一种具有抗癌功能的色氨酸缺乏组合食品及其制备方法与流程

1.本发明涉及功能性食品领域，特别是涉及一种具有抗癌功能的色氨酸缺乏组合食品及其制备方法。


背景技术：

2.根据统计，大约10％的恶性疾病在发展阶段都可以治愈。对不同癌症需要采用不同的化疗方案，这使得癌症在中后期造成更严重的病变。在许多情况下，阻碍癌症治疗的原因在于进行化学疗法或化疗期间细胞的癌基因可能发生突变。最终结果是对化疗方法产生抗药性。
3.迄今为止已知的癌症治疗策略并不适合所有癌症患者。他们大多数在治后具有高副作用和并发症的发生率。另一个问题癌症治疗药物副作用率高，这使得很多人不适用于某些癌症治疗药物。在这些情况下，新药和治疗概念必须不断发展。近年来，各种新的先进治疗方法制定了策略。例如，利用生物反应器，产生抗肿瘤酶可作为体外癌症治疗方法，以提供治疗不同癌症的新可能。另一种可能性是饥饿疗法。通过消耗人体合成蛋白质的必须氨基酸来抑制肿瘤生长。
4.基德(kidd)于1953年首次发表了将血清氨基消耗作为一种有效的抗癌药。他的研究表明，正常豚鼠血清可诱导某些类型的动物淋巴瘤衰退。随后，在1961年，布鲁姆(broome)证明了在正常的豚鼠血清中，门冬酰胺酶是重要的抗肿瘤物质，它清除了血清中非必需氨基酸l
‑
天冬酰胺。目前市场上没有通过消耗氨基酸来起到抗癌作用的相关食品。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种具有抗癌功能的色氨酸缺乏组合食品，该食品能够有效提高机体抗肿瘤能力，为人类的癌症治疗阶段提供一种新方法。
6.本发明的目的还在于提供上述具有抗癌功能的色氨酸缺乏组合食品的制备方法。
7.本发明的目的采用下述技术方案实现：
8.一种具有抗癌功能的色氨酸缺乏组合食品，为经色氨酸侧链氧化酶(tso)处理的低l
‑
色氨酸组合物。所述的低l
‑
色氨酸组合物优选包含如下按质量百分比计的组分：小麦粉35
‑
40％、玉米粉20
‑
25％、大豆粉20
‑
23％、菠菜粉胡萝卜粉混合蔬菜粉15％、食盐1％、骨粉1％；其中，所述的混合蔬菜粉中菠菜粉和胡萝卜粉两者的质量比优选为1:1。这些原料配比仅使得食品中的l
‑
色氨酸含量降低，而其他人体所需的营养成分均不受影响。这些原料可通过购买上市的材料制作成干粉获得。
9.所述的具有抗癌功能的色氨酸缺乏组合食品的制备方法，包括如下步骤：
10.(1)按上述质量百分比将小麦粉、玉米粉、大豆粉、菠菜粉胡萝卜粉混合蔬菜粉、食盐和骨粉混匀，得到食品干粉。
11.(2)向食品干粉中添加色氨酸侧链氧化酶(tso)酶液进行酶解。
12.(3)酶解产物加热使酶失活，再进行冷冻干燥，得到所述的具有抗癌功能的色氨酸
缺乏组合食品。
13.优选的，步骤(1)中，所述的菠菜粉胡萝卜粉的制备为：菠菜、胡萝卜用蒸馏水清洗，静置脱水，再将其研磨成粉状，研磨后在50
‑
60℃下热风干燥1
‑
2h，使水分含量低于10％。
14.优选的，步骤(2)为：向食品干粉中添加3mg/ml的色氨酸侧链氧化酶酶液，添加质量比为100:1，添加适量水后调节ph至7.0
‑
7.5，在37℃下恒温孵育2
‑
6h。
15.优选的，步骤(2)中，所述的色氨酸侧链氧化酶通过培养假单胞菌atcc29574得到；进一步地，所述的色氨酸侧链氧化酶通过包括下述步骤的方法制备得到：
16.①
将冻藏的假单胞菌atcc29574接种到液体肉汤培养基中，在30℃的恒温摇床中200rpm摇动条件下培养24小时，以扩增菌株数量。随后将扩增后的菌液按体积比1:20接种至2％bbl液体培养基在30℃、200rpm下培养36小时，在完成细菌的对数生长并达到稳定的生长阶段(细菌含量约为20
×
10
10
/ml)后，在4℃下10000
×
g离心30分钟，收集菌体。若需贮藏，则将菌体贮存在
‑
80℃温度条件下。
17.②
采用细菌活性化蛋白制备裂解液对假单胞菌atcc29574菌体进行总蛋白的提取，提取液在4℃下10000
×
g离心30min，保留上清液，即得到粗酶液。
18.③
