔基的情况下指c2到c4)。特别优选地，烷基基团是甲基、乙基、正丙基和异丙基。如果两个氮原子都是四价的，则占据两个氮原子上的第四价的基团优选相同。特别优选地，这两个氮都是四价的，并且两个氮原子的第四价上对应的基团都是甲基。22.进一步设想，占据一个或两个氮原子上的第四价的取代基包括环烷基，所述环烷基包括环己基、芳基、芳基烷基、杂芳基和杂芳基烷基。所述芳基优选为苯基。芳基烷基和杂芳基烷基中的烷基优选为甲基和乙基。优选的杂芳基为六元环，所述六元环具有一个、两个或三个分别选自n、s和o的杂原子。所述环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基和杂芳基烷基中的任何一种都可以是被取代的或未被取代的。优选地，取代基包括低级烷基、低级烷氧基和卤素。本文中，“低级”具有与上述定义相同的含义(cl到c6，优选cl到c4)。卤素包括氟、氯和溴。23.所述组合物可以包括一种泊洛沙胺。也可以包括两种、三种、四种、五种或更多不同种的泊洛沙胺。24.所述反离子优选为类卤素离子，包括氟离子、氯离子、溴离子和碘离子。进一步优选的，所述反离子包括硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐以及其他一元羧酸(例如甲酸盐、丙酸盐和丁酸盐)的阴离子。水杨酸盐是另一种预想的反离子，优选为药物上可接受的反离子。25.在最为宽泛的定义中，环氧乙烷构筑块和环氧丙烷构筑块的比率没有特别的限制。在优选实施例中，所述比例为约0.05至约1.5。下文结合优选实施例进一步公开更优选的环氧丙烷‑环氧乙烷的比率。它们对根据本发明中泊洛沙胺最广泛的定义进行了必要的变更。26.泊洛沙胺被认为是制备小分子药物或普通dna质粒的试剂。然而，关于将泊洛沙胺用于转导包括逆转录病毒和慢病毒的包膜病毒，在现有技术中则是空白的。本文给出的结果表明，泊洛沙胺在提高利用慢病毒和逆转录病毒载体的脊椎动物细胞转导中具有惊人的特定的高活性。27.从本发明的其余部分可以明显看出，根据本发明，所述泊洛沙胺用作转导增强剂。所述泊洛沙胺不用作赋形剂、分散剂或粘度调节剂。28.可选的，所述组合物不含有其他转导增强剂，即，其仅包含一种或多种泊洛沙胺作为增强转导的试剂。在替代方案中，可存在其他的转导增强剂，尤其是属于除泊洛沙胺以外的化合物种类的转导增强剂。将进一步在下文中描述这样的转导增强剂的优选实施例。29.在考虑到泊洛沙胺的程度上，所述组合物是一种溶液。换句话说，它不是凝胶。30.并且，可以理解的是所述组合物是独立的。换言之，它不是包含细胞的组合物，这种细胞指的是例如，仅可在人类或动物体内，在给药不含细胞的相应组合物时形成的细胞。31.病毒载体是由天然存在的病毒衍生的粒子。天然存在的病毒通常包括核酸和蛋白质。包膜病毒还包括通常源于宿主细胞脂双层，且通常包括病毒包膜蛋白质。根据本发明，对病毒载体的最低要求是具有所述病毒包膜蛋白质的所述脂双层。可以，但也不必一定存在核酸和/或进一步的蛋白质。术语“核酸”指原始病毒核酸、异源核酸或其结合。至于逆转录病毒载体，所述病毒核酸为rna。所述核酸可进一步包含至少一个衍生自逆转录病毒的长末端重复(ltr)序列和包装信号序列。可选地，所述核酸可进一步包含诸如rre序列的遗传因子。就目前而言，所述蛋白质可进一步，包括逆转录酶、整合酶和衣壳蛋白。所述整合酶可以是整合缺陷型的。32.相应地，所述术语“衍生物”和“衍生于”至少指下述修饰：将异源核酸导入病毒的遗传物质中，或者使用异源核酸序列替换所有或者部分病毒的编码基因，以及允许在病毒粒子中包装所述异源核酸。次优选地，但不含任何包装的病毒衍生核酸的天然存在的病毒或病毒样粒子被归入术语“病毒载体”之中。因此，另一实施例为病毒样粒子(vlp)。病毒样粒子不具传染性，既不含病毒遗传物质，也不含异源核酸。它们产生于病毒结构和/或辅助蛋白(如包膜或衣壳蛋白)的表达，这可导致病毒样颗粒(vips)的自组装。逆转录病毒和慢病毒衍生的vlps用于传递重组蛋白，可实现高产量(罗伯特(robert)等，2017)。33.外来体是脂双层封闭的细胞外载体，所述细胞外载体可用于在细胞间运输蛋白质、核酸和脂类(科瓦尔(kowal)、特卡奇(tkach)和泰瑞(théry)，2014)。这些外来体也可以使用病毒糖蛋白vsv‑g假型(pseudotyped)，以改善向哺乳动物细胞的传递(迈耶(meyer)，2017)。基于这些性质，外来体被提出可以用于基因治疗的应用中(奥洛林(o'loughlin)、沃(retroviruses,coffinjm,hughessh,varmushe,coldspringharbor(ny):coldspringharbourlaboratorypress；1997；isbn‑10:0‑87969571‑4)(马崔(matraí)、蔡(chuah)和范登德里斯切(vandendríessche)，2010；奥康奈尔(o'connell)等，2010)。慢病毒载体可以基于，例如牛、马、猫、绵羊/山羊或灵长目动物慢病毒组的组中的慢病毒。优选地，慢病毒载体基于灵长目动物慢病毒，例如hiv1、hiv2或siv病毒。最优选的是，慢病毒载体基于hiv1慢病毒。如本领域技术人员所知，大多数(市售)慢病毒载体表示来自不同病毒的病毒成分的混合物，因此在某种程度上是“杂交的”载体。例如，慢病毒载体可包含来自hiv1(人类免疫缺陷1病毒)、vsv(水泡性口炎病毒)、cmv(巨细胞病毒)、whv(土拨鼠肝炎病毒(whp))病毒的成分。因此，根据本发明还可以预想为假型载体。41.在更优选的实施例中，慢病毒载体为使用vsv‑g假型的；具有与vsv‑g融合的抗体片段或蛋白质支架，例如cd3‑vsv‑g、cd4‑vsv‑g、cd8‑vsv‑g、cd34‑vsv‑g、cd30‑vsv‑g、cd44‑vsv‑g、egfr‑vsv‑g；和/或转铁蛋白受体(tnfr)。42.病毒载体内容中的术语“假型”是本领域中众所周知，例如在下述文章中所描述(比朔夫(bíschof)和科内塔(cornetta)，2010)。假型指通过整合外来的病毒包膜糖蛋白(gp)来调节病毒载体的细胞类型特异性，包括但不限于rd114、galv、lcmv、mlv、gp160、马传染性贫血病毒(eiav)gp、猫免疫缺陷病毒(fiv)gp、狂犬病病毒糖蛋白(rv‑g)，融合糖蛋白e型(fug‑e)gp((参见，当今基因疗法，5，387‑398(2005))(currgenether.5,387‑398(2005))).使用这种方法，可以改变宿主嗜性和/或降低或提高病毒的稳定性。例如，水泡性口炎病毒的糖蛋白g(vsv‑g)可用于假型慢病毒，如下述文章中所述(伯恩斯(burns)等，1993)。使用vsv‑g可有利于实现各种细胞类型的转导，然而，转导效率因细胞类型而异，并且对于难以转导的细胞(例如原始淋巴细胞和淋巴瘤细胞系)转导效率尤其低。43.根据本发明的“靶细胞”可以是任何被设定为使用病毒载体转导的目标的细胞。于本发明中所使用的术语“细胞”可指单个和/或独立的细胞、培养中的细胞或作为多细胞实体(例如组织或生物体)的一部分的细胞。换言之，该方法可在体内、离体或体外执行，优选为离体或体外。所述细胞优选为脊椎动物细胞。44.优选地，所述细胞为哺乳动物细胞。本文所使用的术语“哺乳动物细胞”是本领域中众所周知的，指属于或衍生于属于哺乳动物纲的动物的任何细胞。取决于通过本发明的方法转导以修饰哺乳动物细胞的基因组所要实现的特定目标，可以使用不同哺乳动物亚纲的细胞，如原兽亚纲或真兽亚纲。例如，在真兽亚纲中，优选下纲真兽亚纲动物的细胞，尤其是，灵长目、偶蹄目、奇蹄目、啮齿目和兔形目动物的细胞。45.进一步地，在一个物种内，可以根据组织类型和/或平等分化的能力来选择细胞，这取决于依照本发明的方法，通过转导靶细胞以修饰基因序列所要实现的目标。哺乳动物身体由三种基本的细胞种类组成：生殖细胞、体细胞和干细胞。生殖细胞是产生配子的细胞，因此可以代代相传。干细胞是可以分裂和分化成不同的特化的细胞类型，也可以自我更新产生更多的干细胞。哺乳动物的干细胞主要有两种：胚胎干细胞和成体干细胞。体细胞包括所有不是配子细胞、配子母细胞或未分化干细胞的细胞。哺乳动物的细胞也可以根据它们的分化能力来分组。全能性的(也称为有无限能力的)细胞是一种能够分化成成年生物体的所有细胞类型的细胞，这些细胞类型包括胎盘组织，如受精卵(受精卵母细胞)和随后的卵裂球，而例如胚胎干细胞的多能细胞不能分化成胚胎外组织，如胎盘，但有可能分化为三种胚层，内胚层、中胚层和外胚层中的任一层。多能祖细胞具有从多个但数量有限的细胞谱系中产生细胞的可能。此外，还存在仅能发育成少数细胞类型的寡能性细胞和仅能发育成一种细胞类型的单能性细胞(有时也称为前体细胞)。有四种基本的组织类型：肌肉组织、神经组织、结缔组织和上皮组织，本发明方法中所使用的细胞可以从中衍生得到，例如造血干细胞或神经干细胞。优选地，不从人类胚胎中获得的人类细胞，特别是不使用破坏人类胚胎的方法获取的人类细胞。另一方面，人类胚胎干细胞由技术人员来处理，例如从市面可购得的现有胚胎干细胞系中获取。因此，本发明可以在无需使用或破坏人类胚胎的情况下使用人类胚胎干细胞。或者，也可以使用类似于胚胎干细胞的多能细胞(如诱导多能干细胞(ips))来代替人类胚胎干细胞，其产生代表了技术发展的现状(哈格斯(hargus)等，2010；杰尼斯(jaenisch)和杨(young)，2008；高桥(takahashi)和山中(yamanaka)，2006)。46.在优选实施例中，所述靶细胞为选自由淋巴细胞、肿瘤细胞、淋巴系细胞、神经元细胞、上皮细胞、内皮细胞、原始细胞、干细胞组成的组的细胞。47.术语“淋巴系细胞”是指参与淋巴细胞和淋巴细胞本身的生成的细胞。术语“淋巴细胞”是指本领域公知的小淋巴细胞(b和t淋巴细胞、浆细胞)和自然杀伤细胞。淋巴系细胞进一步包括例如淋巴树突状细胞以及诸如前淋巴细胞、淋巴母细胞、普通淋巴祖细胞等淋巴细胞祖细胞。48.根据本发明且本领域公知的，“肿瘤细胞”指参与良性、癌前或恶性肿瘤形成的赘生细胞。恶性肿瘤细胞通常被称为癌细胞，可能有转移或扩散到邻近组织的能力。肿瘤细胞优选为胰腺肿瘤细胞(例如，aspc‑1和panc‑i细胞)、卵巢癌细胞系(例如，a2780)、淋巴瘤细胞系(例如，karpas‑299、sudhl‑i、sup‑m2、supt‑1、jvm‑3、jeko‑l、dohh‑2、hut‑78和sr‑786细胞)、皮肤黑色素瘤细胞系(例如，a375)和乳腺癌细胞(例如，mcf7，mda‑mb‑361和t47d细胞)和直接衍生于肿瘤的原始细胞。[0049]“神经元细胞”是本领域公知的，是指通过电信号和化学信号传递信息的电易激细胞。存在各种特殊的神经元细胞，例如感觉神经元和运动神经元。例如，根据本发明，篮细胞、贝茨细胞、中度棘神经元、浦肯野细胞、锥体细胞、闰绍细胞、颗粒细胞或前角细胞可以用作靶细胞。“神经元肿瘤细胞”是起源神经元的肿瘤细胞，例如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤和其他衍生于神经元谱系的恶性肿瘤。可以使用神经胶质瘤细胞系(例如，u87和ln18)。[0050]术语“干细胞”是本领域中公知的，并且已在上文中详细描述。根据本发明方法，优选使用的干细胞，例如，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经干细胞、癌症干细胞、诱导多能干细胞(ips)。[0051]术语“上皮细胞”是本领域中公知的。上皮细胞分布在全身的腔体和结构表面上，也形成许多腺体。上皮组织可分为单层上皮(一个细胞厚)和复层上皮(多层细胞)。上皮细胞按其形态可分为鳞状上皮细胞、立方上皮细胞、柱状上皮细胞和假复层上皮细胞。例如，人类的胃和肠中分布有上皮细胞。此外，上皮细胞系还包括乳腺癌细胞(例如mcf7、mda‑mb‑361和t47d细胞)或细胞系he‑kt293t的细胞。[0052]术语“内皮细胞”是本领域中公知的，指分布在血管内表面的细胞，并且在本文中没有其他含义。存在各种各样的内皮细胞，例如ea.hy96、huvec和hcaec细胞。[0053]本文所使用的术语“原始细胞”是本领域所公知的，指已经从组织中分离并且已经在体外培养的细胞。相应的细胞经历了非常少的(如若有)群体倍增，因此与连续细胞系相比，它们更能代表他们所衍生于的组织的主要功能成分，从而代表一个更具代表性的处于体内状态的模型。从各种组织获得样品的方法和建立原始细胞系的方法在本领域是公知的(参见例如，琼斯和怀斯，方法分子生物学，1997(jonesandwise,methodsmolbiol.1997))。用于本发明方法中的原始细胞衍生于，例如，血液、淋巴瘤和上皮性肿瘤。原始细胞也包括从组织中分离出来的以及通过慢病毒转导使基因稳定整合到基因组中而永生化的细胞。这些基因包括cdk‑2、cdk4、cdk‑6、htert、sv40大t抗原、bmi1、hpv16e‑6/7或两个或更多所述基因的任何组合。[0054]关于使用病毒载体，特别是使用逆转录病毒载体进行的转导，原始细胞、淋巴细胞、淋巴系细胞和神经细胞被认为是难以转导的。[0055]在更优选的实施例中，淋巴细胞是原始淋巴细胞和/或肿瘤细胞是造血肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞或上皮肿瘤细胞。[0056]优选的，所述上皮肿瘤细胞源于乳腺肿瘤细胞。本领域所公知的，后者细胞以及上述原始细胞、淋巴细胞和淋巴系细胞尤其难以使用逆转录病毒载体和包括腺病毒载体的其他病毒载体进行转导。相较于现有方法，使用本发明可以显著提高在上述细胞中的转导率。[0057]众所周知，人工培养的细胞可以是悬浮的或贴壁的，例如贴壁在细胞层或人工基质上。[0058]根据第一方面的所述组合物优选为所述泊洛沙胺的溶液和所述逆转录病毒载体和/或所述脊椎动物细胞的悬浮液。[0059]本发明人惊奇地发现泊洛沙胺可用作逆转录病毒的转导增强剂。逆转录病毒是包膜病毒，因此与小分子药物或核酸非常不同。[0060]泊洛沙胺的毒性很低或没有毒性；可见所附的实施例。与基于肽和蛋白质的转导增强剂相比，泊洛沙胺的生产成本相对较低，符合临床应用的gmp质量标准。一旦进入体内，通常在大约两到五周的时间范围内，泊洛沙胺会被水解降解，却不会产生有毒的降解产物(曹(cho)、李(lee)和韦伯(webb)，2012年)。泊洛沙胺的这些有益性质通过眼科学上的应用来进一步说明，如在下述文章中所述的，苏博文(subbaraman)等，2006和汤奇(tonge)等，2001。[0061]在一优选实施例中，(a)所述泊洛沙胺为序贯泊洛沙胺；和/或(b)具有式(i)中结构:[0062]r1r2n‑(ch2)2‑nr3r4(i)[0063]或者式(ii)中结构:[0064]r1r2r5n ‑(ch2)2‑n r3r4r6(ii)[0065]c‑l[0066]任一公式中，r1为h‑(o(ch2)2)a‑(och(ch3)ch2)b‑；[0067]r2为h‑(o(ch2)2)c‑(och(ch3)ch2)d‑；[0068]r3为‑(ch2ch(ch3)o)e‑((ch2)2o)f‑h；[0069]r4为‑(ch2ch(ch3)o)g‑((ch2)2o)h‑h；[0070]r5和r6各自为不存在或选自h、cl到c6烷基、c2到c6烯基和c2到c6炔基；其中，如果不存在r5或r6，则连接r5或r6的n不携带正电荷；[0071]c‑l代表一个或多个反离子，其使得式(ii)的结构呈电中性；[0072]a、c、f和h各自为从约25到约200、优选从约50到约120的整数；并且b、d、e和g各自为从约5到约50、优选从约10到约25的整数。[0073]术语“序贯泊洛沙胺”是一个本领域专有的术语，可以参见(阿尔瓦雷斯·洛伦佐((alvarez‑lorenzo)等，2010)中的图1。进一步解释地，序贯泊洛沙胺的特征在于，聚环氧丙烷构筑块被限制到与中心乙二胺基团的两个氮连接的四条链的那些片段上，其中的中心乙二胺基团直接附着到所述氮上。所述片段由聚环氧丙烷构筑块组成。换言之，在序贯泊洛沙胺中，四条链的末梢片段由聚环氧丙烷构成。[0074]反之，则适用于反序泊洛沙胺，根据本发明其并不是优选。[0075]根据上述，式(ii)的组合物也包括式(iia)的组合物：[0076]r1r2r5n ‑(ch2)2‑nr3r4(iia)[0077]c‑l[0078]优选的反离子已在上文中公开。[0079]如上述(b)项中所示的式(l)和(ii)描述了一种序贯泊洛沙胺，其中限定了构筑块(分别为环氧乙烷(eo)和环氧丙烷(po))的数量。优选的po/eo比率在下文中描述。[0080]通常而言，在本说明书中，术语“约”是指与该“约”后面的数值存在 /‑30％的平均偏差，优选 /‑25％、 /‑20％、 /‑15％、 /‑10％或 /‑5％。[0081]a、c、f和h的特别优选范围为约27至约170、约32至约160、约38至约148、约40至约142、约43至约136、约46至约131、约49至约125、约51至约119，和约54至约114。[0082]b、d、e和g的特别优选范围为约5至约50，约6至约40、约7至约35、约8至约29、约9至约27、约10至约26、约11至约25、约12至约24、约12至约23，和约11至约22。[0083]特别是有关定义泊洛沙胺的结构参数，值得注意的是，由于制造方法存在一定的可变性。更详细地说，当从同一制造商获取给定的产品，不同批次的给定产品也会有所不同。此外，制造商不同也可能带来差别。结构参数前的术语“约”反映了这一点。[0084]此外，在给定制造商的给定批次中，也存在差异，在于包含不同的分子种类。因此，如果没有另外说明，所有结构参数都代表包含在给定批次中的各个分子的结构参数的平均值。这也与制造商通常提供的信息一致。[0085]即便如此，还是必须考虑以下几点：由于泊洛沙胺的给定样品含有不同的分子，或者换句话说，表现出结构异质性，此类样品可包含满足本文所公开实施例的结构要求的泊洛沙胺分子，同时进一步包含不满足本文所公开实施例的结构要求的泊洛沙胺分子。即使不是优选的，这也是实现本发明的方法。因此，结论如下：即使用于表征所考虑的泊洛沙胺样品的平均结构参数不满足本文所公开的实施例的要求，但是所述样品中包含的一部分泊洛沙胺分子仍然满足本文所公开的实施例的要求。可以通过使用本领域专有的分析方法，如质谱分析法和/或色谱分析法，包括气相色谱分析法，来确定是否发生这种情况。在这种情况下，本文所公开的实施例中所叙述的结构参数是表征单个泊洛沙胺分子或所描述的部分的参数。认为在给定样品中含有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的泊洛沙胺满足本文所公开实施例的结构要求，就足以引起显著的转导增强效应。[0086]在本发明上述方面的特别优选实施例中，a＝c；f＝h；b＝d；和/或e＝g；优选a＝c＝f＝h；和/或b＝d＝e＝g；特别优选的是a＝c＝f＝h和b＝d＝e＝g。换句话说，优选r1、r2、r3和r4相同。[0087]在本发明上述方面的进一步特别优选实施例中，环氧丙烷‑环氧乙烷比率(#po/#eo)定义为(b d e g)/(a c f h)，其范围为从约0.05到约1.5、优选从约0.1到约1.0、更优选从约0.15到约0.67，更加优选从约0.18到约0.35。以及#po/#eo比率优选为约0.20、约0.25和约0.30。还可以预想诸如从约0.25到约0.35的相应范围。[0088]另一个常用的量度是重量比eo/(eo po)。优选泊洛沙胺具有约0.3与约0.95之间、更优选约0.5与约0.9之间，以及更优选约0.7与约0.8之间的eo/(eo po)重量比。[0089]在优选实施例中，(a)所述泊洛沙胺处于流体状态；和/或(b)所述组合物是泊洛沙胺溶液，其中所述载体是溶解的和/或悬浮的；和/或所述细胞处于悬浮或贴壁状态。