一种聚对苯二甲酸乙二醇酯-肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法及其应用与流程

一种聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法及其应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(mscs)是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新及多向分化的潜能。间充质干细胞由于易分离，免疫原性和免疫调节特性低且不存在伦理方面的问题而成为组织工程的理想种子细胞。此外，mscs还具有抗肿瘤、抗纤维化、抗凋亡、抗炎、促血管生成、神经保护、抗菌和化学吸引等作用，这种独特的特性使间充质干细胞在再生医学、炎症性疾病以及越来越多的癌症治疗领域具有广阔的应用前景。
3.目前，间充质干细胞的培养一般采用传统的塑料培养瓶来进行。但培养瓶培养难以模拟细胞在体内生长的微环境，存在以下缺点：(1)损害mscs自我更新能力，使得mscs扩增效率降低。(2)mscs细胞老化、诱使发生“自发性”分化，损害其多向分化的潜能，使mscs在科研和临床应用面临着巨大的挑战。因此，在体外构建mscs生长的天然微环境(包括与体内微环境类似的微观结构、诱导因子与基质蛋白等)是解决mscs体外培养问题的重要途径。
4.脱细胞化的细胞外基质是最接近天然组织的支架材料，具有天然组织中的复杂成分，包括i型和iii型胶原蛋白、粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白和大分子蛋白聚糖等，而且具有与体内微环境相似的三维结构和柔韧性。同时，脱细胞处理后原有细胞留下的空间能为以后的mscs培养提供足够的生长空间。此外，细胞分泌的ecm能在体外重建和模拟体内的微环境，并调控mscs在ecm中的细胞行为，从而影响mscs的自我更新能力和定向分化潜能。但单纯的细胞外基质材料存在力学性能差、难加工、难以批量生产等缺点，因此，亟需对细胞外基质材料进行改善以使其满足体外细胞培养、生物反应器、类器官组织培育和疾病模型构建等需求。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法。
6.本发明的第二个目的是提供采用上述的制备方法制备得到的聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料。
7.本发明的第三个目的是提供上述的聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料的应用。
8.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
9.本发明提供了一种聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)
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肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法，即，首先在pet纤维的表面接枝聚多巴胺(pda)，然后将猪肺组织脱细胞外基质(decm)浇铸在pet海绵上，最后经干燥即得聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复
合材料。
10.作为本发明的一个优选实施方式，上述的一种聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法，包括以下步骤：
11.s1、利用多巴胺在碱性条件下自聚合为聚多巴胺的特性在pet纤维的表面接枝聚多巴胺颗粒，得到聚多巴胺改性的pet海绵；
12.s2.利用triton x
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100试剂对猪肺组织进行脱细胞处理，然后使用胃蛋白酶对脱细胞后的肺组织进行酶解消化，最后经透析得到液化的猪肺脱细胞溶液；
13.s3、将步骤s2的猪肺脱细胞溶液均匀浇铸在步骤s1得到的聚多巴胺改性的pet海绵上，经干燥即可得到聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料。
14.本发明利用pet纤维的高比表面积和高吸附性，在其表面接枝上聚多巴胺，然后使用triton x
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100和胃蛋白酶对猪肺组织进行脱细胞和酶解消化，并将酶解后的肺脱细胞溶液浇铸在改性后的pet海绵上，制备得到pet
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肺组织脱细胞外基质复合材料。由于本发明采用pet海绵作为基材，pet具备多孔结构和良好的力学性能，可以作为材料的支持骨架，使制备得到的pet
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肺组织脱细胞外基质支架材料具有良好的力学性能和生物相容性，同时可加工成各种需要的形状。猪肺组织经脱细胞后清除了细胞抗原和遗传物质，保留了大量的细胞外基质蛋白和活性因子，有利于细胞的粘附、增殖及正常功能表达。用于培养间充质干细胞，可以有效促进间充质干细胞增殖、迁移、分化，有望作为组织修复载体和构建肺组织体外疾病模型，在组织工程领域具有很高的应用前景。