采用亲和层析的方法对粗酶液进行纯化。所用的平衡液为0.002m醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)，洗脱液为0.2m醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)。用0.2m醋酸钠缓冲液洗脱的蛋白溶液采用超滤管进行浓缩，得到色氨酸侧链氧化酶酶液，将酶液于4℃保存备用。
19.l
‑
色氨酸被认为是重要的癌症的营养物质，而这些低色氨酸含量食品中的色氨酸去除可以导致减少和破坏肿瘤病人体内的肿瘤生长微环境，可在局部和系统上影响肿瘤发生和肿瘤进展。因此该色氨酸缺乏组合食品可增加抗癌活性和免疫系统的调节，适合作为天然抗癌的功能性食品。
20.与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
21.本发明所选用的色氨酸侧基氧化酶，是从假单胞菌株atcc29574分离提取纯化的一种酶。在目前食品现存的代餐食品中，无法做到特异性降解某种氨基酸达到癌症辅助治疗作用，故采用酶解法针对性的降解组合食品中色氨酸，是本发明的核心点之一。本发明的色氨酸缺乏组合物以假单胞菌株atcc29574产生制备色氨酸侧链氧化酶干粉为原料直接投料，按质量百分比科学配比制备而成。其制备工艺简单，避免制备过程中造成的损失及由于色氨酸侧链氧化酶的性质差异造成的产品层次不齐的缺点，使产品纯度更高，杂质少，安全性能更高，质量更均匀稳定，效果优异。
22.本发明通过挑选市面上色氨酸含量相对较低的食品，并按照中国膳食指南推荐标准，在保证碳水化合物等其他营养元素的情况下，针对性的降低组合食品中色氨酸的含量，选取淀粉类、豆类、蔬菜类进行配比并组合，再用自制分离纯化的色氨酸侧基氧化酶进行酶解，使酶解后食品几乎不含有色氨酸，从而广泛应用于色氨酸缺乏性食品所需要的领域。值的注意的是，由于色氨酸侧基氧化酶对于色氨酸的酶解能力是特异性的，故该制备方法可以广泛应用于不同的食品组合，从而得到不同的具有抗癌功能的色氨酸缺乏的组合食品。本发明经科学配制而成，无毒副作用，既有营养价值，且价格低廉，工艺简单，充分利用色氨酸缺乏对肿瘤生长环境的影响，抑制肿瘤细胞增殖，从而达到抗肿瘤的效果。有理由认为，色氨酸缺乏抗癌组合食品可能被用作未来治疗方案中新的抗癌辅助剂。
23.本发明利用日常食品制作成一种色氨酸缺乏的，极大的保存了食品的营养成分。同时其能一定程度抑制肿瘤的生长，产生了意想不到的功效。
附图说明
24.图1是实施例2不同分组hcclm3细胞的cck8实验检测结果图；图中，tso：含tso酶的dmem完全培养基；5
×
：5
×
色氨酸dmem完全培养基；10
×
：10
×
色氨酸dmem完全培养基；nc：dmem完全培养基。
25.图2是实施例3中小鼠经不同食品饲喂后的肿瘤大小图。
具体实施方式
26.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
27.实施例1
28.一种具有抗癌功能的色氨酸缺乏组合食品的制备方法，具体步骤如下：
29.(1)原料准备：小麦粉、玉米粉、大豆粉、食盐、骨粉均为市场上购买的成品。菠菜、胡萝卜用蒸馏水清洗，静置脱水，再将其研磨成粉状，研磨后在50
‑
60℃下热风干燥1
‑
2h，使水分含量低于10％，备用；或直接在市场上购买蔬菜粉。
30.(2)按小麦粉40％、玉米粉20％、大豆粉23％、菠菜粉7.5％、胡萝卜粉7.5％、食盐1％、骨粉1％的比例混合，得到食品干粉。
31.(3)向食品干粉中添加3mg/ml的色氨酸侧链氧化酶(tso)酶液，添加质量比为食品干粉：酶液＝100:1，添加少量蒸馏水使液面刚好完全覆盖食品干粉，调节ph至7.0
‑
7.5，在37℃下恒温孵育6h得到食品混合液。
32.上述色氨酸侧链氧化酶通过下述步骤制备：
33.①
将冻藏的假单胞菌atcc29574接种到液体肉汤培养基(becton
‑