[0090]本领域已知泊洛沙胺在水中有溶解度上限，其通常为约200mg/ml(色拉‑梅兹(serra‑gómez)等，2016)。本优选实施例的要求不包括泊洛沙胺悬浮液、凝胶以及其中的溶解泊洛沙胺与固体泊洛沙胺处于平衡状态的任何混合物。[0091]在进一步的优选实施例中，所述组合物进一步包含或进一步由下述物质组成：(a)选自多阳离子聚合物或多阳离子肽的组中的一种或多种多阳离子物质；(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0092]在第二方面中，本发明提供包含第一方面的组合物或由第一方面的组合物组成的药物组合物，其中第一方面的所述组合物包含所述包膜病毒载体，优选所述逆转录病毒载体。[0093]据了解，药物组合物具有有益效果。因此，设想所述药物组合物中包含的病毒载体包含核酸，其能够在对细胞或者生物体用药时，引发有益作用，所述生物体包括脊椎动物、哺乳动物、灵长类动物和人类。[0094]在第二方面的优选实施例中，所述药物组合物进一步包含或由：药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂组成，其实施例包括缓冲盐水(例如pbs和hbss)、细胞培养基(例如dmem、rpmi1640和imdm)和水。[0095]在第三方面中，本发明提供泊洛沙胺用于使用逆转录病毒载体转导脊椎动物细胞的用途。[0096]在使用病毒载体进行细胞调节的内容中的术语“转导”是本领域所众所周知的，并且在本文中没有其他含义。简言之，该术语是指将遗传物质引入细胞中，以及可选地，随后通过病毒载体整合到所述细胞的基因组中的过程。所述遗传材料包含或由病毒rna组成，该病毒rna与包含在意图整合到(基因组的)靶细胞中的所述载体中的一个或多个靶rna序列(以下称为靶序列)结合。[0097]优选细胞以及优选包膜病毒载体如上文所定义的。[0098]优选地，(a)排除通过治疗对人体或动物身体进行处理的用途；(b)所述用途是在体外或离体的用途；和/或(c)所述细胞不是活体生物体的部分。[0099]尤其优选为离体的应用。换言之，细胞可取自脊椎动物的生物体，根据本发明转导并随后重新引入脊椎动物生物体，优选但不限于取得该细胞的生物体。转导过程发生在所述生物体的外部。优选地，在所述重新引入步骤之前移除泊洛沙胺。[0100]一般而言，根据本发明，泊洛沙胺可与一种或多种已知用于增强转导的其他药剂(本文中也称为“佐剂”)结合。[0101]因此，在另一优选实施例中，进一步使用(a)选自多阳离子聚合物或聚阳离子肽的组中的一种或多种多阳离子物质；(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0102]根据本发明的“多阳离子聚合物”是指其重复单元带有正电荷的带电聚合物，其中重复单元上的正电荷来自质子化氮基团。例如，在聚乙烯亚胺(pei)中，带正电的基团是亚胺基团。[0103]术语“聚阳离子肽”指带正电的肽。例如，多聚赖氨酸是分子式为(c6h12n20)n的均聚聚阳离子肽，其中根据本发明，但不限于，n可以是至少2，例如至少20，优选在200和500之间，更优选在500和2500之间。[0104]在另一优选实施例中，进一步使用一种或多种糖蛋白或其片段，例如纤维连接蛋白和纤维连接蛋白片段(片段包括比较纤维连接蛋白)以及选自lah4肽家族的蛋白质片段或肽。[0105]术语“糖蛋白”描述含有共价连接到一个或多个氨基酸侧链上的寡糖链(聚糖)的蛋白质。纤维连接蛋白是一种多域糖蛋白，其大小介于230kda和270kda之间(施瓦茨鲍尔(schwarzbauer)和德西蒙(desimone)，2011)。比较纤维连接蛋白是指含有三个结构域(cs‑i、rgds和肝素结合结构域)的纤维连接蛋白片段(李(lee)等，2009)。肝素结合结构域结合于与病毒载体，rgds和cs‑i结构域分别通过vla‑5和vla‑4与靶细胞结合，从而使得病毒颗粒和细胞极为接近。[0106]术语“lah4肽家族”是指富含组氨酸的阳离子两亲肽(弗纳尔(fenard)等，2013；穆雷(moulay)等，2017)。[0107]在另一优选实施例中，进一步使用星状孢菌素。[0108]术语“星状孢菌素”是指一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，其最初从细菌(链霉菌属星状孢菌素)中分离出来，具有抗真菌活性(玉置(tamaoki)和中野(nakano)，1990)。它还可以引起中期细胞的染色质松弛，增加中期阻滞细胞中hiv‑i的整合。此外，已证明星状孢菌素在人类cd34 外周血细胞中的慢病毒转导后可增加载体拷贝数(vcn)(刘易斯(lewis)等，2018)。[0109]在另一优选实施例中，进一步使用前列腺素。[0110]术语“前列腺素”指一类具有激素样作用和具有包括炎症反应在内的调节致病机制的生理活性脂质。前列腺素e2(pge2)主要由巨噬细胞产生，参与调节免疫反应、血压、胃肠道完整性和生育能力(里乔蒂(ricciotti)、埃马努埃拉(emanuela)和菲茨杰拉德(fitzgerald)，2011年)。尤其是，pge2已被证明可增强cd34 hspc中的慢病毒转导(赫夫纳((heffner)等，2018)。[0111]pge2是一种天然的pge2受体激动剂。根据本发明，也可使用其它pge2受体激动剂。优选地，pge2受体激动剂选自15d‑pgj2；德耳塔(delta)12‑pgj2；2‑羟基十七碳三烯酸(hht)；血栓素a2；血栓素b2；伊洛前列素；曲前列素；曲伏前列素；卡前列素氨丁三醇；他氟前列素；拉坦前列素；比马前列素；异丙基乌诺前列酮；氯前列醇；雌二醇；氯前列烯醇；米索前列醇；布他前列素；亚油酸；13(s)‑hode；ly171883；米德酸；廿碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ono‑259；cay1039；16，16‑二甲基pge2；19(r)‑羟基pge2；16，16‑二甲基pge2对(对乙酰氨基苯甲酰胺)苯基酯；11‑脱氧‑16,16‑二甲基pge2；9‑脱氧‑9‑亚甲基‑16，16‑二甲基pge2；9‑脱氧‑9‑亚甲基pge2；硫前列酮；pge2‑丝氨醇酰胺；pge2甲酯；16‑苯基四去甲(phenyltetranor)‑pge2；15(s)‑15甲基pge2；和15(r)‑15甲基pge2。[0112]一般来说，可以使用激发前列腺素e受体信号转导的试剂。这些试剂包括pga2；pgb2；pgd2；pge1(前列地尔)；pgf2；pgi2(依前列醇)；pgh2；和pgj2。[0113]已知激发所述前列腺素信号通路的其他试剂有：美贝弗林、氟氢缩松、阿替洛尔、吲哚洛尔、加博沙多、犬尿喹啉酸、肼苯哒嗪、噻苯咪唑、双茶碱、维他霉素(vesamicol)、黄夹次苷、丙咪嗪、氯丙酰胺、1,5‑五亚甲基四唑、4‑氨基吡啶、二氮嗪、苯磷硫胺、12‑甲氧基十二烯二酸，n‑甲酰‑甲硫氨酰‑亮氨酸‑苯丙氨酸(n‑formyl‑met‑leu‑phe)、没食子酸、iaa94和氯烯雌酚醚。[0114]根据本发明，一种或多种所述多阳离子物质可与靶细胞接触。所述接触可在靶细胞与病毒载体和所述泊洛沙胺接触之前、接触时或接触之后实现，只要所述后者的所有成分最终同时存在以同时接触靶细胞。[0115]如果一种以上的多阳离子物质(例如至少两种、至少三种、至少四种、至少5种或至少6种多阳离子物质)进一步与靶细胞接触，则它们可能属于多阳离子聚合物或聚阳离子肽，或者可以从二者中选择，即多阳离子聚合物可与聚阳离子肽混合。[0116]在不受特定理论约束的情况下，本文所述的所有多阳离子物质都能够桥接逆转录病毒载体和靶细胞之间的静电排斥，从而可以进一步提高转导效率。[0117]在更优选的实施方案中，所述多阳离子聚合物选自聚(乙二醇)‑聚(l‑赖氨酸)嵌段共聚物(peg‑pll)和1,5‑二甲基‑1,5‑二氮‑十一烷‑甲基‑聚甲基溴(聚凝胺)组成的组；和/或所述聚阳离子肽选自平均分子量在约1到约300kda之间的硫酸鱼精蛋白和聚赖氨酸(pll)。进一步设想的是pge‑2、纤维连接蛋白、泊洛沙姆和其他促进转导的物质。[0118]泊洛沙姆包括一条中心的聚丙烯氧化链，两侧有两条聚氧乙烯链。泊洛沙姆有几种使用的商品名，如和。通常，泊洛沙姆由数字代码来表征。举例来说，泊洛沙姆407的聚氧乙烯部分的分子量为4000g/mol，且其含量为70％。泊洛沙姆，包括特别适于转导的泊洛沙姆，在本技术人的早期申请wo2013/127964中描述。特别优选的泊洛沙姆在下面进一步公开。[0119]鱼精蛋白是一类富含精氨酸的碱性蛋白质。在许多物种中，它们被发现与精子中的dna有关。硫酸鱼精蛋白由这些从鱼的精子或鱼卵中提取的碱性肽的硫酸盐组成。一般来说，鱼精蛋白是几种类似肽的混合物。典型长度约为30个氨基酸。平均分子质量在4000和7000之间，优选在5000和5500da之间。例如，在欧洲药品管理局(europeanmedicinesagency)的关于含鱼精蛋白的医药产品的评估报告ema/741250/2012中描述了硫酸鱼精蛋白。[0120]术语“聚(乙二醇)‑聚(l‑赖氨酸)嵌段共聚物(peg‑pll)”是指具有[c6h12n2o]x‑[c2h4o]yh2o分子式的带正电大分子，其中x优选为约48且y为约272,72，对应于约12000da的聚(乙二醇)(peg)的平均分子量。如(原田(harada)和片冈(kataoka)，1995)所描述的方法合成peg‑pll。[0121]peg‑pll可单独使用，或与聚凝胺、硫酸鱼精蛋白和/或聚l‑赖氨酸中的任何一种组合使用。可以想象，任何多阳离子物质的使用浓度基本上不影响细胞活性。例如，通常可接受的聚凝胺使用浓度为8至10ug/ml。[0122]在更优选的实施方案中，多阳离子物质为1,5‑二甲基‑1，5‑重氮十一烷‑甲基‑聚甲溴和/或硫酸鱼精蛋白。[0123]1，5‑二甲基‑1，5‑重氮‑十一烷‑甲基‑聚甲溴和硫酸鱼精蛋白可单独使用或相互组合使用，进一步和/或多阳离子物质。[0124]根据本发明，来自lah4肽家族的一种或多种糖蛋白或肽和/或前列腺素和/或可与靶细胞接触。所述接触可在靶细胞与病毒载体和所述泊洛沙胺接触之前、接触时或接触后实现，只要所述后者的所有成分最终同时存在以在同时接触靶细胞。[0125]可以使用一种、多种或所有上述公开的附加试剂(即，除了至少一种泊洛沙胺之外)。[0126]我们注意到，对于具有一定环氧丙烷‑环氧乙烷比率(#po/#eo)的泊洛沙胺，观察到泊洛沙胺与硫酸鱼精蛋白联合使用的协同效应。在这方面，我们参考本文包含的实验数据。术语“环氧丙烷‑环氧乙烷比率”定义如下。由于所提及的协同效应，该比率的优选范围约0.18至约0.35。[0127]环孢霉素是真菌中发现的一类大环内酯类化合物，可作为免疫抑制剂。根据本发明，它们可与泊洛沙胺和本文中所述的增强转导的其它试剂一起用于增强转导。[0128]在第四方面中，本发明提供一种用逆转录病毒载体转导脊椎动物细胞的方法，所述方法包括或由使所述脊椎动物细胞、泊洛沙胺和所述病毒载体接触构成，其中优选地，所述接触按以下顺序进行：(a)提供所述细胞；(b)添加所述泊洛沙胺；以及(c)添加所述载体，其中优选地，在所述接触后进行旋转接种。[0129]与此相关，本发明提供一种用慢病毒载体转导脊椎动物细胞的方法，所述方法包括或由使所述脊椎动物细胞、泊洛沙胺和所述病毒载体接触构成，其中优选地，所述接触按以下顺序进行：(a)提供所述细胞；(b)添加所述泊洛沙胺；以及(c)添加所述载体，其中优选地，在所述接触后进行旋转接种。[0130]也可以同时执行步骤(b)和(c)。[0131]术语“接触(containing)”和“进行接触(bringingintocontact)”是指将靶细胞与病毒载体和泊洛沙胺混合以进行转导。允许转导发生的接触条件在本领域中是众所周知的，并且可以在一定程度上取决于所选择的靶细胞和病毒载体。例如，一些靶细胞比其他细胞更难转导，可能需要转化到特定的培养基中，然后才能实现与病毒载体的转导。相应的方法和条件如(朱、科内塔和益康(chu,cornetta,andecons)2008；杰科姆(jacome)等，2009；波乔布特(poczobutt)等，2010年)在实施例部分中描述了进一步的示例性条件。逆转录病毒载体和泊洛沙胺可同时(例如作为混合物)添加到靶细胞或以按顺序添加，只要两种化合物同时与靶细胞接触以允许转导。优选地，使靶细胞、病毒载体和泊洛沙胺接触至少5小时，例如至少6小时、至少7小时、至少8小时、更优选至少9小时、至少10小时、至少11小时和最优选至少12小时。还设想更长的接触时间，例如至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时或至少72小时。优选在24小时到72小时之间。[0132]在使用本文公开的一种或多种转导佐剂的范围内，优选在步骤(b)中添加所述佐剂；和/或在步骤(a)之后和步骤(c)之前添加。[0133]使用第三方面的优选实施例定义第四方面的方法的优选实施例。[0134]在所述方法的优选实施例中，(a)排除通过疗法对人体或动物身体进行治疗的方法；(b)所述方法为体外或离体方法；和/或(c)所述细胞不是生物体的一部分。[0135]在所述方法的另一优选实施例中，类似于根据本发明的用途的优选实施例，所述接触包括或进一步由接触(a)选自多阳离子聚合物或聚阳离子肽组的一种或多种多阳离子物质；(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0136]优选的多阳离子聚合物、聚阳离子肽、糖蛋白、前列腺素和泊洛沙姆如上文所述。[0137]在另一个优选实施例中，上述公开的方法进一步包括：在所述靶细胞与所述泊洛沙胺接触时或接触之后，旋转接种所述病毒载体与所述靶细胞。[0138]“旋转接种”一词有关病毒载体离心接种靶细胞，以确保细胞对逆转录病毒的摄取密切接触。本领域众所周知，并且在本文的背景部分中讨论的文献中描述了旋转接种协议。可在所述靶细胞与所述泊洛沙胺接触时或接触之后执行旋转接种步骤。优选地，在使靶细胞与泊洛沙胺和病毒载体接触之后执行旋转接种步骤。[0139]旋转接种步骤进一步提高使用本发明方法实现的转导率，特别是在难以转导的细胞中。[0140]使用vsv假型逆转录病毒载体和vsv假型慢病毒载体时，最好进行旋转接种，但无需仅使用旋转接种。vsv假型是一种特别赋予载体机理稳定性的方法。这种机理稳定性在旋转接种时是有利的。在申请人的专利申请wo2015/104376中描述了vsv假型病毒载体，其全部公开内容通过援用并入本文。本文上述进一步公开了关于vsv假型的内容。[0141]与参考方法相比，优选实施例中的转导增强，所述参考方法不添加所述泊洛沙胺，所述参考方法在其他方面与所述转导脊椎动物细胞的方法相同。[0142]通过本领域既定的方法，可以量化转导和转导的提高。如实施例中所释，可以通过荧光激活细胞分选(facs)来实现。facs可以测定被转导细胞的数量。根据是否存在荧光标记，细胞被分为转导或未转导。转导可以用相关术语来表示，例如，被转导细胞的数量除以在给定的转导分析中使用的细胞总数得到的比率。[0143]在第五方面中，本发明提供第一方面的组合物，其中所述第一方面的组合物包含所述病毒载体或用于医药的第二方面的药物组合物。[0144]在第六方面中，本发明提供第二方面的药物组合物或供第四方面使用的组合物，其中所述逆转录病毒载体携带对患有疾病或有患所述疾病风险的个体有益的基因。下表1分别给出了优选疾病和相关基因。[0145]表1[0146][0147][0148]在另一优选实施例中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。[0149]在本发明上述公开方面的另一优选实施例中，所述泊洛沙胺的分子量为从约5至约50kda、优选的为从约10至约40kda或约10至约30kda，更优选的为从约15kda至30kda或约15kda至25kda。[0150]泊洛沙胺优选为t1504、t1304、t1104、t904、t704、t504、t304、t1307、t1107、t707、t1508和t908。特别优选的是t1307、t1107、t707、t1508和t908。特别优选的选自t908、t1107和t1307的泊洛沙胺。最优选的是t1107。[0151]最后一位数字(如t908中的“8”)表示重量比(eo/(eo po)的数值。如果最后一位是8，则所述比率约为0.8。[0152]以下表2给出了环氧丙烷(po)构筑块的数量、环氧乙烷(eo)基团的数量以及这三种特别优选泊洛沙胺的分子量。[0153]表2[0154]#po#eomw(g/mol)t908约86.2约454.5约25000t1107约77.6约238.6约15000t1307约93.1约286.4约18000[0155]本领域中确立了“t”型号。在这方面，我们参考(基亚佩塔(chiappetta)和索斯尼克(sosnik),2007；施莫尔卡(schmolka)1977)。[0156]字母“t”源于术语该术语在本领域中常用来表示商业上可获得的泊洛沙胺。泊洛沙胺可从包括巴斯夫和克罗达在内的多家制造商处获得。[0157]在本发明任何前述方面的优选实施例中，所述泊洛沙胺的浓度范围为约0.1至约40mg/ml、优选约0.2至约30mg/ml、约0.25至约25mg/ml、更优选为约0.3至约20mg/ml，其中(a)如果所述细胞为悬浮细胞，优选为约0.3至约20mg/ml或约5至约20mg/ml，更优选为约1至约20mg/ml或约10至约20mg/ml；和(b)如果所述细胞为贴壁细胞，则优选范围为约0.3至约10mg/ml、约0.3至约5mg/ml、约0.3至约2mg/ml、约0.3至约1.25mg/ml和约0.3至约1mg/ml逐渐增加。尤其优选为约0.6和约1mg/ml之间的浓度，例如约0.63mg/ml。[0158]实施例中的悬浮细胞为jvm‑3和dohh‑2细胞；数据见图4和图5。实施例中的贴壁细胞为a2780细胞；见图1。hut78细胞(悬浮细胞)优选浓度为0.5‑5mg/ml之间；见图3。[0159]本文所定义的泊洛沙胺优选溶解于水、磷酸盐缓冲液或直接溶解于细胞培养基中。泊洛沙胺可溶解于水或磷酸盐缓冲液中，以获得例如浓度为100mg/ml或50mg/ml的储备溶液，该储备溶液可稀释至给定的工作浓度。浓度超过200mg/ml时，泊洛沙胺溶液通常呈凝胶状。浓度低于200mg/ml时，泊洛沙胺溶液呈流体状态。优选地，所述浓度使泊洛沙胺呈流体状态或溶液形式。[0160]在更优选实施例中，所述泊洛沙胺的浓度为约500至约1000ug/ml。[0161]本文定义的泊洛沙胺在水或磷酸盐缓冲液中稀释时处于流体状态。如本领域技术人员将理解的，用液体泊洛沙胺转导细胞可能更方便，例如，更方便处理，例如更易于移液。[0162]在根据本发明的组合物或使用的组合物的优选实施例中，所述组合物包含或进一步由下述物质组成：(a)选自多阳离子聚合物或聚阳离子肽组的一种或多种多阳离子物质(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0163]优选的聚阳离子聚合物或聚阳离子肽，如上文所述。[0164]在另一优选实施例中，所述泊洛沙胺处于流体状态和/或溶液中。[0165]在上述任一方面的另一优选实施例中，所述脊椎动物细胞是哺乳动物细胞，优选灵长类细胞或人类细胞。[0166]在上述任一方面的优选实施例中，与不含有所述泊洛沙胺的情况下相比，所述转导(a)显著增加；和/或(b)增加至少1.25倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍或至少5倍。值得注意的是，对于大规模生产的转基因患者细胞来说，这种增加是非常显著的。[0167]给定实验的转导效率定义为由载体转导的细胞的比例，或靶细胞中转基因表达的总水平。