15.优选地，聚多巴胺改性的pet海绵的具体制备方法为：将pet海绵浸泡在浓度为4
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6mg/ml的多巴胺乙醇溶液中，浸泡至乙醇挥发掉后加入ph＝8.8的tris
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hcl缓冲液，避光孵育后经洗涤、干燥即得。具体地，所述多巴胺乙醇溶液的浓度为5mg/ml。
16.优选地，步骤s2的脱细胞处理为：将猪肺组织浸泡在1％的triton x
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100溶液中处理12
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36h。具体地，处理的时间为24h。
17.优选地，步骤s2的酶解消化为：将脱细胞后的肺组织浸泡浓度为1
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2mg/ml的胃蛋白酶溶液中，然后置于37℃恒温摇床下消化60
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84h。具体地，胃蛋白酶溶液的浓度为1mg/ml,消化的时间为72h。
18.优选地，步骤s2所述透析为使用截留分子量为8000da的透析袋在4℃下透析1
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3天。具体地，透析的时间为2天。
19.优选地，步骤s3中，每24孔板大小的pet海绵浇铸500
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1000μl的猪肺脱细胞溶液，浇铸后置于
‑
80℃下冷冻过夜，最后冷冻干燥24
‑
36h。
20.本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料。
21.本发明还提供了上述的聚对苯二甲酸乙二醇酯
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肺组织脱细胞外基质复合材料在间充质干细胞体外培养中的应用。
22.本发明还提供了上述的聚对苯二甲酸乙二醇酯
‑
肺组织脱细胞外基质复合材料在组织工程中的应用。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24.本发明提供一种聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)
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肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法，由pet纤维材料经聚多巴胺改性后，浇铸脱细胞、酶解消化处理后的肺组织脱细
胞外基质制备得到。本发明提供的pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料，材料来源广泛易得，制备方法简单，无需大型设备，制备过程无毒无害。由于pet纤维本身具有良好的力学性能和大量的孔洞结构，通过引入聚多巴胺颗粒作为活性位点后其亲水性得到了提高，从而更有利于细胞的粘附。肺组织脱细胞外基质则保留了大量的胶原蛋白和多糖类物质，可以大幅度提高支架材料的生物相容性和细胞相容性，用于培养间充质干细胞，有利于细胞的增殖、迁移，以及向愈伤组织分化。同时，本发明的pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料有望作为体外疾病模型和体内组织修复的支架，在组织工程领域具有很高的应用前景及实用价值。
附图说明
25.图1为猪肺组织脱细胞经酶解消化后的宏观图片；
26.图2为猪肺组织脱细胞前后的dapi染色图片(a、b、c分别为脱细胞前，脱细胞后，酶解液化后的dapi染色图片)；
27.图3为猪肺组织脱细胞前后的dna、胶原蛋白(collagen)和糖胺聚糖(gag)的定量图(a、b、c分别为dna、胶原蛋白和多糖的定量)；
28.图4为pet海绵涂覆脱细胞外基质后的宏观照片；
29.图5为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料的扫描电镜图(a为pet海绵，b为接枝聚多巴胺后的pet海绵，c为接枝聚多巴胺和脱细胞外基质的pet海绵)；
30.图6为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料的x射线光电子能谱图；
31.表1为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料的光电子能谱分析表面相对元素含量；
32.图7为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料的傅里叶变换红外光谱图；