dickinson，cockeysville，md，usa，产品编号是23400)中，在30℃的恒温摇床中200rpm摇动条件下培养24小时，以扩增菌株数量。随后将扩增后的菌液按体积比1:20接种至2％bbl液体培养基在30℃、200rpm下培养36小时，在完成细菌的对数生长并达到稳定的生长阶段(细菌含量约为20
×
10
10
/ml)后，在4℃下100＝000
×
g离心30分钟，收集菌体。若需贮藏，则将菌体的贮存在
‑
80℃温度条件下。
34.②
采用细菌活性化蛋白制备裂解液(生工no.c500020)对假单胞菌atcc29574菌体进行总蛋白的提取，提取方法按试剂盒所给的操作说明提取。提取液在4℃下10000
×
g离心30min，保留上清液，即得到粗酶液。
35.③
采用亲和层析的方法运用akta蛋白纯化仪对粗酶液进行纯化。所用的平衡液为0.002m醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)，洗脱液为0.2m醋酸钠缓冲液(ph＝5.5)。用0.2m醋酸钠缓冲液洗脱的蛋白溶液采用超滤管进行浓缩，得到3mg/ml的色氨酸侧链氧化酶酶液，将酶液于4℃保存备用。
36.(4)将食品混合液加温至溶液沸腾，并保持5
‑
10s使酶完全失活。冷却至室温，随后转入
‑
20℃预冻。
37.(5)将预冻后的食品进行真空冷冻干燥，得到所述的具有抗癌功能的色氨酸缺乏
组合食品，其色氨酸浓度小于1μg/mg，低于最低检测限。
38.实施例2
39.1、查询dmem培养基中色氨酸的含量，并按照其中色氨酸的含量分别添加色氨酸标准品，配制5倍和10倍于dmem完全培养基(10％fbs)中色氨酸浓度的5
×
色氨酸dmem完全培养基、10
×
色氨酸dmem完全培养基，配制后用0.22μm微孔滤膜过滤备用。各培养基的详细配方如下表1所示。
40.表1
[0041][0042][0043]
2、将hcclm3细胞按照4组(tso、5
×
、10
×
、nc)接种于6孔板中，添加2ml opti
‑
mem培养基培养使其贴壁。随后，tso组、5
×
组、10
×
组换用含tso酶(9μg/ml)的dmem完全培养基、nc组换用dmem完全培养基继续培养48h。再对tso组、5
×
组、10
×
组分别换用含tso酶的dmem完全培养基、5
×
色氨酸dmem完全培养基、10
×
色氨酸dmem完全培养基，nc组继续采用dmem完全培养基，培养48h。
[0044]
3、将6孔板中hcclm3细胞消化，取细胞悬液加到96孔板，每孔100μl，每组细胞做5个副孔，培养24h。随后进行cck8实验检测，结果见图1。
[0045]
由结果可知，含tso酶的dmem完全培养基中，色氨酸被降解，故hcclm3细胞的生长受到了抑制。而在细胞培养基中补充了色氨酸之后，hcclm3细胞的生长水平明显提高，故能说明加了高浓度色氨酸培养基后，tso酶的降解作用被逆转。表明色氨酸的缺乏会导致hcclm3细胞的生长受到抑制。
[0046]
实施例3
[0047]
1、在5周龄balb/c
‑
nu小鼠中建立小鼠异种移植模型。通过细胞计数确定t25培养瓶中细胞含量，根据细胞计数结果取约5
×
106个的hcclm3细胞悬浮于100μl pbs中，注射到小鼠左背侧皮下。
[0048]
2、肿瘤接种后，先用市面上购买的小鼠饲料喂养2周左右，当肿瘤大小达到约50mm3时，一组换用自研的色氨酸缺乏组合代餐食品(实施例1制备的色氨酸缺乏组合食品)，另一组换用未经tso酶处理的普通组合代餐食品(实施例1步骤(2)得到的食品干粉)进行灌胃喂养。将组合代餐食品加少量纯净水制成冲剂。按1g/10g的量对小鼠进行灌胃，每天饲喂2次。两组小鼠的饲喂方式相同。饲喂3周后，肉眼可见小鼠皮下肿瘤大小有明显差异。对小鼠进行解剖处理，从皮下取出肿瘤，并用刻度尺测量，拍照。实验结果见图2：采用色氨酸缺乏组合代餐食品饲喂的小鼠，其肿瘤的大小明显小于未经tso酶处理的普通组合代餐食品饲喂的小鼠。故可说明，本发明的色氨酸缺乏组合食品能在一定程度上抑制肿瘤的生长，起到了意想不到的作用。
[0049]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。