相较于未使用转导增强子，使用泊洛沙胺的所述比例或所述转基因水平有所增加。实施例1中描述了确定转导率的示范性测量方法。可在后续实施例中找到增强转导的证据。[0168]一般而言，尤其优选(a)所述多阳离子聚合物选自1,5‑二甲基‑1,5‑重氮‑十一烷‑甲基‑聚甲基溴(聚凝胺)和聚(乙二醇)‑聚(l‑赖氨酸)嵌段共聚物(peg‑pll)；(b)所述聚阳离子肽选自硫酸鱼精蛋白，聚‑l‑赖氨酸(pll)，所述聚‑l‑赖氨酸(pll)平均分子量为约1到约300kda、更优选为约1kda到约100kda，和；(c)所述糖蛋白为纤维连接蛋白；(d)所述前列腺素为pge2；(e)所述泊洛沙姆为或(另见wo2013/127964)；和/或(f)所述环孢霉素是csa或csh。[0169]前列腺素优选为前列腺素‑e2(pge2)(赫夫纳(heffner)等，2018)。糖蛋白优选为逆转录连接蛋白(默里(murray)等，1999)。[0170]另一种有用的泊洛沙姆为泊洛沙姆407。[0171]在特别优选实施例中，硫酸鱼精蛋白为聚阳离子肽；#po/#eo为约0.18至约0.35；和/或所述泊洛沙胺为t1107、t1307或t908。[0172]后一个特别优选实施例的特征在于通过组合使用满足所述环氧丙烷‑环氧乙烷比率的硫酸鱼精蛋白和泊洛沙胺，因而产生令人惊讶的协同效应。实施例中包含了证据。[0173]在第七方面中，本发明提供一种试剂盒，包含或由下述物质组成：(a)泊洛沙胺，优选为本文所定义的；(b)可选择(i)至(iii)中的一项或多项：(i)(1)至(3)中的一种、多种或全部：(1)选自多阳离子聚合物和聚阳离子肽的多阳离子物质；(2)前列腺素；(3)糖蛋白；(4)泊洛沙姆；和(5)环孢霉素类；(ii)逆转录病毒载体；(iii)脊椎动物细胞；以及(c)可选地，包括用于执行本发明的用途和/或方法的说明书的手册。[0174]在优选实施例中，所述试剂盒包括使用说明书，优选地，根据上文公开的用途或方法。[0175]上文所描述的关于多阳离子聚合物、聚阳离子肽、糖蛋白、前列腺素和泊洛沙姆定义和特征的组合经必要修改后也适用于本发明的试剂盒。[0176]在优选实施例中，所述试剂盒包含或由所述泊洛沙胺和所述逆转录病毒载体组成。[0177]在另一优选实施例中，所述试剂盒包含或由所述泊洛沙胺和所述脊椎动物细胞组成。[0178]在另一优选实施例中，所述试剂盒包含或由所述泊洛沙胺、所述逆转录病毒载体和所述脊椎动物细胞组成。[0179]试剂盒的各种组分可以包装在一个或多个容器中，例如一个或多个小瓶。除所述组分外，小瓶可包括用于储存的防腐剂或缓冲剂、用于维持和储存的介质，例如细胞培养基、dmem、mem、hbss、pbs、hepes、潮霉素、嘌呤霉素、青霉素‑链霉素溶液、尤其是庆大霉素。有利地，所述试剂盒包括允许技术人员方便使用组分的使用说明，例如，本发明的各种实施例。任何组分都可以在实验环境中使用。[0180]在另一方面，本发明提供一种提高病毒拷贝数(vcn)的方法，所述方法包括第四方面的转导方法，其中vcn与参考方法相比有所提高，所述参考方法不添加所述泊洛沙胺，所述参考方法在其他方面与所述提高vcn的方法相同，其中优选提高vcn至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。[0181]换句话说，提供了一种提高病毒拷贝数(vcn)的方法，所述方法包括使脊椎动物细胞、泊洛沙胺和病毒载体接触，其中优选地，所述接触按以下顺序进行：(a)提供所述细胞；(b)添加所述泊洛沙胺；以及(c)添加所述载体，其中优选地在所述接触后进行旋转接种，并且与参考方法相比，vcn被提高，所述参考方法不添加所述泊洛沙胺，所述参考方法在其他方面与所述提高vcn的方法相同。[0182]在上述公开的提高vcn方法的优选实施例中，以及在第四方面的方法的优选实施例中，(a)所述逆转录病毒载体是慢病毒载体；和/或(b)所述泊洛沙胺为t1107。[0183]术语“载体拷贝数”有其既定的含义。它是指载体或部分在细胞中，优选在细胞基因组中的拷贝数。所述载体拷贝数可以由单个细胞确定，也可以由多个细胞确定。在后一种情况下，可以获得平均vcn。本领域已知用于确定载体拷贝数的方法。它们包括定量聚合酶链反应(qpcr)和微滴式数字聚合酶链反应(ddpcr)，例如，在霍伯(hauber)等，2018(林(lin)等，2016)所述。[0184]控制和改善vcn是基因治疗应用的一个重要方面。vcn决定了治疗基因在细胞中的表达数量，直接影响治疗的成功。通过使用转导增强剂增加vcn可以减少慢病毒载体的使用，从而降低潜在的风险和治疗成本。[0185]当使用本发明的方法时，可以在所附的实施例和附图中发现vcn增强的实验证据。[0186]上文所描述的关于病毒载体和泊洛沙胺的定义和特征的组合经必要修改后也适用于本发明中试剂盒的病毒载体和泊洛沙胺。例如，逆转录病毒载体可以是可以或不可以进一步修饰的慢病毒载体，例如假型的。[0187]关于本说明书中所描述的实施例，特别是在权利要求中，意图将从属权利要求中提及的每个实施例与所述从属权利要求所引用的每个(独立或从属)权利要求的每个实施例相结合。例如，在独立权利要求1引用3个可选方案a、b、c，从属权利要求2引用3个可选方案d、e、f，以及从属权利要求3引用权利要求1、2并引用3个可选方案g、h、i的情况下，应当理解的是，说明书明确公开了相应组合的实施例：；a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i，除非另有特别说明。[0188]类似地，并且在独立和/或从属权利要求没有列举备选方案的情况下，应当理解的是，如果从属权利要求引用多个在先权利要求，则其涵盖的主题的任何组合被认为是明确公开的。例如，在独立权利要求1、引用回权利要求1的从属权利要求2、引用回权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，可以得出权利要求3和1主题的组合与权利要求3，2和1主题的组合一样被清楚无误地公开。进一步的，在从属权利要求4引用权利要求1至3中任一权利要求的情况下，则权利要求4、1、权利要求4、2、1、权利要求4、3、1以及权利要求4、3、2、1主题的组合被清楚无误地公开。附图说明[0189]图1：(a)慢病毒表达荧光素酶以转导的a2780细胞的发光信号。使用表达荧光素酶的慢病毒转导分成三份的a2780细胞。使用浓度在0.31mg/ml到5mg/ml之间的三种不同的泊洛沙胺(t908，t1107，t1307)。示图中显示了使用酶标仪转导后三维(3d)测量的相对光单位(rlu)。将使用聚凝胺(8ug/ml)和仅病毒(不含佐剂)的作为对照例。虚线表示仅病毒的荧光素酶水平。[0190](b)根据所转导的细胞的荧光素酶信号，相较于仅病毒，在a2780细胞中的转导效率成倍提高了。[0191](c)慢病毒表达荧光素酶以转导的nci‑h1838细胞的发光信号。慢病毒表达荧光素酶转导分成三份的nci‑h1838细胞。所有条件与图1a中所描述的相同。[0192](d)根据所转导的细胞的荧光素酶信号，相较于仅病毒，在nci‑h1383细胞中的转导率成倍提高了。[0193]图2：泊洛沙胺和其他转导增强物质的迭加效应。将1mg/ml的每种泊洛沙胺t1107、t1307和t908与5ug/l或40ug/ml硫酸鱼精蛋白(ps)或1mg/ml的相应的其他泊洛沙胺结合。通过gfp表达病毒进行转导以及计算转导后3天gfp表达的细胞与总细胞的对比，来测量对细胞基底的转导增强的效率(图2a‑c)。图2d显示了仅病毒在每种条件下的三个不同加样孔，包括8μg/ml聚凝胺、40ug/ml硫酸鱼精蛋白、1mg/mltl107、1mg/mltl107(含8ug/ml聚凝胺)和1mg/mltl107(含40μg/ml硫酸鱼精蛋白)。测量慢病毒表达荧光素酶以转导的细胞的总转导率。在转导3天后测量发光情况，并以相对光单位(rlu；图2e‑g)表示。采用双尾学生式t检验计算仅泊洛沙胺与含40ug/ml硫酸鱼精蛋白的泊洛沙胺之间差异的显著性，并用p值表示。图中的虚线显示仅病毒对照的水平。[0194]图3：慢病毒表达荧光素酶以转导的hut78悬浮细胞的相对光单位(rlu)表征的发光水平，其中，a)和c)中不采用旋转接种，b)和d)中采用旋转接种。在指定浓度下增加季酮类(teronics)和对照。(c)和(d)显示出与仅病毒的对照相例比，其转导相应成倍提高。[0195]图4:慢病毒表达荧光素酶且不经旋转接种以转导jvm‑3悬浮细胞。(a)显示了以转导后3天所测得的相对光单位(rlu)所表征的发光水平。在指定浓度下增加了季酮类(teronics)和对照例。(b)显示了与仅病毒对照例相比的相应的成倍提高。[0196]图5:慢病毒表达荧光素梅且不经旋转接种以转导dohh‑2悬浮细胞。a)显示了以转导后3天所测得的相对光单位(rlu)所表证的发光水平。在指定浓度下增加了季酮类(teronics)和对照例。(b)显示了与仅病毒对照例相比的相应的成倍提高。[0197]图6：mtt比色法测定使用不同浓度泊洛沙胺处理的a2780细胞的活性。图a)显示了所测量的吸光度的平均值，条形图表示标准偏差。图中的虚线表示的是培养基对照例。b)图中的百分比数值是与仅培养基相比的相对活性。[0198]图7：仅使用了1mg/mlt1107或还结合使用了5ug/mlps的转导，与仅使用了病毒的转导相比较的相对转导增强情况。在对来自独立供体的外周血单个核细胞(pbmcs)进行转导后的第9/10天，使用流式细胞仪(facs)检测转导增强。条形图显示了来自3个不同供体的平均值。计算使用了转导增强剂转导的gfp 细胞相对于仅病毒转导的gfp 细胞的百分比。该比率显示了的传导增强的情况。误差线表示标准偏差。p值通过双尾学生式t检验计算得到。[0199]图8：仅使用了1mg/mltl107或与还结合使用了5ug/mlps的转导，与仅使用病毒的转导相比较的相对载体拷贝数(vcn)的提高情况。在对来自独立供体的外周血单个核细胞(pbmcs)进行转导后的第9/10天，使用ddpcr方法进行分析。比较使用了转导增强剂转导的细胞的vcn与仅病毒转导的细胞的vcn。该比率显示了相对传导增强的情况。条形图显示了来自3个不同供体的平均值，误差线显示标准偏差。p值通过双尾学生式t检验计算得到。具体实施方式[0200]通过实施例进一步阐述本发明。[0201]实施例1[0202]材料和方法[0203]细胞系[0204]在添加10％(vol/vol)胎牛血清(fcs；柏诺(biochrom))和2mml左旋谷酰胺(泛生物技术(panbiotech))的rpmi1640培养基中生长的人类卵巢癌细胞a2780(西格玛奥德里奇(sigma‑aldrich))和人类肺腺癌细胞ncih1838(attc)。[0205]在添加20％fcs(柏诺)的imdb(英杰)培养基中生长的人皮肤t淋巴细胞hut78(atcc)。[0206]在添加10％fcs(柏诺)的rpm11640培养基中生长的人类慢性b细胞白血病(jvm‑3)和人类b细胞淋巴瘤(dohh‑2)。[0207]慢病毒的生成[0208]慢病毒转导载体p‑ubic‑luc2‑lres‑puro和p‑cmv‑copgfp‑ires‑puro分别允许由ubic启动子驱动的荧光素酶或由cmv启动子驱动的copgfp的表达。根据制造商的说明，使用2g利用脂质体2000(lipofectamine2000)(生命技术公司(lifetechnologies))作为转导试剂的转导载体和10μg包装质粒pmdl、pvsv‑g、prev(罗氏(roche))在t75烧瓶中通过对hek293‑tn细胞进行瞬时共转导产生复制缺陷型慢病毒颗粒。转导48小时后得到病毒颗粒，低速离心去除细胞碎片，使用peg沉淀。通过离心浓缩病毒颗粒并在‑80℃下储存。[0209]细胞系的慢病毒转导[0210]贴壁细胞以每孔1.5e 05的剂量接种到适当培养基的96孔板中。培养24小时后(37℃，具有5％二氧化碳(co2))更换培养基，并如所述用指定浓度的佐剂(即泊洛沙胺)处理细胞，如图所示。然后用慢病毒(lv)载体以moi15(每个细胞感染病毒颗粒的多重性)指标表达荧光素酶或copgfp以转导细胞，并在37℃、5％co2环境的细胞培养箱中，无需更换培养基，培养72小时。按上述方法接种悬浮细胞，并转导相同的天数，在moi15下，接种如上相同的lv。在特定的情况下，接种了细胞的板子在转导(旋转接种)后直接以800g离心60分钟。[0211]转导效率的量化[0212]使用荧光素酶量化总的转基因病毒表达量。在病毒转导3天后向细胞中加入100ul稳态球蛋白(steady‑glo)试剂(普洛麦格(promega))，将有细胞的板子放入tecaninfinitem200酶标仪中，摇动30秒钟。在室温下培养10分钟后，通过酶标仪测量发光信号。测量值以相对光单位(rlu)表示。[0213]分析利用copgfp表达载体以转导细胞的转导率。转导3天后，使用具有10倍物镜的荧光显微镜(具有dfc3000g相机的徕卡dmilled)采集每个加样孔的随机图像。将lug/mlhoechst33342加入培养基中，在37℃下培养15min以复染细胞.统计copgfp和hoechst所表达的细胞，用gfp表达的细胞数除以hoechst染色的细胞数以计算转导率。[0214]mtt比色法(细胞活性)[0215]mtt比色法检测佐剂的细胞毒性。将a2780细胞接种于96孔板中，细胞是用浓度为从0.031mg/ml至20ml/ml的佐剂处理的细胞。于37℃，5％的co2环境下培养72小时后，向细胞中加入20mlmtt试剂(2.5mg/ml)，于37℃培养4h，每孔加入100ul十二烷基硫酸钠(sds)的裂解液(10％十二烷基硫酸钠溶于0.001n盐酸中)并在37℃下培养24小时。在酶标仪上测量560/690nm处的吸光度。在存活的健康细胞中的依赖nad(p)h的细胞氧化还原酶，将mtt还原到其不溶性形式，这可在酶标仪中测量；吸光度的降低表明了健康细胞的数量的减少。[0216]实施例3的材料和方法[0217]从三个独立供体的外周血单核细胞(pbmcs)中分离人类cd34 造血干细胞。为了进行转导，细胞以每孔2x10e6个细胞接种到在补充有stemmacshsc扩增混合物(expansioncocktail)的stemmacshsc扩增培养基中的12孔板中。接种后第二天，在cmv启动子作用下，通过慢病毒载体表达gfp，以moi1，转导细胞。在转导之前，单独添加最终浓度为1mg/ml的泊洛沙胺t1107或将其结合5ug/ml硫酸鱼精蛋白(ps)一起添加。对于每个供体，用不含增强剂的病毒进行对照转导(仅病毒)。对于转导，在室温下以600g进行90分钟的旋转接种。[0218]在转导后24小时，用pbs洗涤细胞两次并更换培养基。在转导后第9/10天，通过流式细胞仪分析gfp表达和转导细胞的百分率。[0219]此外，在转导后第9/10天，使用qiamp‑dna微试剂盒从转导细胞和对照细胞中分离基因组dna(gdna)，并通过ddpcr分析每个细胞中整合的病毒载体基因组(载体拷贝数，vcn)的数量。为了检测整合的病毒载体基因组，使用ddpcrpre特异引物和作为对照的单拷贝基因rpp30(英斯路(hauber)等，2018)。[0220]实施例2[0221]结果[0222]泊洛沙胺增强在粘附细胞中的转导[0223]为了分析泊洛沙胺对慢病毒载体的转导效率的影响，以指定浓度向粘附细胞中添加泊洛沙胺t908、tl107、t1307，随后，在moi15下通过慢病毒表达荧光素酶转导这些细胞。作为对照组，在转导前向孔中添加仅病毒(用h2o代替佐剂)或8mg/ml聚凝胺。所有条件都设置三组。转导后3天，通过酶标仪上测定荧光素酶的活性来评估转导率。结果以相对发光单位(rlu)表示。在浓度为5mg/ml和0.31mg/ml之间时，对于t908、tl107和t1307，浓度为5mg/ml和0.31mg/ml之间时，转导后其转基因表达分别比仅病毒的提高213倍、2.55倍和2.91倍。就所有聚合物，对a2780细胞的最大影响是在0.63mg/ml时(图1a和1b)。[0224]这种转导测试也在粘附的人类肺腺癌细胞系nci‑h1838中复制。通常，通过荧光素酶活性测定的转导水平低于a2780细胞(图1c)。我们仍然可以观察到，与不含转导增强剂的病毒转导相比，添加泊洛沙胺可使转导效率提高2.86倍(t1107在0.63mg/ml时)，2.77倍(t1307在0.31mg/ml时)和2.68倍(t908在0.31mg/ml时)(图1d)。[0225]泊洛沙胺和硫酸鱼精蛋白对转导增强有加性效应[0226]为了测量迭加效应，加入1mg/ml的泊洛沙胺t1107、t1307或t908作为添加剂，用copgfp表达慢病毒来转导a2780细胞。此外，使用每种浓度为1mg/ml的泊洛沙胺与5ug/ml或40ug/ml硫酸鱼精蛋白的结合，或1mg/ml泊洛沙胺，来分析迭加效应。在每个孔中，拍摄6张图像(图2d显示了tl107的实施例)，计数copgfp表达的细胞，并与用hoechst33342染料染色的总细胞数进行比较。图2a‑c显示了每个条件下3个孔的gfp表达细胞的平均百分比和标准偏差。与仅病毒(聚凝胺)相比，使用的所有转导增强剂均单独使用可以将慢病毒的转导提高1.67倍(图2a‑c)。泊洛沙胺t1107、t1307和t908在1mg/ml时，转导细胞百分率分别比仅病毒提高2.46倍、2.54倍和2.68倍。有趣的是，发现t1107与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用比单独使用tl107转导的细胞提高1.43倍(图2a)。同样对于t1307和t908，我们观察到泊洛沙姆与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用比单独使用泊洛沙姆分别将转导率显著提高了1.49倍和1.71倍(图2b和2c)。与单独使用40ug/ml硫酸鱼精蛋白相比，也可以看到这样的提高。泊洛沙胺与其他药物的结合，并未显示出任何显著的改善效果。[0227]为了证实这种迭加效应对总转基因表达水平的有作用，用慢病毒表达荧光素酶来进行慢病毒转导。在上述实验中使用的各个浓度以及泊洛沙胺与所有其他转导增强剂的组合也同样被使用。[0228]转导增强剂单独将总的转基因表达提高了1.14倍(5ug/ml硫酸鱼精蛋白)至2.08倍(40ug/ml硫酸鱼精蛋白)(图2e‑g)。与仅病毒相比，泊洛沙胺t1107、t1307和t908使转基因表达水平分别提高了1.54、1.51和1.58倍(图2e‑g)。能够证实，与单独使用泊洛沙胺相比，泊洛沙胺与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用提高了转导能力。t1107、t1307和t908与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用，与单独使用泊洛沙胺相比，将转基因表达分别提高了1.96、2.11和1.89倍(图2e‑g)。与其他泊洛沙胺的共同使用没有显示出任何显著改善。[0229]泊洛沙胺增强悬浮细胞的转导[0230]许多在临床前研究中建立的肿瘤细胞系使用普通病毒和非病毒工具只能提供较差的转导率。在悬浮培养中生长的间变性大细胞淋巴瘤(alcl)细胞系属于这种难以感染的肿瘤细胞系亚群。在感染lv过程中，采用改良方案，包括可选的旋转接种步骤，测试到泊洛沙胺对慢病毒感染的促进作用。在hut78人类皮肤t淋巴细胞悬液细胞上首次评价了使用和不使用旋转接种对泊洛沙姆的转导效率的增强作用。用慢病毒表达荧光素酶进行转导，以测定对总转基因表达的影响。泊洛沙胺在5mg/ml～1.25mg/ml范围内达到最大转导率，在较低浓度下所述转导率降低。不采用旋转接收时，荧光素酶信号比仅病毒的对照的最大改善达到3.53倍(t908，5mg/ml)、15.98倍(t1107，2.5mg/ml)和4.85倍(t1307，2.5mg/ml)(图3a c)。采用旋转接种后，最大改善率分别为4.08倍(t908，2.5mg/ml)、5.06倍(t1107，1.25mg/ml)和4.32倍(t1307，1.25mg/ml)(图3b d)。总的来说，转基因的表达水平明显低于粘附a2780细胞。与不采用旋转接种相比，采用旋转接种的表达水平的提高达到2.6倍(图3c与3d相比)，但与粘附细胞相比，总转基因表达水平仍然相对较低(图1)。[0231]还对另外两个悬浮细胞系进行了测试，即，jvm‑3(人类慢性b细胞白血病)和dohh‑2(人类b细胞淋巴瘤)。在jvm‑3细胞中，我们观察到t908在20mg/ml时的最大转导增强达到2.46倍，t1107在10mg/ml时的最大转导增强达到2.17倍，t1307在20mg/ml时的最大转导增强达到2.47倍(图4a b)。在dohh‑2细胞中，与仅病毒相比，观察到增强倍数分别为2.26倍(t908，20mg/ml时)、2.42倍(t1107，20mg/ml时)和3.29倍(t1307，20mg/ml时)(图5a b)。在所有使用条件下，jvm‑3细胞的总转基因表达水平高于dohh‑2细胞。对于jvm‑3和dohh‑2，悬浮细胞系在浓度为10mg/ml和20mg/ml之间的效果最强。总的来说，这两种悬浮细胞系在转导后的转基因表达水平也明显低于粘附a2780细胞。[0232]细胞活性[0233]对于基因治疗应用中的转导增强子的应用，重要的是所使用的物质不影响活性和对细胞没有毒性作用。[0234]mtt比色法是一种评估细胞代谢活性的比色测定方法。四唑类染料mtt(3‑(4,5‑二甲基噻唑‑2‑基)‑2,5‑二苯基四唑溴化胺)被细胞氧化还原酶还原成不溶性的甲瓒，甲瓒呈紫色，可通过吸光度测量进行定量测量。为了测试对细胞活性的影响，将用于增强转导的最终浓度为20mg/ml至0.31mg/ml的泊洛沙胺添加到细胞中，并在3天后通过mtt比色法测定细胞活性。然后将其吸光度值与仅培养基或水的对照进行比较。t908的存活率在69％到90％之间，在0.31mg/ml时，存活率最高。形态学上没有观察到细胞凋亡。t1107的存活率在99％和116％之间，在20mg/ml时存活率最高。对于t1307可以观察到类似的结果：t1307的存活率为84％(0.31mg/ml)和109％(20mg/ml)之间(图3(a)和(b))。高于100％的数值表明这些细胞比对照组具有更多的酶活性和更高的活性。对于t1107和t1307，在超过5mg/ml的高浓度下超过100％的活性值可以表明，这些泊洛沙胺对细胞的生长或酶活性有积极影响。t908较低的存活率并不能明确的指向毒性作用，因为我们无法观察到细胞凋亡的形态学特征。而，这很可能表明t908影响了细胞的代谢活性。[0235]实施例3[0236]增强转导和vcn[0237]为了检测泊洛沙胺t1107对细胞转导的促进作用，从3个不同供体获得人类cd34 pbmcs，以每孔2x10e6细胞接种到12孔板中。第二天，以moi1，用慢病毒表达gfp转导细胞，以600g90分钟进行旋转接种。作为转导增强剂，在病毒感染前单独添加1mg/mltl107或共同添加1mg/mltl107与5ug/ml硫酸鱼精蛋白(ps)。转导后第9/10天，用流式细胞仪(facs)分析gfp表达细胞的百分率。比较使用转导增强子的转导的gfp 细胞百分比与使用仅病毒转导的gfp 细胞的百分比。该比率表征了相对传导增强情况。[0238]在第9/10天观察到，与仅病毒相比，单独使用1mg/mlt1107可使转导显著增强3.95倍。t1107与浓度为5ug/mlps的共同使用，相较于仅病毒，其转导率进一步提高了5.09倍(图1)。这一结果表明，t1107与ps共同使用的转导增强效果比单独使用t1107的效果好28.6％。[0239]此外，在通过ddpcr转导后的第9/10天，分析每个细胞的载体拷贝数(vcn)。vcn数描述整合到靶细胞中的转基因拷贝的平均数。单独使用病毒转导，vcn达到0.07，而添加1mg/mltl107的vcn则达到0.3。t1107与5μg/mlps共同使用进一步将vcn增加到0.43。单独添加tl107或与ps共同添加，与仅病毒相比，vcn分别增加4.44倍和6.28倍(图2)。t1107与ps共同使用比单独使用tl107可使vcn提高41.2％。这些结果清楚地表明，相较于单独使用病毒，添加1mg/mlt1107可显著增强慢病毒转导中的vcn。此外，t1107与ps共同使用vcn更加提高。[0240]参考文献[0241]阿拉霍夫、瓦莱里、埃夫盖尼·克林斯基、李胜民和格热戈尔斯·皮特津斯基，1999年。以嵌段共聚物为基础的阿霉素制剂。从细胞筛选到临床试验。[0242](alakhov,valery,evgueniklinski,shengminli,andgrzegorzpietrzynski.1999."blockcopolymer‑basedformulationofdoxorubicin.fromcellscreentoclinicaltrials.")[0243]胶体和表面b:生物界面16:113‑34。[0244]阿尔瓦雷斯·洛伦佐，卡门等，2010，《用于药物递送的泊洛沙明纳米材料》，《生物科学前沿》2:424‑40。[0245](alvarez‑lorenzo,carmenetal.2010."poloxamine‑basednanomaterialsfordrugdelivery."frontiersinbiosciences2:424—40.)[0246]阿纳斯塔索夫，娜塔莎等，2009，“使用慢病毒载体介导的转移将shrna高效递送到b和t淋巴瘤细胞中”，《血液病理学杂志》2(1)：9‑19.2010。“alk阳性间变性大细胞淋巴瘤中的c/ebpbeta表达是细胞增殖所必需的，并由stat3信号通路诱导。”haemato/ogica95(5)：760‑67。[0247](anastasov,natasaetal.2009."efficientshrnadeliveryintobandtlymphomacellsusinglentiviralvector‑mediatedtransfer."journalofhematopathology2(1):9‑19.2010."c/ebpbetaexpressioninalk‑positiveanaplasticlargecelllymphomasisrequiredforcellproliferationandisinducedbythestat3signalingpathway."haemato/ogica95(5):760‑67.)[0248]奥宾、rj、m韦恩菲尔德和mc帕特森，1988。影响聚丁二烯辅助基因转移效率和重复性的因素〉，体细胞与分子遗传学14(2)：155‑67。[0249](aubin,rj,mweinfeld,andmcpaterson.1988."factorsinfluencingefficiencyandreproducibilityofpolybrene‑assistedgenetransfer."somaticcellandmoleculargenetics14(2):155‑67.)[0250]巴特尔，大卫p,2009.“微rnas：目标识别和调节功能”，《细胞》136(2)：215‑33。[0251](bartel,davidp.2009."micrornas:targetrecognitionandregulatoryfunctions."cell136(2):215‑33.)[0252]比肖夫、丹妮拉和肯尼思·科内塔。2010.“通过假定型慢病毒载体实现细胞靶向的灵活性”，《分子生物学方法》(克利夫顿，n.j.)614:53‑68。[0253](bischof,daniela,andkennethcornetta.2010."flexibilityincelltargetingbypseudotypinglentiviralvectors."methodsinmolecularbiology(clifton,n.j.)614:53—68.)[0254]布克林斯基，mi等.1993.“控制非分裂细胞感染的hiv‑i基质蛋白中的核定位信号”，《自然》365(6447)：666‑69。[0255](bukrinsky,mietal.1993."anuclearlocalizationsignalwithinhiv‑imatrixproteinthatgovernsinfectionofnon‑dividingcells."nature365(6447):666—69.)[0256]伯恩斯，jc等.1993.“水泡性口炎病毒g糖蛋白假型逆转录病毒载体：浓缩到非常高滴度和高效基因转移到哺乳动物和非哺乳动物细胞中”，《美国国家科学院学报》卷90(17)：8033‑37。[0257](burns,jcetal.1993."vesicularstomatitisvirusgglycoproteinpseudotypedretroviralvectors:concentrationtoveryhightiterandefficientgenetransferintomammalianandnonmammaliancells."proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica90(17):8033‑37.)[0258]卡斯特罗，ba，cd维斯，ld维奥特和ja利维。1988.从外周血单个核细胞中回收人类免疫缺陷病毒的最佳条件，临床微生物学杂志26(11)：2371‑76。[0259](castro,ba,cdweiss,ldwiviott,andjalevy.1988."optimalconditionsforrecoveryofthehumanimmunodeficiencyvirusfromperipheralbloodmononuclearcells."[0260]journalofclinicalmicrobiology26(11):2371—76.)[0261]基亚佩塔、迭戈a和亚历杭德罗·索斯尼克。2007.“聚(环氧乙烷)嵌段共聚物胶束作为药物递送剂：改善药物的水溶性、稳定性和生物利用度”，《欧洲药剂学和生物药剂学杂志》66(3)：303‑17。[0262](chiappetta,diegoa,andalejandrososnik.2007."poly(ethyleneoxide)‑poly(propyleneoxide)blockcopolymermicellesasdrugdeliveryagents:improvedhydrosolubility,stabilityandbioavailabilityofdrugs."europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics66(3):303‑17.)[0263]赵，恩熙，李政洙，和肯韦伯，2012.“作为组织密封剂的泊洛沙明水凝胶的配方和特性”，《生物材料学报》8(6)：2223‑32。[0264](cho,eunhee,jeoungsoolee,andkenwebb.2012."formulationandcharacterizationofpoloxamine‑basedhydrogelsastissuesealants."actabiomaterials8(6):2223‑32.)[0265]朱，康，肯尼思g科内塔和迈克尔j易康。2008.“使用基于hiv‑i的慢病毒载体将高效稳定的基因表达入人类破骨细胞”，《dna与细胞生物学》27(6)：315‑20。[0266](chu,kang,kennethgcornetta,andmichaeljecons.2008."efficientandstablegeneexpressionintohumanosteoclastsusinganhiv‑i‑basedlentiviralvector."dnaandcellbiology27(6):315‑20.)[0267]杜尔，t等.1998.“具有条件包装系统的第三代慢病毒载体”，《病毒学杂志》72(11)：8463‑71。[0268](dull,tetal.1998."athird‑generationlentivirusvectorwithaconditionalpackagingsystem."journalofvirology72(11):8463—71.)[0269]埃鲁科娃、余维罗尼卡、奥克萨诺、克鲁瓦，尤里n、安东尼科和尼科莱，梅利克努巴罗夫，2000。环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物对双层脂膜对小溶质(包括阿霉素)渗透性的影响〉，《生物化学与生物物理学学报‑生物膜》1468(1‑2)：73‑86。[0270](erukova,veronikayu,oksanao.krylova,yurin.antonenko,andnickolays.melik‑nubarov.2000."effectofethyleneoxideandpropyleneoxideblockcopolymersonthepermeabilityofbilayerlipidmembranestosmallsolutesincludingdoxorubicin."5biochimicaetbiophysicaacta‑biomembranes1468(1—2):73—86.)[0271]弗纳尔，大卫等，2013。“维克托福星‑1，一种新的病毒进入增强子，强烈促进人类造血干细胞的慢病毒转导。”分子治疗核酸2(3月)：e90。[0272](fenard,davidetal.2013."vectofusin‑l,anewviralentryenhancer,stronglypromoteslentiviraltransductionofhumanhematopoieticstemcells."moleculartherapynucleicacids2(march):e90.)[0273]芬克、萨布丽娜等，2008，“慢病毒载体进入靶细胞”，《分子治疗：美国基因治疗学会杂志》16(8)：1427‑36。[0274](funke,sabrinaetal.2008."targetedcellentryoflentiviralvectors."moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy16(8):1427—36.)[0275]格鲁伯，a等，2000，“由多重缺失的hiv‑i载体转导的树突状细胞在体外表现出正常的表型和功能，并引发hiv特异性细胞毒性t淋巴细胞反应”，《血液》96(4)：1327‑33。[0276](gruber,aetal.2000."dendriticcellstransducedbymultiplydeletedhiv‑ivectorsexhibitnormalphenotypesandfunctionsandelicitanhiv‑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背景技术：
：：3.对于大部分细胞，特别是原代细胞的遗传修饰，优选的方法是通过病毒载体的介导转导。尤其是，使用逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。具有水泡性口炎病毒(vsv‑g)的糖蛋白的假型慢病毒(lv)载体稳定地整合到增殖和非增殖细胞的染色体中(布克林斯基(bukrinsky)等，1993；伯恩斯(burns)等，1993；芬克(funke)等，2008)。lv的安全特性得到了改进，如第三代分裂基因组慢病毒的包装设计和转移载体3'长末端重复序列(ltr)的缺失等，使lv成为许多研究者青睐的系统(杜尔(dull)等，1998)。经转导的慢病毒细胞几乎不显示应激信号通路的激活或任何其他表型改变，因此有望在基因治疗和免疫治疗中得到广泛应用(格鲁伯(gruber)等，2000；鲁阿斯(rouas)，2002)。4.目前而言，在研究及临床实验中，涉及将lv基因有效传递到靶细胞的转导条件存在很大差异(米林顿(millington)等，2009)。众所周知，正常的淋巴细胞和原发性肿瘤，以及淋巴系的细胞系难以有效转导(阿纳斯塔索夫(anastasov)等，2009)(阿纳斯塔索夫(anastasov)等，2010)。为了大规模转导病人细胞，向原代细胞的高基因转移率和能够产生高滴度病毒颗粒的能力是临床试验的先决条件。由于大规模生产这些病毒是十分复杂和昂贵的(乌姆(wurm)等，2010)，对慢病毒转导率的每一项改进都将导致对病毒产量需求的减少，并将进一步有助于降低临床试验的成本。5.可以通过各种不同的策略实现更高的基因转移效率：通过超速离心法(伯恩斯(burns)等，1993)或超滤法(阿纳斯塔索夫(anastasov)等，2009)浓缩病毒上清液也是一种可能提高基因转移效率的方法。其他被频繁使用的、用于提高基因转移率的方法为添加不同的试剂，例如聚阳离子或阳离子脂质体。但是，大部分这些辅助疗法对于细胞而言是有毒的，限制了其用于原发灶的敏感的靶细胞(乌姆(wurm)等，2010)。在其他选项中，凝聚胺(一种线性聚阳离子聚合物)在大范围的靶细胞中提高了基因转导率，成为了本领域中一种主流的转导辅助试剂(卡斯特罗(castro)等，1988；海塞(hesse)，埃贝桑(ebbesen)和克里斯滕森(kristensen)，1978)。可惜，凝聚胺仅可作用于很短的应用时间，以及低于10ug/ml的浓度(取决于靶细胞的类型)，可用于避免细胞毒副作用和/或跨膜电位的显著调节(奥宾，尔德和帕特森(aubin,weinfeld,andpaterson)，1988)，这限制了其在敏感细胞，例如造血细胞中的使用。6.另一种提高病毒转导效率的常规方法为使用纤维连接蛋白，能够促进慢病毒和靶细胞共定位的重组人纤维连接蛋白片段(李(lee)等，2009)。7.vectofusin‑1是一种相对较新的病毒转导增强子。它源于lha4肽族，是一种富含组氨酸的阳离子两亲性肽(弗纳德(fenard)等，2013)。它的作用是促进病毒和细胞膜之间的贴壁和融合，并被证明可以改善人类造血干细胞和祖细胞(hspcs)的转导(弗纳德(fenard)等，2013；因戈劳(ingrao)等，2014)。8.进一步的，将病毒添加到细胞后，直接离心接种(通常称为“旋转接种(spinoculation)”)被转导的细胞也可以加强转导(郭(guo)等，2011)。研究表明，离心诱发动态肌动蛋白和丝切蛋白的活性，导致hiv‑1受体和cd4和cxcr4共同受体的上调(郭(guo)等，2011)。旋转接种也可以与转导增强子共同使用以进一步增强转导效率。9.然而，另一种将治疗相关的物质传递到细胞的方法是将其包装成生物大分子或聚合物。对于如细胞外因子的蛋白质，已被证明将其包装成脂质体或磷脂和胆固醇可以增强稳定性和活性，从而提高在靶细胞上的生物活性(莫雷尔(morrell)等，2008；蒂伊叙兹(tüysüz)等，2017)。核酸也可以通过直线的(卡巴诺夫·朱和阿拉霍夫(kabanov,zhu,andalakhov)2005；勒米厄和盖琳(lemieuxandguerin)2000；马哈詹(mahajan)等，2017；宋(song)等，2014)和支链的两亲性共聚物实现非病毒式转移至细胞。进一步的，多种共聚物已经被证明有助于溶解疏水性药物胶束，以将其传递至靶细胞(阿卡霍夫(alakhov)等，1999；阿尔瓦雷斯·洛伦佐(alvarez‑lorenzo)等，2010；基亚佩塔和索斯尼克(chiappettaandsosnik)，2007；埃鲁科娃(erukova)等，2000)。这些聚合的物质除其他外，包括聚乙二醇(peg)、聚环氧丙烷(ppo)、聚乳酸(pdlla)、泊洛沙姆和泊洛沙胺。将药物封装在胶束的疏水内芯内可显著增加药物的溶解性、稳定性和被靶细胞吸收的能力。10.cas9蛋白质sgrna核糖核蛋白(rnp)的复合物已经被证明对有效的基因修饰，同时将潜在的脱靶效应降至最低有价值(冈迪(gundry)等，2016)。非病毒聚合物传递系统(如泊洛沙胺和其他聚合物)可作为有价值的工具，将rnp传递到靶细胞中，以纠正体外和体内遗传缺陷(可汗(khan)等，2016)。11.近期，已经进一步开发出了的非逆转录病毒载体，并被用于基于包膜疱疹病毒的基因转导载体，这样的包膜疱疹病毒包括hsv‑1、恒河巨细胞病毒(rhcmv)和mcmv，其神经基因转导能力和作为疫苗载体的良好特性而受到高度关注(汉森(hansen)等，2011年；马可尼(marconi)、曼塞维吉(manservigi)和爱泼斯坦(epstein)，2010年；莫尔(mohr)等，2010年)。近期，源自属于沙粒病毒科的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(lcm)病毒的病毒载体在同源和异源疫苗接种方案中诱发了有效的免疫应答(温格苏(wingerath)等，2017年)。技术实现要素：12.本发明所要解决的技术问题为提供一种用于病毒载体转导细胞的改进手段和方法。13.通过提供权利要求书中所描述的实施例实现上述技术问题的解决方案。14.相应地，本发明的第一方面，涉及一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)逆转录病毒载体和/或(ii)脊椎动物细胞。15.有关于所述第一方面，本发明提供一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)包膜病毒载体和/或(ii)脊椎动物细胞。16.有关于所述第一方面，本发明提供一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)逆转录病毒载体和(ii)脊椎动物细胞。17.进一步的，本发明提供一种组合物，包括或由下述组分组成：(a)泊洛沙胺；以及(b)(i)逆转录病毒载体和(ii)脊椎动物细胞；其中，所述泊洛沙胺的浓度范围为从约0.1至约40mg/ml。18.术语“泊洛沙胺”有其学术既定的含义。本发明涉及含中心1,2‑乙二胺的两亲性嵌段共聚物，其中，任一氮原子的两价被基团取代，每个所述基团均包含多个环氧乙烷和/或环氧丙烷构筑块。进一步解释地，所述基团包含大量通过醚键连接的环氧乙烷和/或环氧丙烷构筑块，其优选实施例如下式(i)所示。虽然，本发明在这方面没有要求，优选地，所述基团中的每一个都包含环氧乙烷和环氧丙烷构筑块。在所述构筑块包括环氧乙烷和环氧丙烷的程度上，所述基团优选考虑分为两部分，即仅由环氧丙烷构筑块组成的部分和仅由环氧乙烷构筑块组成的第二部分。同样地，本发明在这方面也没有要求。因此，还可以想象的是，一个或多个基团为，其中的环氧乙烷和环氧丙烷构筑块是交替排列的链，或者其中的环氧乙烷和环氧丙烷构筑块是随机排列的链。19.在所述取代基具有上述定义的二分结构的程度上，即，一部分仅由环氧乙烷单元结构组成和第二部分仅由环氧丙烷构筑块组成，则优选考虑由环氧丙烷构筑块组成的部分直接与氮原子结合，以及由环氧乙烷构筑块组成的部分位于远离氮原子的位置(也被称为“序贯泊洛沙胺”(sequentialpoloxamines))。如下所示的式(i)的优选实施例中也描述了这一特征。20.尽管不是特别优选的，但在本发明范围内，在单个泊洛沙胺分子内的四个如上所述的取代基各自具有不同的结构。例如，所有四个取代基可以都是环氧乙烷和环氧丙烷构筑块(不同的)的无规共聚物。在另一实施例中，两个基团可具有二分结构，其中的近氮端部分由环氧丙烷构筑块组成，且远氮端部分由环氧乙烷构筑块组成，另外两个基团可仅由环氧乙烷构筑块或环氧丙烷构筑块组成。21.在上述的一类分子中，氮原子上的三价被占据。氮原子上的四价被占据，并且氮原子带正电荷也在本发明的所述范围内。在这种情况下，优选存在一个或多个反离子，使物质的组合物呈电中性。占据所述泊洛沙胺的一个或两个氮原子的第四价的基团优选为氢、低级烷基、低级烯基或低级炔基。本文中的术语“低级”优选地指cl到c6(在烯基和炔基的情况下指c2到c6)，优选为cl到c4(在烯基和炔基的情况下指c2到c4)。特别优选地，烷基基团是甲基、乙基、正丙基和异丙基。如果两个氮原子都是四价的，则占据两个氮原子上的第四价的基团优选相同。特别优选地，这两个氮都是四价的，并且两个氮原子的第四价上对应的基团都是甲基。22.进一步设想，占据一个或两个氮原子上的第四价的取代基包括环烷基，所述环烷基包括环己基、芳基、芳基烷基、杂芳基和杂芳基烷基。所述芳基优选为苯基。芳基烷基和杂芳基烷基中的烷基优选为甲基和乙基。优选的杂芳基为六元环，所述六元环具有一个、两个或三个分别选自n、s和o的杂原子。所述环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基和杂芳基烷基中的任何一种都可以是被取代的或未被取代的。优选地，取代基包括低级烷基、低级烷氧基和卤素。本文中，“低级”具有与上述定义相同的含义(cl到c6，优选cl到c4)。卤素包括氟、氯和溴。23.所述组合物可以包括一种泊洛沙胺。也可以包括两种、三种、四种、五种或更多不同种的泊洛沙胺。24.所述反离子优选为类卤素离子，包括氟离子、氯离子、溴离子和碘离子。进一步优选的，所述反离子包括硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐以及其他一元羧酸(例如甲酸盐、丙酸盐和丁酸盐)的阴离子。水杨酸盐是另一种预想的反离子，优选为药物上可接受的反离子。25.在最为宽泛的定义中，环氧乙烷构筑块和环氧丙烷构筑块的比率没有特别的限制。在优选实施例中，所述比例为约0.05至约1.5。下文结合优选实施例进一步公开更优选的环氧丙烷‑环氧乙烷的比率。它们对根据本发明中泊洛沙胺最广泛的定义进行了必要的变更。26.泊洛沙胺被认为是制备小分子药物或普通dna质粒的试剂。然而，关于将泊洛沙胺用于转导包括逆转录病毒和慢病毒的包膜病毒，在现有技术中则是空白的。本文给出的结果表明，泊洛沙胺在提高利用慢病毒和逆转录病毒载体的脊椎动物细胞转导中具有惊人的特定的高活性。27.从本发明的其余部分可以明显看出，根据本发明，所述泊洛沙胺用作转导增强剂。所述泊洛沙胺不用作赋形剂、分散剂或粘度调节剂。28.可选的，所述组合物不含有其他转导增强剂，即，其仅包含一种或多种泊洛沙胺作为增强转导的试剂。在替代方案中，可存在其他的转导增强剂，尤其是属于除泊洛沙胺以外的化合物种类的转导增强剂。将进一步在下文中描述这样的转导增强剂的优选实施例。29.在考虑到泊洛沙胺的程度上，所述组合物是一种溶液。换句话说，它不是凝胶。30.并且，可以理解的是所述组合物是独立的。换言之，它不是包含细胞的组合物，这种细胞指的是例如，仅可在人类或动物体内，在给药不含细胞的相应组合物时形成的细胞。31.病毒载体是由天然存在的病毒衍生的粒子。天然存在的病毒通常包括核酸和蛋白质。包膜病毒还包括通常源于宿主细胞脂双层，且通常包括病毒包膜蛋白质。根据本发明，对病毒载体的最低要求是具有所述病毒包膜蛋白质的所述脂双层。可以，但也不必一定存在核酸和/或进一步的蛋白质。术语“核酸”指原始病毒核酸、异源核酸或其结合。至于逆转录病毒载体，所述病毒核酸为rna。所述核酸可进一步包含至少一个衍生自逆转录病毒的长末端重复(ltr)序列和包装信号序列。可选地，所述核酸可进一步包含诸如rre序列的遗传因子。就目前而言，所述蛋白质可进一步，包括逆转录酶、整合酶和衣壳蛋白。所述整合酶可以是整合缺陷型的。32.相应地，所述术语“衍生物”和“衍生于”至少指下述修饰：将异源核酸导入病毒的遗传物质中，或者使用异源核酸序列替换所有或者部分病毒的编码基因，以及允许在病毒粒子中包装所述异源核酸。次优选地，但不含任何包装的病毒衍生核酸的天然存在的病毒或病毒样粒子被归入术语“病毒载体”之中。因此，另一实施例为病毒样粒子(vlp)。病毒样粒子不具传染性，既不含病毒遗传物质，也不含异源核酸。它们产生于病毒结构和/或辅助蛋白(如包膜或衣壳蛋白)的表达，这可导致病毒样颗粒(vips)的自组装。逆转录病毒和慢病毒衍生的vlps用于传递重组蛋白，可实现高产量(罗伯特(robert)等，2017)。33.外来体是脂双层封闭的细胞外载体，所述细胞外载体可用于在细胞间运输蛋白质、核酸和脂类(科瓦尔(kowal)、特卡奇(tkach)和泰瑞(théry)，2014)。这些外来体也可以使用病毒糖蛋白vsv‑g假型(pseudotyped)，以改善向哺乳动物细胞的传递(迈耶(meyer)，2017)。基于这些性质，外来体被提出可以用于基因治疗的应用中(奥洛林(o'loughlin)、沃(retroviruses,coffinjm,hughessh,varmushe,coldspringharbor(ny):coldspringharbourlaboratorypress；1997；isbn‑10:0‑87969571‑4)(马崔(matraí)、蔡(chuah)和范登德里斯切(vandendríessche)，2010；奥康奈尔(o'connell)等，2010)。慢病毒载体可以基于，例如牛、马、猫、绵羊/山羊或灵长目动物慢病毒组的组中的慢病毒。优选地，慢病毒载体基于灵长目动物慢病毒，例如hiv1、hiv2或siv病毒。最优选的是，慢病毒载体基于hiv1慢病毒。如本领域技术人员所知，大多数(市售)慢病毒载体表示来自不同病毒的病毒成分的混合物，因此在某种程度上是“杂交的”载体。例如，慢病毒载体可包含来自hiv1(人类免疫缺陷1病毒)、vsv(水泡性口炎病毒)、cmv(巨细胞病毒)、whv(土拨鼠肝炎病毒(whp))病毒的成分。因此，根据本发明还可以预想为假型载体。41.在更优选的实施例中，慢病毒载体为使用vsv‑g假型的；具有与vsv‑g融合的抗体片段或蛋白质支架，例如cd3‑vsv‑g、cd4‑vsv‑g、cd8‑vsv‑g、cd34‑vsv‑g、cd30‑vsv‑g、cd44‑vsv‑g、egfr‑vsv‑g；和/或转铁蛋白受体(tnfr)。42.病毒载体内容中的术语“假型”是本领域中众所周知，例如在下述文章中所描述(比朔夫(bíschof)和科内塔(cornetta)，2010)。假型指通过整合外来的病毒包膜糖蛋白(gp)来调节病毒载体的细胞类型特异性，包括但不限于rd114、galv、lcmv、mlv、gp160、马传染性贫血病毒(eiav)gp、猫免疫缺陷病毒(fiv)gp、狂犬病病毒糖蛋白(rv‑g)，融合糖蛋白e型(fug‑e)gp((参见，当今基因疗法，5，387‑398(2005))(currgenether.5,387‑398(2005))).使用这种方法，可以改变宿主嗜性和/或降低或提高病毒的稳定性。例如，水泡性口炎病毒的糖蛋白g(vsv‑g)可用于假型慢病毒，如下述文章中所述(伯恩斯(burns)等，1993)。使用vsv‑g可有利于实现各种细胞类型的转导，然而，转导效率因细胞类型而异，并且对于难以转导的细胞(例如原始淋巴细胞和淋巴瘤细胞系)转导效率尤其低。43.根据本发明的“靶细胞”可以是任何被设定为使用病毒载体转导的目标的细胞。于本发明中所使用的术语“细胞”可指单个和/或独立的细胞、培养中的细胞或作为多细胞实体(例如组织或生物体)的一部分的细胞。换言之，该方法可在体内、离体或体外执行，优选为离体或体外。所述细胞优选为脊椎动物细胞。44.优选地，所述细胞为哺乳动物细胞。本文所使用的术语“哺乳动物细胞”是本领域中众所周知的，指属于或衍生于属于哺乳动物纲的动物的任何细胞。取决于通过本发明的方法转导以修饰哺乳动物细胞的基因组所要实现的特定目标，可以使用不同哺乳动物亚纲的细胞，如原兽亚纲或真兽亚纲。例如，在真兽亚纲中，优选下纲真兽亚纲动物的细胞，尤其是，灵长目、偶蹄目、奇蹄目、啮齿目和兔形目动物的细胞。45.进一步地，在一个物种内，可以根据组织类型和/或平等分化的能力来选择细胞，这取决于依照本发明的方法，通过转导靶细胞以修饰基因序列所要实现的目标。哺乳动物身体由三种基本的细胞种类组成：生殖细胞、体细胞和干细胞。生殖细胞是产生配子的细胞，因此可以代代相传。干细胞是可以分裂和分化成不同的特化的细胞类型，也可以自我更新产生更多的干细胞。哺乳动物的干细胞主要有两种：胚胎干细胞和成体干细胞。体细胞包括所有不是配子细胞、配子母细胞或未分化干细胞的细胞。哺乳动物的细胞也可以根据它们的分化能力来分组。全能性的(也称为有无限能力的)细胞是一种能够分化成成年生物体的所有细胞类型的细胞，这些细胞类型包括胎盘组织，如受精卵(受精卵母细胞)和随后的卵裂球，而例如胚胎干细胞的多能细胞不能分化成胚胎外组织，如胎盘，但有可能分化为三种胚层，内胚层、中胚层和外胚层中的任一层。多能祖细胞具有从多个但数量有限的细胞谱系中产生细胞的可能。此外，还存在仅能发育成少数细胞类型的寡能性细胞和仅能发育成一种细胞类型的单能性细胞(有时也称为前体细胞)。有四种基本的组织类型：肌肉组织、神经组织、结缔组织和上皮组织，本发明方法中所使用的细胞可以从中衍生得到，例如造血干细胞或神经干细胞。优选地，不从人类胚胎中获得的人类细胞，特别是不使用破坏人类胚胎的方法获取的人类细胞。另一方面，人类胚胎干细胞由技术人员来处理，例如从市面可购得的现有胚胎干细胞系中获取。因此，本发明可以在无需使用或破坏人类胚胎的情况下使用人类胚胎干细胞。或者，也可以使用类似于胚胎干细胞的多能细胞(如诱导多能干细胞(ips))来代替人类胚胎干细胞，其产生代表了技术发展的现状(哈格斯(hargus)等，2010；杰尼斯(jaenisch)和杨(young)，2008；高桥(takahashi)和山中(yamanaka)，2006)。46.在优选实施例中，所述靶细胞为选自由淋巴细胞、肿瘤细胞、淋巴系细胞、神经元细胞、上皮细胞、内皮细胞、原始细胞、干细胞组成的组的细胞。47.术语“淋巴系细胞”是指参与淋巴细胞和淋巴细胞本身的生成的细胞。术语“淋巴细胞”是指本领域公知的小淋巴细胞(b和t淋巴细胞、浆细胞)和自然杀伤细胞。淋巴系细胞进一步包括例如淋巴树突状细胞以及诸如前淋巴细胞、淋巴母细胞、普通淋巴祖细胞等淋巴细胞祖细胞。48.根据本发明且本领域公知的，“肿瘤细胞”指参与良性、癌前或恶性肿瘤形成的赘生细胞。恶性肿瘤细胞通常被称为癌细胞，可能有转移或扩散到邻近组织的能力。肿瘤细胞优选为胰腺肿瘤细胞(例如，aspc‑1和panc‑i细胞)、卵巢癌细胞系(例如，a2780)、淋巴瘤细胞系(例如，karpas‑299、sudhl‑i、sup‑m2、supt‑1、jvm‑3、jeko‑l、dohh‑2、hut‑78和sr‑786细胞)、皮肤黑色素瘤细胞系(例如，a375)和乳腺癌细胞(例如，mcf7，mda‑mb‑361和t47d细胞)和直接衍生于肿瘤的原始细胞。[0049]“神经元细胞”是本领域公知的，是指通过电信号和化学信号传递信息的电易激细胞。存在各种特殊的神经元细胞，例如感觉神经元和运动神经元。例如，根据本发明，篮细胞、贝茨细胞、中度棘神经元、浦肯野细胞、锥体细胞、闰绍细胞、颗粒细胞或前角细胞可以用作靶细胞。“神经元肿瘤细胞”是起源神经元的肿瘤细胞，例如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤和其他衍生于神经元谱系的恶性肿瘤。可以使用神经胶质瘤细胞系(例如，u87和ln18)。[0050]术语“干细胞”是本领域中公知的，并且已在上文中详细描述。根据本发明方法，优选使用的干细胞，例如，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经干细胞、癌症干细胞、诱导多能干细胞(ips)。[0051]术语“上皮细胞”是本领域中公知的。上皮细胞分布在全身的腔体和结构表面上，也形成许多腺体。上皮组织可分为单层上皮(一个细胞厚)和复层上皮(多层细胞)。上皮细胞按其形态可分为鳞状上皮细胞、立方上皮细胞、柱状上皮细胞和假复层上皮细胞。例如，人类的胃和肠中分布有上皮细胞。此外，上皮细胞系还包括乳腺癌细胞(例如mcf7、mda‑mb‑361和t47d细胞)或细胞系he‑kt293t的细胞。[0052]术语“内皮细胞”是本领域中公知的，指分布在血管内表面的细胞，并且在本文中没有其他含义。存在各种各样的内皮细胞，例如ea.hy96、huvec和hcaec细胞。[0053]本文所使用的术语“原始细胞”是本领域所公知的，指已经从组织中分离并且已经在体外培养的细胞。相应的细胞经历了非常少的(如若有)群体倍增，因此与连续细胞系相比，它们更能代表他们所衍生于的组织的主要功能成分，从而代表一个更具代表性的处于体内状态的模型。从各种组织获得样品的方法和建立原始细胞系的方法在本领域是公知的(参见例如，琼斯和怀斯，方法分子生物学，1997(jonesandwise,methodsmolbiol.1997))。用于本发明方法中的原始细胞衍生于，例如，血液、淋巴瘤和上皮性肿瘤。原始细胞也包括从组织中分离出来的以及通过慢病毒转导使基因稳定整合到基因组中而永生化的细胞。这些基因包括cdk‑2、cdk4、cdk‑6、htert、sv40大t抗原、bmi1、hpv16e‑6/7或两个或更多所述基因的任何组合。[0054]关于使用病毒载体，特别是使用逆转录病毒载体进行的转导，原始细胞、淋巴细胞、淋巴系细胞和神经细胞被认为是难以转导的。[0055]在更优选的实施例中，淋巴细胞是原始淋巴细胞和/或肿瘤细胞是造血肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞或上皮肿瘤细胞。[0056]优选的，所述上皮肿瘤细胞源于乳腺肿瘤细胞。本领域所公知的，后者细胞以及上述原始细胞、淋巴细胞和淋巴系细胞尤其难以使用逆转录病毒载体和包括腺病毒载体的其他病毒载体进行转导。相较于现有方法，使用本发明可以显著提高在上述细胞中的转导率。[0057]众所周知，人工培养的细胞可以是悬浮的或贴壁的，例如贴壁在细胞层或人工基质上。[0058]根据第一方面的所述组合物优选为所述泊洛沙胺的溶液和所述逆转录病毒载体和/或所述脊椎动物细胞的悬浮液。[0059]本发明人惊奇地发现泊洛沙胺可用作逆转录病毒的转导增强剂。逆转录病毒是包膜病毒，因此与小分子药物或核酸非常不同。[0060]泊洛沙胺的毒性很低或没有毒性；可见所附的实施例。与基于肽和蛋白质的转导增强剂相比，泊洛沙胺的生产成本相对较低，符合临床应用的gmp质量标准。一旦进入体内，通常在大约两到五周的时间范围内，泊洛沙胺会被水解降解，却不会产生有毒的降解产物(曹(cho)、李(lee)和韦伯(webb)，2012年)。泊洛沙胺的这些有益性质通过眼科学上的应用来进一步说明，如在下述文章中所述的，苏博文(subbaraman)等，2006和汤奇(tonge)等，2001。[0061]在一优选实施例中，(a)所述泊洛沙胺为序贯泊洛沙胺；和/或(b)具有式(i)中结构:[0062]r1r2n‑(ch2)2‑nr3r4(i)[0063]或者式(ii)中结构:[0064]r1r2r5n ‑(ch2)2‑n r3r4r6(ii)[0065]c‑l[0066]任一公式中，r1为h‑(o(ch2)2)a‑(och(ch3)ch2)b‑；[0067]r2为h‑(o(ch2)2)c‑(och(ch3)ch2)d‑；[0068]r3为‑(ch2ch(ch3)o)e‑((ch2)2o)f‑h；[0069]r4为‑(ch2ch(ch3)o)g‑((ch2)2o)h‑h；[0070]r5和r6各自为不存在或选自h、cl到c6烷基、c2到c6烯基和c2到c6炔基；其中，如果不存在r5或r6，则连接r5或r6的n不携带正电荷；[0071]c‑l代表一个或多个反离子，其使得式(ii)的结构呈电中性；[0072]a、c、f和h各自为从约25到约200、优选从约50到约120的整数；并且b、d、e和g各自为从约5到约50、优选从约10到约25的整数。[0073]术语“序贯泊洛沙胺”是一个本领域专有的术语，可以参见(阿尔瓦雷斯·洛伦佐((alvarez‑lorenzo)等，2010)中的图1。进一步解释地，序贯泊洛沙胺的特征在于，聚环氧丙烷构筑块被限制到与中心乙二胺基团的两个氮连接的四条链的那些片段上，其中的中心乙二胺基团直接附着到所述氮上。所述片段由聚环氧丙烷构筑块组成。换言之，在序贯泊洛沙胺中，四条链的末梢片段由聚环氧丙烷构成。[0074]反之，则适用于反序泊洛沙胺，根据本发明其并不是优选。[0075]根据上述，式(ii)的组合物也包括式(iia)的组合物：[0076]r1r2r5n ‑(ch2)2‑nr3r4(iia)[0077]c‑l[0078]优选的反离子已在上文中公开。[0079]如上述(b)项中所示的式(l)和(ii)描述了一种序贯泊洛沙胺，其中限定了构筑块(分别为环氧乙烷(eo)和环氧丙烷(po))的数量。优选的po/eo比率在下文中描述。[0080]通常而言，在本说明书中，术语“约”是指与该“约”后面的数值存在 /‑30％的平均偏差，优选 /‑25％、 /‑20％、 /‑15％、 /‑10％或 /‑5％。[0081]a、c、f和h的特别优选范围为约27至约170、约32至约160、约38至约148、约40至约142、约43至约136、约46至约131、约49至约125、约51至约119，和约54至约114。[0082]b、d、e和g的特别优选范围为约5至约50，约6至约40、约7至约35、约8至约29、约9至约27、约10至约26、约11至约25、约12至约24、约12至约23，和约11至约22。[0083]特别是有关定义泊洛沙胺的结构参数，值得注意的是，由于制造方法存在一定的可变性。更详细地说，当从同一制造商获取给定的产品，不同批次的给定产品也会有所不同。此外，制造商不同也可能带来差别。结构参数前的术语“约”反映了这一点。[0084]此外，在给定制造商的给定批次中，也存在差异，在于包含不同的分子种类。因此，如果没有另外说明，所有结构参数都代表包含在给定批次中的各个分子的结构参数的平均值。这也与制造商通常提供的信息一致。[0085]即便如此，还是必须考虑以下几点：由于泊洛沙胺的给定样品含有不同的分子，或者换句话说，表现出结构异质性，此类样品可包含满足本文所公开实施例的结构要求的泊洛沙胺分子，同时进一步包含不满足本文所公开实施例的结构要求的泊洛沙胺分子。即使不是优选的，这也是实现本发明的方法。因此，结论如下：即使用于表征所考虑的泊洛沙胺样品的平均结构参数不满足本文所公开的实施例的要求，但是所述样品中包含的一部分泊洛沙胺分子仍然满足本文所公开的实施例的要求。可以通过使用本领域专有的分析方法，如质谱分析法和/或色谱分析法，包括气相色谱分析法，来确定是否发生这种情况。在这种情况下，本文所公开的实施例中所叙述的结构参数是表征单个泊洛沙胺分子或所描述的部分的参数。认为在给定样品中含有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的泊洛沙胺满足本文所公开实施例的结构要求，就足以引起显著的转导增强效应。[0086]在本发明上述方面的特别优选实施例中，a＝c；f＝h；b＝d；和/或e＝g；优选a＝c＝f＝h；和/或b＝d＝e＝g；特别优选的是a＝c＝f＝h和b＝d＝e＝g。换句话说，优选r1、r2、r3和r4相同。[0087]在本发明上述方面的进一步特别优选实施例中，环氧丙烷‑环氧乙烷比率(#po/#eo)定义为(b d e g)/(a c f h)，其范围为从约0.05到约1.5、优选从约0.1到约1.0、更优选从约0.15到约0.67，更加优选从约0.18到约0.35。以及#po/#eo比率优选为约0.20、约0.25和约0.30。还可以预想诸如从约0.25到约0.35的相应范围。[0088]另一个常用的量度是重量比eo/(eo po)。优选泊洛沙胺具有约0.3与约0.95之间、更优选约0.5与约0.9之间，以及更优选约0.7与约0.8之间的eo/(eo po)重量比。[0089]在优选实施例中，(a)所述泊洛沙胺处于流体状态；和/或(b)所述组合物是泊洛沙胺溶液，其中所述载体是溶解的和/或悬浮的；和/或所述细胞处于悬浮或贴壁状态。[0090]本领域已知泊洛沙胺在水中有溶解度上限，其通常为约200mg/ml(色拉‑梅兹(serra‑gómez)等，2016)。本优选实施例的要求不包括泊洛沙胺悬浮液、凝胶以及其中的溶解泊洛沙胺与固体泊洛沙胺处于平衡状态的任何混合物。[0091]在进一步的优选实施例中，所述组合物进一步包含或进一步由下述物质组成：(a)选自多阳离子聚合物或多阳离子肽的组中的一种或多种多阳离子物质；(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0092]在第二方面中，本发明提供包含第一方面的组合物或由第一方面的组合物组成的药物组合物，其中第一方面的所述组合物包含所述包膜病毒载体，优选所述逆转录病毒载体。[0093]据了解，药物组合物具有有益效果。因此，设想所述药物组合物中包含的病毒载体包含核酸，其能够在对细胞或者生物体用药时，引发有益作用，所述生物体包括脊椎动物、哺乳动物、灵长类动物和人类。[0094]在第二方面的优选实施例中，所述药物组合物进一步包含或由：药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂组成，其实施例包括缓冲盐水(例如pbs和hbss)、细胞培养基(例如dmem、rpmi1640和imdm)和水。[0095]在第三方面中，本发明提供泊洛沙胺用于使用逆转录病毒载体转导脊椎动物细胞的用途。[0096]在使用病毒载体进行细胞调节的内容中的术语“转导”是本领域所众所周知的，并且在本文中没有其他含义。简言之，该术语是指将遗传物质引入细胞中，以及可选地，随后通过病毒载体整合到所述细胞的基因组中的过程。所述遗传材料包含或由病毒rna组成，该病毒rna与包含在意图整合到(基因组的)靶细胞中的所述载体中的一个或多个靶rna序列(以下称为靶序列)结合。[0097]优选细胞以及优选包膜病毒载体如上文所定义的。[0098]优选地，(a)排除通过治疗对人体或动物身体进行处理的用途；(b)所述用途是在体外或离体的用途；和/或(c)所述细胞不是活体生物体的部分。[0099]尤其优选为离体的应用。换言之，细胞可取自脊椎动物的生物体，根据本发明转导并随后重新引入脊椎动物生物体，优选但不限于取得该细胞的生物体。转导过程发生在所述生物体的外部。优选地，在所述重新引入步骤之前移除泊洛沙胺。[0100]一般而言，根据本发明，泊洛沙胺可与一种或多种已知用于增强转导的其他药剂(本文中也称为“佐剂”)结合。[0101]因此，在另一优选实施例中，进一步使用(a)选自多阳离子聚合物或聚阳离子肽的组中的一种或多种多阳离子物质；(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0102]根据本发明的“多阳离子聚合物”是指其重复单元带有正电荷的带电聚合物，其中重复单元上的正电荷来自质子化氮基团。例如，在聚乙烯亚胺(pei)中，带正电的基团是亚胺基团。[0103]术语“聚阳离子肽”指带正电的肽。例如，多聚赖氨酸是分子式为(c6h12n20)n的均聚聚阳离子肽，其中根据本发明，但不限于，n可以是至少2，例如至少20，优选在200和500之间，更优选在500和2500之间。[0104]在另一优选实施例中，进一步使用一种或多种糖蛋白或其片段，例如纤维连接蛋白和纤维连接蛋白片段(片段包括比较纤维连接蛋白)以及选自lah4肽家族的蛋白质片段或肽。[0105]术语“糖蛋白”描述含有共价连接到一个或多个氨基酸侧链上的寡糖链(聚糖)的蛋白质。纤维连接蛋白是一种多域糖蛋白，其大小介于230kda和270kda之间(施瓦茨鲍尔(schwarzbauer)和德西蒙(desimone)，2011)。比较纤维连接蛋白是指含有三个结构域(cs‑i、rgds和肝素结合结构域)的纤维连接蛋白片段(李(lee)等，2009)。肝素结合结构域结合于与病毒载体，rgds和cs‑i结构域分别通过vla‑5和vla‑4与靶细胞结合，从而使得病毒颗粒和细胞极为接近。[0106]术语“lah4肽家族”是指富含组氨酸的阳离子两亲肽(弗纳尔(fenard)等，2013；穆雷(moulay)等，2017)。[0107]在另一优选实施例中，进一步使用星状孢菌素。[0108]术语“星状孢菌素”是指一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，其最初从细菌(链霉菌属星状孢菌素)中分离出来，具有抗真菌活性(玉置(tamaoki)和中野(nakano)，1990)。它还可以引起中期细胞的染色质松弛，增加中期阻滞细胞中hiv‑i的整合。此外，已证明星状孢菌素在人类cd34 外周血细胞中的慢病毒转导后可增加载体拷贝数(vcn)(刘易斯(lewis)等，2018)。[0109]在另一优选实施例中，进一步使用前列腺素。[0110]术语“前列腺素”指一类具有激素样作用和具有包括炎症反应在内的调节致病机制的生理活性脂质。前列腺素e2(pge2)主要由巨噬细胞产生，参与调节免疫反应、血压、胃肠道完整性和生育能力(里乔蒂(ricciotti)、埃马努埃拉(emanuela)和菲茨杰拉德(fitzgerald)，2011年)。尤其是，pge2已被证明可增强cd34 hspc中的慢病毒转导(赫夫纳((heffner)等，2018)。[0111]pge2是一种天然的pge2受体激动剂。根据本发明，也可使用其它pge2受体激动剂。优选地，pge2受体激动剂选自15d‑pgj2；德耳塔(delta)12‑pgj2；2‑羟基十七碳三烯酸(hht)；血栓素a2；血栓素b2；伊洛前列素；曲前列素；曲伏前列素；卡前列素氨丁三醇；他氟前列素；拉坦前列素；比马前列素；异丙基乌诺前列酮；氯前列醇；雌二醇；氯前列烯醇；米索前列醇；布他前列素；亚油酸；13(s)‑hode；ly171883；米德酸；廿碳三烯酸；环氧二十碳三烯酸；ono‑259；cay1039；16，16‑二甲基pge2；19(r)‑羟基pge2；16，16‑二甲基pge2对(对乙酰氨基苯甲酰胺)苯基酯；11‑脱氧‑16,16‑二甲基pge2；9‑脱氧‑9‑亚甲基‑16，16‑二甲基pge2；9‑脱氧‑9‑亚甲基pge2；硫前列酮；pge2‑丝氨醇酰胺；pge2甲酯；16‑苯基四去甲(phenyltetranor)‑pge2；15(s)‑15甲基pge2；和15(r)‑15甲基pge2。[0112]一般来说，可以使用激发前列腺素e受体信号转导的试剂。这些试剂包括pga2；pgb2；pgd2；pge1(前列地尔)；pgf2；pgi2(依前列醇)；pgh2；和pgj2。[0113]已知激发所述前列腺素信号通路的其他试剂有：美贝弗林、氟氢缩松、阿替洛尔、吲哚洛尔、加博沙多、犬尿喹啉酸、肼苯哒嗪、噻苯咪唑、双茶碱、维他霉素(vesamicol)、黄夹次苷、丙咪嗪、氯丙酰胺、1,5‑五亚甲基四唑、4‑氨基吡啶、二氮嗪、苯磷硫胺、12‑甲氧基十二烯二酸，n‑甲酰‑甲硫氨酰‑亮氨酸‑苯丙氨酸(n‑formyl‑met‑leu‑phe)、没食子酸、iaa94和氯烯雌酚醚。[0114]根据本发明，一种或多种所述多阳离子物质可与靶细胞接触。所述接触可在靶细胞与病毒载体和所述泊洛沙胺接触之前、接触时或接触之后实现，只要所述后者的所有成分最终同时存在以同时接触靶细胞。[0115]如果一种以上的多阳离子物质(例如至少两种、至少三种、至少四种、至少5种或至少6种多阳离子物质)进一步与靶细胞接触，则它们可能属于多阳离子聚合物或聚阳离子肽，或者可以从二者中选择，即多阳离子聚合物可与聚阳离子肽混合。[0116]在不受特定理论约束的情况下，本文所述的所有多阳离子物质都能够桥接逆转录病毒载体和靶细胞之间的静电排斥，从而可以进一步提高转导效率。[0117]在更优选的实施方案中，所述多阳离子聚合物选自聚(乙二醇)‑聚(l‑赖氨酸)嵌段共聚物(peg‑pll)和1,5‑二甲基‑1,5‑二氮‑十一烷‑甲基‑聚甲基溴(聚凝胺)组成的组；和/或所述聚阳离子肽选自平均分子量在约1到约300kda之间的硫酸鱼精蛋白和聚赖氨酸(pll)。进一步设想的是pge‑2、纤维连接蛋白、泊洛沙姆和其他促进转导的物质。[0118]泊洛沙姆包括一条中心的聚丙烯氧化链，两侧有两条聚氧乙烯链。泊洛沙姆有几种使用的商品名，如和。通常，泊洛沙姆由数字代码来表征。举例来说，泊洛沙姆407的聚氧乙烯部分的分子量为4000g/mol，且其含量为70％。泊洛沙姆，包括特别适于转导的泊洛沙姆，在本技术人的早期申请wo2013/127964中描述。特别优选的泊洛沙姆在下面进一步公开。[0119]鱼精蛋白是一类富含精氨酸的碱性蛋白质。在许多物种中，它们被发现与精子中的dna有关。硫酸鱼精蛋白由这些从鱼的精子或鱼卵中提取的碱性肽的硫酸盐组成。一般来说，鱼精蛋白是几种类似肽的混合物。典型长度约为30个氨基酸。平均分子质量在4000和7000之间，优选在5000和5500da之间。例如，在欧洲药品管理局(europeanmedicinesagency)的关于含鱼精蛋白的医药产品的评估报告ema/741250/2012中描述了硫酸鱼精蛋白。[0120]术语“聚(乙二醇)‑聚(l‑赖氨酸)嵌段共聚物(peg‑pll)”是指具有[c6h12n2o]x‑[c2h4o]yh2o分子式的带正电大分子，其中x优选为约48且y为约272,72，对应于约12000da的聚(乙二醇)(peg)的平均分子量。如(原田(harada)和片冈(kataoka)，1995)所描述的方法合成peg‑pll。[0121]peg‑pll可单独使用，或与聚凝胺、硫酸鱼精蛋白和/或聚l‑赖氨酸中的任何一种组合使用。可以想象，任何多阳离子物质的使用浓度基本上不影响细胞活性。例如，通常可接受的聚凝胺使用浓度为8至10ug/ml。[0122]在更优选的实施方案中，多阳离子物质为1,5‑二甲基‑1，5‑重氮十一烷‑甲基‑聚甲溴和/或硫酸鱼精蛋白。[0123]1，5‑二甲基‑1，5‑重氮‑十一烷‑甲基‑聚甲溴和硫酸鱼精蛋白可单独使用或相互组合使用，进一步和/或多阳离子物质。[0124]根据本发明，来自lah4肽家族的一种或多种糖蛋白或肽和/或前列腺素和/或可与靶细胞接触。所述接触可在靶细胞与病毒载体和所述泊洛沙胺接触之前、接触时或接触后实现，只要所述后者的所有成分最终同时存在以在同时接触靶细胞。[0125]可以使用一种、多种或所有上述公开的附加试剂(即，除了至少一种泊洛沙胺之外)。[0126]我们注意到，对于具有一定环氧丙烷‑环氧乙烷比率(#po/#eo)的泊洛沙胺，观察到泊洛沙胺与硫酸鱼精蛋白联合使用的协同效应。在这方面，我们参考本文包含的实验数据。术语“环氧丙烷‑环氧乙烷比率”定义如下。由于所提及的协同效应，该比率的优选范围约0.18至约0.35。[0127]环孢霉素是真菌中发现的一类大环内酯类化合物，可作为免疫抑制剂。根据本发明，它们可与泊洛沙胺和本文中所述的增强转导的其它试剂一起用于增强转导。[0128]在第四方面中，本发明提供一种用逆转录病毒载体转导脊椎动物细胞的方法，所述方法包括或由使所述脊椎动物细胞、泊洛沙胺和所述病毒载体接触构成，其中优选地，所述接触按以下顺序进行：(a)提供所述细胞；(b)添加所述泊洛沙胺；以及(c)添加所述载体，其中优选地，在所述接触后进行旋转接种。[0129]与此相关，本发明提供一种用慢病毒载体转导脊椎动物细胞的方法，所述方法包括或由使所述脊椎动物细胞、泊洛沙胺和所述病毒载体接触构成，其中优选地，所述接触按以下顺序进行：(a)提供所述细胞；(b)添加所述泊洛沙胺；以及(c)添加所述载体，其中优选地，在所述接触后进行旋转接种。[0130]也可以同时执行步骤(b)和(c)。[0131]术语“接触(containing)”和“进行接触(bringingintocontact)”是指将靶细胞与病毒载体和泊洛沙胺混合以进行转导。允许转导发生的接触条件在本领域中是众所周知的，并且可以在一定程度上取决于所选择的靶细胞和病毒载体。例如，一些靶细胞比其他细胞更难转导，可能需要转化到特定的培养基中，然后才能实现与病毒载体的转导。相应的方法和条件如(朱、科内塔和益康(chu,cornetta,andecons)2008；杰科姆(jacome)等，2009；波乔布特(poczobutt)等，2010年)在实施例部分中描述了进一步的示例性条件。逆转录病毒载体和泊洛沙胺可同时(例如作为混合物)添加到靶细胞或以按顺序添加，只要两种化合物同时与靶细胞接触以允许转导。优选地，使靶细胞、病毒载体和泊洛沙胺接触至少5小时，例如至少6小时、至少7小时、至少8小时、更优选至少9小时、至少10小时、至少11小时和最优选至少12小时。还设想更长的接触时间，例如至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时或至少72小时。优选在24小时到72小时之间。[0132]在使用本文公开的一种或多种转导佐剂的范围内，优选在步骤(b)中添加所述佐剂；和/或在步骤(a)之后和步骤(c)之前添加。[0133]使用第三方面的优选实施例定义第四方面的方法的优选实施例。[0134]在所述方法的优选实施例中，(a)排除通过疗法对人体或动物身体进行治疗的方法；(b)所述方法为体外或离体方法；和/或(c)所述细胞不是生物体的一部分。[0135]在所述方法的另一优选实施例中，类似于根据本发明的用途的优选实施例，所述接触包括或进一步由接触(a)选自多阳离子聚合物或聚阳离子肽组的一种或多种多阳离子物质；(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0136]优选的多阳离子聚合物、聚阳离子肽、糖蛋白、前列腺素和泊洛沙姆如上文所述。[0137]在另一个优选实施例中，上述公开的方法进一步包括：在所述靶细胞与所述泊洛沙胺接触时或接触之后，旋转接种所述病毒载体与所述靶细胞。[0138]“旋转接种”一词有关病毒载体离心接种靶细胞，以确保细胞对逆转录病毒的摄取密切接触。本领域众所周知，并且在本文的背景部分中讨论的文献中描述了旋转接种协议。可在所述靶细胞与所述泊洛沙胺接触时或接触之后执行旋转接种步骤。优选地，在使靶细胞与泊洛沙胺和病毒载体接触之后执行旋转接种步骤。[0139]旋转接种步骤进一步提高使用本发明方法实现的转导率，特别是在难以转导的细胞中。[0140]使用vsv假型逆转录病毒载体和vsv假型慢病毒载体时，最好进行旋转接种，但无需仅使用旋转接种。vsv假型是一种特别赋予载体机理稳定性的方法。这种机理稳定性在旋转接种时是有利的。在申请人的专利申请wo2015/104376中描述了vsv假型病毒载体，其全部公开内容通过援用并入本文。本文上述进一步公开了关于vsv假型的内容。[0141]与参考方法相比，优选实施例中的转导增强，所述参考方法不添加所述泊洛沙胺，所述参考方法在其他方面与所述转导脊椎动物细胞的方法相同。[0142]通过本领域既定的方法，可以量化转导和转导的提高。如实施例中所释，可以通过荧光激活细胞分选(facs)来实现。facs可以测定被转导细胞的数量。根据是否存在荧光标记，细胞被分为转导或未转导。转导可以用相关术语来表示，例如，被转导细胞的数量除以在给定的转导分析中使用的细胞总数得到的比率。[0143]在第五方面中，本发明提供第一方面的组合物，其中所述第一方面的组合物包含所述病毒载体或用于医药的第二方面的药物组合物。[0144]在第六方面中，本发明提供第二方面的药物组合物或供第四方面使用的组合物，其中所述逆转录病毒载体携带对患有疾病或有患所述疾病风险的个体有益的基因。下表1分别给出了优选疾病和相关基因。[0145]表1[0146][0147][0148]在另一优选实施例中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。[0149]在本发明上述公开方面的另一优选实施例中，所述泊洛沙胺的分子量为从约5至约50kda、优选的为从约10至约40kda或约10至约30kda，更优选的为从约15kda至30kda或约15kda至25kda。[0150]泊洛沙胺优选为t1504、t1304、t1104、t904、t704、t504、t304、t1307、t1107、t707、t1508和t908。特别优选的是t1307、t1107、t707、t1508和t908。特别优选的选自t908、t1107和t1307的泊洛沙胺。最优选的是t1107。[0151]最后一位数字(如t908中的“8”)表示重量比(eo/(eo po)的数值。如果最后一位是8，则所述比率约为0.8。[0152]以下表2给出了环氧丙烷(po)构筑块的数量、环氧乙烷(eo)基团的数量以及这三种特别优选泊洛沙胺的分子量。[0153]表2[0154]#po#eomw(g/mol)t908约86.2约454.5约25000t1107约77.6约238.6约15000t1307约93.1约286.4约18000[0155]本领域中确立了“t”型号。在这方面，我们参考(基亚佩塔(chiappetta)和索斯尼克(sosnik),2007；施莫尔卡(schmolka)1977)。[0156]字母“t”源于术语该术语在本领域中常用来表示商业上可获得的泊洛沙胺。泊洛沙胺可从包括巴斯夫和克罗达在内的多家制造商处获得。[0157]在本发明任何前述方面的优选实施例中，所述泊洛沙胺的浓度范围为约0.1至约40mg/ml、优选约0.2至约30mg/ml、约0.25至约25mg/ml、更优选为约0.3至约20mg/ml，其中(a)如果所述细胞为悬浮细胞，优选为约0.3至约20mg/ml或约5至约20mg/ml，更优选为约1至约20mg/ml或约10至约20mg/ml；和(b)如果所述细胞为贴壁细胞，则优选范围为约0.3至约10mg/ml、约0.3至约5mg/ml、约0.3至约2mg/ml、约0.3至约1.25mg/ml和约0.3至约1mg/ml逐渐增加。尤其优选为约0.6和约1mg/ml之间的浓度，例如约0.63mg/ml。[0158]实施例中的悬浮细胞为jvm‑3和dohh‑2细胞；数据见图4和图5。实施例中的贴壁细胞为a2780细胞；见图1。hut78细胞(悬浮细胞)优选浓度为0.5‑5mg/ml之间；见图3。[0159]本文所定义的泊洛沙胺优选溶解于水、磷酸盐缓冲液或直接溶解于细胞培养基中。泊洛沙胺可溶解于水或磷酸盐缓冲液中，以获得例如浓度为100mg/ml或50mg/ml的储备溶液，该储备溶液可稀释至给定的工作浓度。浓度超过200mg/ml时，泊洛沙胺溶液通常呈凝胶状。浓度低于200mg/ml时，泊洛沙胺溶液呈流体状态。优选地，所述浓度使泊洛沙胺呈流体状态或溶液形式。[0160]在更优选实施例中，所述泊洛沙胺的浓度为约500至约1000ug/ml。[0161]本文定义的泊洛沙胺在水或磷酸盐缓冲液中稀释时处于流体状态。如本领域技术人员将理解的，用液体泊洛沙胺转导细胞可能更方便，例如，更方便处理，例如更易于移液。[0162]在根据本发明的组合物或使用的组合物的优选实施例中，所述组合物包含或进一步由下述物质组成：(a)选自多阳离子聚合物或聚阳离子肽组的一种或多种多阳离子物质(b)前列腺素；(c)糖蛋白；(d)泊洛沙姆；(e)环孢霉素；和/或(f)星状孢菌素。[0163]优选的聚阳离子聚合物或聚阳离子肽，如上文所述。[0164]在另一优选实施例中，所述泊洛沙胺处于流体状态和/或溶液中。[0165]在上述任一方面的另一优选实施例中，所述脊椎动物细胞是哺乳动物细胞，优选灵长类细胞或人类细胞。[0166]在上述任一方面的优选实施例中，与不含有所述泊洛沙胺的情况下相比，所述转导(a)显著增加；和/或(b)增加至少1.25倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍或至少5倍。值得注意的是，对于大规模生产的转基因患者细胞来说，这种增加是非常显著的。[0167]给定实验的转导效率定义为由载体转导的细胞的比例，或靶细胞中转基因表达的总水平。相较于未使用转导增强子，使用泊洛沙胺的所述比例或所述转基因水平有所增加。实施例1中描述了确定转导率的示范性测量方法。可在后续实施例中找到增强转导的证据。[0168]一般而言，尤其优选(a)所述多阳离子聚合物选自1,5‑二甲基‑1,5‑重氮‑十一烷‑甲基‑聚甲基溴(聚凝胺)和聚(乙二醇)‑聚(l‑赖氨酸)嵌段共聚物(peg‑pll)；(b)所述聚阳离子肽选自硫酸鱼精蛋白，聚‑l‑赖氨酸(pll)，所述聚‑l‑赖氨酸(pll)平均分子量为约1到约300kda、更优选为约1kda到约100kda，和；(c)所述糖蛋白为纤维连接蛋白；(d)所述前列腺素为pge2；(e)所述泊洛沙姆为或(另见wo2013/127964)；和/或(f)所述环孢霉素是csa或csh。[0169]前列腺素优选为前列腺素‑e2(pge2)(赫夫纳(heffner)等，2018)。糖蛋白优选为逆转录连接蛋白(默里(murray)等，1999)。[0170]另一种有用的泊洛沙姆为泊洛沙姆407。[0171]在特别优选实施例中，硫酸鱼精蛋白为聚阳离子肽；#po/#eo为约0.18至约0.35；和/或所述泊洛沙胺为t1107、t1307或t908。[0172]后一个特别优选实施例的特征在于通过组合使用满足所述环氧丙烷‑环氧乙烷比率的硫酸鱼精蛋白和泊洛沙胺，因而产生令人惊讶的协同效应。实施例中包含了证据。[0173]在第七方面中，本发明提供一种试剂盒，包含或由下述物质组成：(a)泊洛沙胺，优选为本文所定义的；(b)可选择(i)至(iii)中的一项或多项：(i)(1)至(3)中的一种、多种或全部：(1)选自多阳离子聚合物和聚阳离子肽的多阳离子物质；(2)前列腺素；(3)糖蛋白；(4)泊洛沙姆；和(5)环孢霉素类；(ii)逆转录病毒载体；(iii)脊椎动物细胞；以及(c)可选地，包括用于执行本发明的用途和/或方法的说明书的手册。[0174]在优选实施例中，所述试剂盒包括使用说明书，优选地，根据上文公开的用途或方法。[0175]上文所描述的关于多阳离子聚合物、聚阳离子肽、糖蛋白、前列腺素和泊洛沙姆定义和特征的组合经必要修改后也适用于本发明的试剂盒。[0176]在优选实施例中，所述试剂盒包含或由所述泊洛沙胺和所述逆转录病毒载体组成。[0177]在另一优选实施例中，所述试剂盒包含或由所述泊洛沙胺和所述脊椎动物细胞组成。[0178]在另一优选实施例中，所述试剂盒包含或由所述泊洛沙胺、所述逆转录病毒载体和所述脊椎动物细胞组成。[0179]试剂盒的各种组分可以包装在一个或多个容器中，例如一个或多个小瓶。除所述组分外，小瓶可包括用于储存的防腐剂或缓冲剂、用于维持和储存的介质，例如细胞培养基、dmem、mem、hbss、pbs、hepes、潮霉素、嘌呤霉素、青霉素‑链霉素溶液、尤其是庆大霉素。有利地，所述试剂盒包括允许技术人员方便使用组分的使用说明，例如，本发明的各种实施例。任何组分都可以在实验环境中使用。[0180]在另一方面，本发明提供一种提高病毒拷贝数(vcn)的方法，所述方法包括第四方面的转导方法，其中vcn与参考方法相比有所提高，所述参考方法不添加所述泊洛沙胺，所述参考方法在其他方面与所述提高vcn的方法相同，其中优选提高vcn至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。[0181]换句话说，提供了一种提高病毒拷贝数(vcn)的方法，所述方法包括使脊椎动物细胞、泊洛沙胺和病毒载体接触，其中优选地，所述接触按以下顺序进行：(a)提供所述细胞；(b)添加所述泊洛沙胺；以及(c)添加所述载体，其中优选地在所述接触后进行旋转接种，并且与参考方法相比，vcn被提高，所述参考方法不添加所述泊洛沙胺，所述参考方法在其他方面与所述提高vcn的方法相同。[0182]在上述公开的提高vcn方法的优选实施例中，以及在第四方面的方法的优选实施例中，(a)所述逆转录病毒载体是慢病毒载体；和/或(b)所述泊洛沙胺为t1107。[0183]术语“载体拷贝数”有其既定的含义。它是指载体或部分在细胞中，优选在细胞基因组中的拷贝数。所述载体拷贝数可以由单个细胞确定，也可以由多个细胞确定。在后一种情况下，可以获得平均vcn。本领域已知用于确定载体拷贝数的方法。它们包括定量聚合酶链反应(qpcr)和微滴式数字聚合酶链反应(ddpcr)，例如，在霍伯(hauber)等，2018(林(lin)等，2016)所述。[0184]控制和改善vcn是基因治疗应用的一个重要方面。vcn决定了治疗基因在细胞中的表达数量，直接影响治疗的成功。通过使用转导增强剂增加vcn可以减少慢病毒载体的使用，从而降低潜在的风险和治疗成本。[0185]当使用本发明的方法时，可以在所附的实施例和附图中发现vcn增强的实验证据。[0186]上文所描述的关于病毒载体和泊洛沙胺的定义和特征的组合经必要修改后也适用于本发明中试剂盒的病毒载体和泊洛沙胺。例如，逆转录病毒载体可以是可以或不可以进一步修饰的慢病毒载体，例如假型的。[0187]关于本说明书中所描述的实施例，特别是在权利要求中，意图将从属权利要求中提及的每个实施例与所述从属权利要求所引用的每个(独立或从属)权利要求的每个实施例相结合。例如，在独立权利要求1引用3个可选方案a、b、c，从属权利要求2引用3个可选方案d、e、f，以及从属权利要求3引用权利要求1、2并引用3个可选方案g、h、i的情况下，应当理解的是，说明书明确公开了相应组合的实施例：；a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i，除非另有特别说明。[0188]类似地，并且在独立和/或从属权利要求没有列举备选方案的情况下，应当理解的是，如果从属权利要求引用多个在先权利要求，则其涵盖的主题的任何组合被认为是明确公开的。例如，在独立权利要求1、引用回权利要求1的从属权利要求2、引用回权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，可以得出权利要求3和1主题的组合与权利要求3，2和1主题的组合一样被清楚无误地公开。进一步的，在从属权利要求4引用权利要求1至3中任一权利要求的情况下，则权利要求4、1、权利要求4、2、1、权利要求4、3、1以及权利要求4、3、2、1主题的组合被清楚无误地公开。附图说明[0189]图1：(a)慢病毒表达荧光素酶以转导的a2780细胞的发光信号。使用表达荧光素酶的慢病毒转导分成三份的a2780细胞。使用浓度在0.31mg/ml到5mg/ml之间的三种不同的泊洛沙胺(t908，t1107，t1307)。示图中显示了使用酶标仪转导后三维(3d)测量的相对光单位(rlu)。将使用聚凝胺(8ug/ml)和仅病毒(不含佐剂)的作为对照例。虚线表示仅病毒的荧光素酶水平。[0190](b)根据所转导的细胞的荧光素酶信号，相较于仅病毒，在a2780细胞中的转导效率成倍提高了。[0191](c)慢病毒表达荧光素酶以转导的nci‑h1838细胞的发光信号。慢病毒表达荧光素酶转导分成三份的nci‑h1838细胞。所有条件与图1a中所描述的相同。[0192](d)根据所转导的细胞的荧光素酶信号，相较于仅病毒，在nci‑h1383细胞中的转导率成倍提高了。[0193]图2：泊洛沙胺和其他转导增强物质的迭加效应。将1mg/ml的每种泊洛沙胺t1107、t1307和t908与5ug/l或40ug/ml硫酸鱼精蛋白(ps)或1mg/ml的相应的其他泊洛沙胺结合。通过gfp表达病毒进行转导以及计算转导后3天gfp表达的细胞与总细胞的对比，来测量对细胞基底的转导增强的效率(图2a‑c)。图2d显示了仅病毒在每种条件下的三个不同加样孔，包括8μg/ml聚凝胺、40ug/ml硫酸鱼精蛋白、1mg/mltl107、1mg/mltl107(含8ug/ml聚凝胺)和1mg/mltl107(含40μg/ml硫酸鱼精蛋白)。测量慢病毒表达荧光素酶以转导的细胞的总转导率。在转导3天后测量发光情况，并以相对光单位(rlu；图2e‑g)表示。采用双尾学生式t检验计算仅泊洛沙胺与含40ug/ml硫酸鱼精蛋白的泊洛沙胺之间差异的显著性，并用p值表示。图中的虚线显示仅病毒对照的水平。[0194]图3：慢病毒表达荧光素酶以转导的hut78悬浮细胞的相对光单位(rlu)表征的发光水平，其中，a)和c)中不采用旋转接种，b)和d)中采用旋转接种。在指定浓度下增加季酮类(teronics)和对照。(c)和(d)显示出与仅病毒的对照相例比，其转导相应成倍提高。[0195]图4:慢病毒表达荧光素酶且不经旋转接种以转导jvm‑3悬浮细胞。(a)显示了以转导后3天所测得的相对光单位(rlu)所表征的发光水平。在指定浓度下增加了季酮类(teronics)和对照例。(b)显示了与仅病毒对照例相比的相应的成倍提高。[0196]图5:慢病毒表达荧光素梅且不经旋转接种以转导dohh‑2悬浮细胞。a)显示了以转导后3天所测得的相对光单位(rlu)所表证的发光水平。在指定浓度下增加了季酮类(teronics)和对照例。(b)显示了与仅病毒对照例相比的相应的成倍提高。[0197]图6：mtt比色法测定使用不同浓度泊洛沙胺处理的a2780细胞的活性。图a)显示了所测量的吸光度的平均值，条形图表示标准偏差。图中的虚线表示的是培养基对照例。b)图中的百分比数值是与仅培养基相比的相对活性。[0198]图7：仅使用了1mg/mlt1107或还结合使用了5ug/mlps的转导，与仅使用了病毒的转导相比较的相对转导增强情况。在对来自独立供体的外周血单个核细胞(pbmcs)进行转导后的第9/10天，使用流式细胞仪(facs)检测转导增强。条形图显示了来自3个不同供体的平均值。计算使用了转导增强剂转导的gfp 细胞相对于仅病毒转导的gfp 细胞的百分比。该比率显示了的传导增强的情况。误差线表示标准偏差。p值通过双尾学生式t检验计算得到。[0199]图8：仅使用了1mg/mltl107或与还结合使用了5ug/mlps的转导，与仅使用病毒的转导相比较的相对载体拷贝数(vcn)的提高情况。在对来自独立供体的外周血单个核细胞(pbmcs)进行转导后的第9/10天，使用ddpcr方法进行分析。比较使用了转导增强剂转导的细胞的vcn与仅病毒转导的细胞的vcn。该比率显示了相对传导增强的情况。条形图显示了来自3个不同供体的平均值，误差线显示标准偏差。p值通过双尾学生式t检验计算得到。具体实施方式[0200]通过实施例进一步阐述本发明。[0201]实施例1[0202]材料和方法[0203]细胞系[0204]在添加10％(vol/vol)胎牛血清(fcs；柏诺(biochrom))和2mml左旋谷酰胺(泛生物技术(panbiotech))的rpmi1640培养基中生长的人类卵巢癌细胞a2780(西格玛奥德里奇(sigma‑aldrich))和人类肺腺癌细胞ncih1838(attc)。[0205]在添加20％fcs(柏诺)的imdb(英杰)培养基中生长的人皮肤t淋巴细胞hut78(atcc)。[0206]在添加10％fcs(柏诺)的rpm11640培养基中生长的人类慢性b细胞白血病(jvm‑3)和人类b细胞淋巴瘤(dohh‑2)。[0207]慢病毒的生成[0208]慢病毒转导载体p‑ubic‑luc2‑lres‑puro和p‑cmv‑copgfp‑ires‑puro分别允许由ubic启动子驱动的荧光素酶或由cmv启动子驱动的copgfp的表达。根据制造商的说明，使用2g利用脂质体2000(lipofectamine2000)(生命技术公司(lifetechnologies))作为转导试剂的转导载体和10μg包装质粒pmdl、pvsv‑g、prev(罗氏(roche))在t75烧瓶中通过对hek293‑tn细胞进行瞬时共转导产生复制缺陷型慢病毒颗粒。转导48小时后得到病毒颗粒，低速离心去除细胞碎片，使用peg沉淀。通过离心浓缩病毒颗粒并在‑80℃下储存。[0209]细胞系的慢病毒转导[0210]贴壁细胞以每孔1.5e 05的剂量接种到适当培养基的96孔板中。培养24小时后(37℃，具有5％二氧化碳(co2))更换培养基，并如所述用指定浓度的佐剂(即泊洛沙胺)处理细胞，如图所示。然后用慢病毒(lv)载体以moi15(每个细胞感染病毒颗粒的多重性)指标表达荧光素酶或copgfp以转导细胞，并在37℃、5％co2环境的细胞培养箱中，无需更换培养基，培养72小时。按上述方法接种悬浮细胞，并转导相同的天数，在moi15下，接种如上相同的lv。在特定的情况下，接种了细胞的板子在转导(旋转接种)后直接以800g离心60分钟。[0211]转导效率的量化[0212]使用荧光素酶量化总的转基因病毒表达量。在病毒转导3天后向细胞中加入100ul稳态球蛋白(steady‑glo)试剂(普洛麦格(promega))，将有细胞的板子放入tecaninfinitem200酶标仪中，摇动30秒钟。在室温下培养10分钟后，通过酶标仪测量发光信号。测量值以相对光单位(rlu)表示。[0213]分析利用copgfp表达载体以转导细胞的转导率。转导3天后，使用具有10倍物镜的荧光显微镜(具有dfc3000g相机的徕卡dmilled)采集每个加样孔的随机图像。将lug/mlhoechst33342加入培养基中，在37℃下培养15min以复染细胞.统计copgfp和hoechst所表达的细胞，用gfp表达的细胞数除以hoechst染色的细胞数以计算转导率。[0214]mtt比色法(细胞活性)[0215]mtt比色法检测佐剂的细胞毒性。将a2780细胞接种于96孔板中，细胞是用浓度为从0.031mg/ml至20ml/ml的佐剂处理的细胞。于37℃，5％的co2环境下培养72小时后，向细胞中加入20mlmtt试剂(2.5mg/ml)，于37℃培养4h，每孔加入100ul十二烷基硫酸钠(sds)的裂解液(10％十二烷基硫酸钠溶于0.001n盐酸中)并在37℃下培养24小时。在酶标仪上测量560/690nm处的吸光度。在存活的健康细胞中的依赖nad(p)h的细胞氧化还原酶，将mtt还原到其不溶性形式，这可在酶标仪中测量；吸光度的降低表明了健康细胞的数量的减少。[0216]实施例3的材料和方法[0217]从三个独立供体的外周血单核细胞(pbmcs)中分离人类cd34 造血干细胞。为了进行转导，细胞以每孔2x10e6个细胞接种到在补充有stemmacshsc扩增混合物(expansioncocktail)的stemmacshsc扩增培养基中的12孔板中。接种后第二天，在cmv启动子作用下，通过慢病毒载体表达gfp，以moi1，转导细胞。在转导之前，单独添加最终浓度为1mg/ml的泊洛沙胺t1107或将其结合5ug/ml硫酸鱼精蛋白(ps)一起添加。对于每个供体，用不含增强剂的病毒进行对照转导(仅病毒)。对于转导，在室温下以600g进行90分钟的旋转接种。[0218]在转导后24小时，用pbs洗涤细胞两次并更换培养基。在转导后第9/10天，通过流式细胞仪分析gfp表达和转导细胞的百分率。[0219]此外，在转导后第9/10天，使用qiamp‑dna微试剂盒从转导细胞和对照细胞中分离基因组dna(gdna)，并通过ddpcr分析每个细胞中整合的病毒载体基因组(载体拷贝数，vcn)的数量。为了检测整合的病毒载体基因组，使用ddpcrpre特异引物和作为对照的单拷贝基因rpp30(英斯路(hauber)等，2018)。[0220]实施例2[0221]结果[0222]泊洛沙胺增强在粘附细胞中的转导[0223]为了分析泊洛沙胺对慢病毒载体的转导效率的影响，以指定浓度向粘附细胞中添加泊洛沙胺t908、tl107、t1307，随后，在moi15下通过慢病毒表达荧光素酶转导这些细胞。作为对照组，在转导前向孔中添加仅病毒(用h2o代替佐剂)或8mg/ml聚凝胺。所有条件都设置三组。转导后3天，通过酶标仪上测定荧光素酶的活性来评估转导率。结果以相对发光单位(rlu)表示。在浓度为5mg/ml和0.31mg/ml之间时，对于t908、tl107和t1307，浓度为5mg/ml和0.31mg/ml之间时，转导后其转基因表达分别比仅病毒的提高213倍、2.55倍和2.91倍。就所有聚合物，对a2780细胞的最大影响是在0.63mg/ml时(图1a和1b)。[0224]这种转导测试也在粘附的人类肺腺癌细胞系nci‑h1838中复制。通常，通过荧光素酶活性测定的转导水平低于a2780细胞(图1c)。我们仍然可以观察到，与不含转导增强剂的病毒转导相比，添加泊洛沙胺可使转导效率提高2.86倍(t1107在0.63mg/ml时)，2.77倍(t1307在0.31mg/ml时)和2.68倍(t908在0.31mg/ml时)(图1d)。[0225]泊洛沙胺和硫酸鱼精蛋白对转导增强有加性效应[0226]为了测量迭加效应，加入1mg/ml的泊洛沙胺t1107、t1307或t908作为添加剂，用copgfp表达慢病毒来转导a2780细胞。此外，使用每种浓度为1mg/ml的泊洛沙胺与5ug/ml或40ug/ml硫酸鱼精蛋白的结合，或1mg/ml泊洛沙胺，来分析迭加效应。在每个孔中，拍摄6张图像(图2d显示了tl107的实施例)，计数copgfp表达的细胞，并与用hoechst33342染料染色的总细胞数进行比较。图2a‑c显示了每个条件下3个孔的gfp表达细胞的平均百分比和标准偏差。与仅病毒(聚凝胺)相比，使用的所有转导增强剂均单独使用可以将慢病毒的转导提高1.67倍(图2a‑c)。泊洛沙胺t1107、t1307和t908在1mg/ml时，转导细胞百分率分别比仅病毒提高2.46倍、2.54倍和2.68倍。有趣的是，发现t1107与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用比单独使用tl107转导的细胞提高1.43倍(图2a)。同样对于t1307和t908，我们观察到泊洛沙姆与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用比单独使用泊洛沙姆分别将转导率显著提高了1.49倍和1.71倍(图2b和2c)。与单独使用40ug/ml硫酸鱼精蛋白相比，也可以看到这样的提高。泊洛沙胺与其他药物的结合，并未显示出任何显著的改善效果。[0227]为了证实这种迭加效应对总转基因表达水平的有作用，用慢病毒表达荧光素酶来进行慢病毒转导。在上述实验中使用的各个浓度以及泊洛沙胺与所有其他转导增强剂的组合也同样被使用。[0228]转导增强剂单独将总的转基因表达提高了1.14倍(5ug/ml硫酸鱼精蛋白)至2.08倍(40ug/ml硫酸鱼精蛋白)(图2e‑g)。与仅病毒相比，泊洛沙胺t1107、t1307和t908使转基因表达水平分别提高了1.54、1.51和1.58倍(图2e‑g)。能够证实，与单独使用泊洛沙胺相比，泊洛沙胺与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用提高了转导能力。t1107、t1307和t908与40ug/ml硫酸鱼精蛋白共同使用，与单独使用泊洛沙胺相比，将转基因表达分别提高了1.96、2.11和1.89倍(图2e‑g)。与其他泊洛沙胺的共同使用没有显示出任何显著改善。[0229]泊洛沙胺增强悬浮细胞的转导[0230]许多在临床前研究中建立的肿瘤细胞系使用普通病毒和非病毒工具只能提供较差的转导率。在悬浮培养中生长的间变性大细胞淋巴瘤(alcl)细胞系属于这种难以感染的肿瘤细胞系亚群。在感染lv过程中，采用改良方案，包括可选的旋转接种步骤，测试到泊洛沙胺对慢病毒感染的促进作用。在hut78人类皮肤t淋巴细胞悬液细胞上首次评价了使用和不使用旋转接种对泊洛沙姆的转导效率的增强作用。用慢病毒表达荧光素酶进行转导，以测定对总转基因表达的影响。泊洛沙胺在5mg/ml～1.25mg/ml范围内达到最大转导率，在较低浓度下所述转导率降低。不采用旋转接收时，荧光素酶信号比仅病毒的对照的最大改善达到3.53倍(t908，5mg/ml)、15.98倍(t1107，2.5mg/ml)和4.85倍(t1307，2.5mg/ml)(图3a c)。采用旋转接种后，最大改善率分别为4.08倍(t908，2.5mg/ml)、5.06倍(t1107，1.25mg/ml)和4.32倍(t1307，1.25mg/ml)(图3b d)。总的来说，转基因的表达水平明显低于粘附a2780细胞。与不采用旋转接种相比，采用旋转接种的表达水平的提高达到2.6倍(图3c与3d相比)，但与粘附细胞相比，总转基因表达水平仍然相对较低(图1)。[0231]还对另外两个悬浮细胞系进行了测试，即，jvm‑3(人类慢性b细胞白血病)和dohh‑2(人类b细胞淋巴瘤)。在jvm‑3细胞中，我们观察到t908在20mg/ml时的最大转导增强达到2.46倍，t1107在10mg/ml时的最大转导增强达到2.17倍，t1307在20mg/ml时的最大转导增强达到2.47倍(图4a b)。在dohh‑2细胞中，与仅病毒相比，观察到增强倍数分别为2.26倍(t908，20mg/ml时)、2.42倍(t1107，20mg/ml时)和3.29倍(t1307，20mg/ml时)(图5a b)。在所有使用条件下，jvm‑3细胞的总转基因表达水平高于dohh‑2细胞。对于jvm‑3和dohh‑2，悬浮细胞系在浓度为10mg/ml和20mg/ml之间的效果最强。总的来说，这两种悬浮细胞系在转导后的转基因表达水平也明显低于粘附a2780细胞。[0232]细胞活性[0233]对于基因治疗应用中的转导增强子的应用，重要的是所使用的物质不影响活性和对细胞没有毒性作用。[0234]mtt比色法是一种评估细胞代谢活性的比色测定方法。四唑类染料mtt(3‑(4,5‑二甲基噻唑‑2‑基)‑2,5‑二苯基四唑溴化胺)被细胞氧化还原酶还原成不溶性的甲瓒，甲瓒呈紫色，可通过吸光度测量进行定量测量。为了测试对细胞活性的影响，将用于增强转导的最终浓度为20mg/ml至0.31mg/ml的泊洛沙胺添加到细胞中，并在3天后通过mtt比色法测定细胞活性。然后将其吸光度值与仅培养基或水的对照进行比较。t908的存活率在69％到90％之间，在0.31mg/ml时，存活率最高。形态学上没有观察到细胞凋亡。t1107的存活率在99％和116％之间，在20mg/ml时存活率最高。对于t1307可以观察到类似的结果：t1307的存活率为84％(0.31mg/ml)和109％(20mg/ml)之间(图3(a)和(b))。高于100％的数值表明这些细胞比对照组具有更多的酶活性和更高的活性。对于t1107和t1307，在超过5mg/ml的高浓度下超过100％的活性值可以表明，这些泊洛沙胺对细胞的生长或酶活性有积极影响。t908较低的存活率并不能明确的指向毒性作用，因为我们无法观察到细胞凋亡的形态学特征。而，这很可能表明t908影响了细胞的代谢活性。[0235]实施例3[0236]增强转导和vcn[0237]为了检测泊洛沙胺t1107对细胞转导的促进作用，从3个不同供体获得人类cd34 pbmcs，以每孔2x10e6细胞接种到12孔板中。第二天，以moi1，用慢病毒表达gfp转导细胞，以600g90分钟进行旋转接种。作为转导增强剂，在病毒感染前单独添加1mg/mltl107或共同添加1mg/mltl107与5ug/ml硫酸鱼精蛋白(ps)。转导后第9/10天，用流式细胞仪(facs)分析gfp表达细胞的百分率。比较使用转导增强子的转导的gfp 细胞百分比与使用仅病毒转导的gfp 细胞的百分比。该比率表征了相对传导增强情况。[0238]在第9/10天观察到，与仅病毒相比，单独使用1mg/mlt1107可使转导显著增强3.95倍。t1107与浓度为5ug/mlps的共同使用，相较于仅病毒，其转导率进一步提高了5.09倍(图1)。这一结果表明，t1107与ps共同使用的转导增强效果比单独使用t1107的效果好28.6％。[0239]此外，在通过ddpcr转导后的第9/10天，分析每个细胞的载体拷贝数(vcn)。vcn数描述整合到靶细胞中的转基因拷贝的平均数。单独使用病毒转导，vcn达到0.07，而添加1mg/mltl107的vcn则达到0.3。t1107与5μg/mlps共同使用进一步将vcn增加到0.43。单独添加tl107或与ps共同添加，与仅病毒相比，vcn分别增加4.44倍和6.28倍(图2)。t1107与ps共同使用比单独使用tl107可使vcn提高41.2％。这些结果清楚地表明，相较于单独使用病毒，添加1mg/mlt1107可显著增强慢病毒转导中的vcn。此外，t1107与ps共同使用vcn更加提高。[0240]参考文献[0241]阿拉霍夫、瓦莱里、埃夫盖尼·克林斯基、李胜民和格热戈尔斯·皮特津斯基，1999年。以嵌段共聚物为基础的阿霉素制剂。从细胞筛选到临床试验。[0242](alakhov,valery,evgueniklinski,shengminli,andgrzegorzpietrzynski.1999."blockcopolymer‑basedformulationofdoxorubicin.fromcellscreentoclinicaltrials.")[0243]胶体和表面b:生物界面16:113‑34。[0244]阿尔瓦雷斯·洛伦佐，卡门等，2010，《用于药物递送的泊洛沙明纳米材料》，《生物科学前沿》2:424‑40。[0245](alvarez‑lorenzo,carmenetal.2010."poloxamine‑basednanomaterialsfordrugdelivery."frontiersinbiosciences2:424—40.)[0246]阿纳斯塔索夫，娜塔莎等，2009，“使用慢病毒载体介导的转移将shrna高效递送到b和t淋巴瘤细胞中”，《血液病理学杂志》2(1)：9‑19.2010。“alk阳性间变性大细胞淋巴瘤中的c/ebpbeta表达是细胞增殖所必需的，并由stat3信号通路诱导。”haemato/ogica95(5)：760‑67。[0247](anastasov,natasaetal.2009."efficientshrnadeliveryintobandtlymphomacellsusinglentiviralvector‑mediatedtransfer."journalofhematopathology2(1):9‑19.2010."c/ebpbetaexpressioninalk‑positiveanaplasticlargecelllymphomasisrequiredforcellproliferationandisinducedbythestat3signalingpathway."haemato/ogica95(5):760‑67.)[0248]奥宾、rj、m韦恩菲尔德和mc帕特森，1988。影响聚丁二烯辅助基因转移效率和重复性的因素〉，体细胞与分子遗传学14(2)：155‑67。[0249](aubin,rj,mweinfeld,andmcpaterson.1988."factorsinfluencingefficiencyandreproducibilityofpolybrene‑assistedgenetransfer."somaticcellandmoleculargenetics14(2):155‑67.)[0250]巴特尔，大卫p,2009.“微rnas：目标识别和调节功能”，《细胞》136(2)：215‑33。[0251](bartel,davidp.2009."micrornas:targetrecognitionandregulatoryfunctions."cell136(2):215‑33.)[0252]比肖夫、丹妮拉和肯尼思·科内塔。2010.“通过假定型慢病毒载体实现细胞靶向的灵活性”，《分子生物学方法》(克利夫顿，n.j.)614:53‑68。[0253](bischof,daniela,andkennethcornetta.2010."flexibilityincelltargetingbypseudotypinglentiviralvectors."methodsinmolecularbiology(clifton,n.j.)614:53—68.)[0254]布克林斯基，mi等.1993.“控制非分裂细胞感染的hiv‑i基质蛋白中的核定位信号”，《自然》365(6447)：666‑69。[0255](bukrinsky,mietal.1993."anuclearlocalizationsignalwithinhiv‑imatrixproteinthatgovernsinfectionofnon‑dividingcells."nature365(6447):666—69.)[0256]伯恩斯，jc等.1993.“水泡性口炎病毒g糖蛋白假型逆转录病毒载体：浓缩到非常高滴度和高效基因转移到哺乳动物和非哺乳动物细胞中”，《美国国家科学院学报》卷90(17)：8033‑37。[0257](burns,jcetal.1993."vesicularstomatitisvirusgglycoproteinpseudotypedretroviralvectors:concentrationtoveryhightiterandefficientgenetransferintomammalianandnonmammaliancells."proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica90(17):8033‑37.)[0258]卡斯特罗，ba，cd维斯，ld维奥特和ja利维。1988.从外周血单个核细胞中回收人类免疫缺陷病毒的最佳条件，临床微生物学杂志26(11)：2371‑76。[0259](castro,ba,cdweiss,ldwiviott,andjalevy.1988."optimalconditionsforrecoveryofthehumanimmunodeficiencyvirusfromperipheralbloodmononuclearcells."[0260]journalofclinicalmicrobiology26(11):2371—76.)[0261]基亚佩塔、迭戈a和亚历杭德罗·索斯尼克。2007.“聚(环氧乙烷)嵌段共聚物胶束作为药物递送剂：改善药物的水溶性、稳定性和生物利用度”，《欧洲药剂学和生物药剂学杂志》66(3)：303‑17。[0262](chiappetta,diegoa,andalejandrososnik.2007."poly(ethyleneoxide)‑poly(propyleneoxide)blockcopolymermicellesasdrugdeliveryagents:improvedhydrosolubility,stabilityandbioavailabilityofdrugs."europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics66(3):303‑17.)[0263]赵，恩熙，李政洙，和肯韦伯，2012.“作为组织密封剂的泊洛沙明水凝胶的配方和特性”，《生物材料学报》8(6)：2223‑32。[0264](cho,eunhee,jeoungsoolee,andkenwebb.2012."formulationandcharacterizationofpoloxamine‑basedhydrogelsastissuesealants."actabiomaterials8(6):2223‑32.)[0265]朱，康，肯尼思g科内塔和迈克尔j易康。2008.“使用基于hiv‑i的慢病毒载体将高效稳定的基因表达入人类破骨细胞”，《dna与细胞生物学》27(6)：315‑20。[0266](chu,kang,kennethgcornetta,andmichaeljecons.2008."efficientandstablegeneexpressionintohumanosteoclastsusinganhiv‑i‑basedlentiviralvector."dnaandcellbiology27(6):315‑20.)[0267]杜尔，t等.1998.“具有条件包装系统的第三代慢病毒载体”，《病毒学杂志》72(11)：8463‑71。[0268](dull,tetal.1998."athird‑generationlentivirusvectorwithaconditionalpackagingsystem."journalofvirology72(11):8463—71.)[0269]埃鲁科娃、余维罗尼卡、奥克萨诺、克鲁瓦，尤里n、安东尼科和尼科莱，梅利克努巴罗夫，2000。环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物对双层脂膜对小溶质(包括阿霉素)渗透性的影响〉，《生物化学与生物物理学学报‑生物膜》1468(1‑2)：73‑86。[0270](erukova,veronikayu,oksanao.krylova,yurin.antonenko,andnickolays.melik‑nubarov.2000."effectofethyleneoxideandpropyleneoxideblockcopolymersonthepermeabilityofbilayerlipidmembranestosmallsolutesincludingdoxorubicin."5biochimicaetbiophysicaacta‑biomembranes1468(1—2):73—86.)[0271]弗纳尔，大卫等，2013。“维克托福星‑1，一种新的病毒进入增强子，强烈促进人类造血干细胞的慢病毒转导。”分子治疗核酸2(3月)：e90。[0272](fenard,davidetal.2013."vectofusin‑l,anewviralentryenhancer,stronglypromoteslentiviraltransductionofhumanhematopoieticstemcells."moleculartherapynucleicacids2(march):e90.)[0273]芬克、萨布丽娜等，2008，“慢病毒载体进入靶细胞”，《分子治疗：美国基因治疗学会杂志》16(8)：1427‑36。[0274](funke,sabrinaetal.2008."targetedcellentryoflentiviralvectors."moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy16(8):1427—36.)[0275]格鲁伯，a等，2000，“由多重缺失的hiv‑i载体转导的树突状细胞在体外表现出正常的表型和功能，并引发hiv特异性细胞毒性t淋巴细胞反应”，《血液》96(4)：1327‑33。[0276](gruber,aetal.2000."dendriticcellstransducedbymultiplydeletedhiv‑ivectorsexhibitnormalphenotypesandfunctionsandelicitanhiv‑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