33.图8为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料浸提液的细胞毒性结果图；
34.图9为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料对细胞增殖率的影响情况；
35.图10为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料的fda染色图；
36.图11为pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料培养细胞后的扫描电镜图(a、b分别为pet/pda、pet/pda/decm载体培养hucmscs 7天后的扫描电镜图，c、d为培养14天后的图片)。
具体实施方式
37.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
38.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
39.实施例1猪肺组织脱细胞外基质的制备
40.取肺叶远离支气管、次级支气管的尖端部分，并将其切成几个毫米厚的小薄片，用去离子水反复清洗；将切碎的肺组织置于0.1％w/v的过氧乙酸/4％乙醇溶液中浸泡1h，并用去离子水清洗5遍；将清洗完后的肺组织置于1％triton x
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100中，室温搅拌24h(转速为200rpm)，并相继用pbs清洗3遍，去离子水冲洗10遍以清除去垢剂；清洗后浸泡在0.3％明胶溶液中，室温下置于摇床上摇晃1h，重复1次，然后用去离子水冲洗6遍；再用1m nacl溶液对
肺组织清洗2次，每次浸泡0.5h，并用去离子水清洗5遍；清洗后再将肺组织置于0.1％过氧乙酸/4％乙醇溶液中浸泡1h，并用去离子水清洗10遍；得到脱细胞化的肺组织后用浓度为1mg/ml的胃蛋白酶/0.01m hcl溶液在室温下持续搅拌(100
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200rpm)，消化72h。最后使用截留分子量为8000da的透析袋在4℃下对酶消化后的肺组织透析2天，即可制备得到肺脱细胞外基质，即猪肺脱细胞溶液。如图1所示，脱细胞以及酶解消化后的肺组织呈白色粘稠状液体。
41.对脱细胞前后的肺组织进行dapi染色，结果如图2所示，未脱细胞的肺组织含有大量的细胞，dapi染色显示出大量细胞核；而脱细胞后，几乎看不到蓝色的细胞核。
42.对脱细胞前后的肺组织进行dna，多糖(糖胺多糖，gag)和胶原定量。
43.(1)dna定量：采用hoechst 33258法进行dna定量：将制得到的肺脱细胞样品置于
‑
20℃中冷冻干燥，冻干后的组织取10～50mg，撕碎，用1ml浓度为0.3mg/ml的木瓜蛋白酶60℃消化水解过夜；
44.将hoechst 33258染色液用去离子水配成1mg/ml的母液，4℃避光保存，使用时稀释到0.1g/ml的工作液浓度，往每100μl消化水解过夜的待测液中加入2ml染色液避光染色5min；然后使用荧光分光光度计检测352/461nm处的荧光，设定激发波长为350nm，扫描范围400
‑
550nm，bandpass＝5nm，step size＝1nm，并以鱼精dna用作标样。
45.(2)多糖定量：采用dmmb法进行多糖定量：取10～50mg冻干后的肺脱细胞组织样品，用1ml浓度为0.3mg/ml的papain消化过夜；
46.配制dmmb染色液：称取16mg dmmb粉末，3.04g甘氨酸，2.37g nacl和95ml 0.1m hcl溶于1l水中，溶液ph＝3.0，室温避光储存。往每100μl消化过夜的待测液中加入2.5ml dmmb染色液，室温避光摇晃5s；立即使用紫外可见分光光度计检测525nm处的吸光值，并以硫酸软骨素用作标样；
47.(3)胶原定量：采用羟脯氨酸法进行胶原定量：取10～50mg肺脱细胞组织样品用6m hcl(浓盐酸与去离子水1:1(v/v)稀释)在120℃下水解12h，并于70℃下水浴蒸干水解液，然后加入2ml去离子水配成待测液；在待测液中加入1ml 0.05m的氯胺t溶液，25℃反应20min；再加入1ml 3.15m的高氯酸(避光保存)，室温下放置5min；最后再加入1ml 10％的对二甲氨基苯甲醛溶液，60℃反应40min，溶液显暗紫红色。冷却后，立即在紫外
‑
可见分光光度计上检测560nm处的吸光度。
48.结果如图3，脱细胞后dna含量显著下降，可以大大减少移植后的免疫反应；而多糖和胶原含量得到了保留，这些成分可以促进细胞生长。
49.实施例2 pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料的制备
50.将pet海绵裁剪成24孔板大小的圆形材料，厚度为2mm左右，将pet海绵置于5mg/ml多巴胺乙醇溶液浸泡1h，浸泡过程中不断摇晃，然后于超净台中转移到培养皿中让乙醇自然挥发(0.5h)，再加入ph＝8.8的tris
‑
hcl缓冲溶液避光浸润过夜(12h)，每片载体约加0.2ml，让载体接枝上聚多巴胺【至此得到聚多巴胺改性的载体(pet/pda)】；然后将pet载体放入24孔板中，每孔加入约500μl实施例1的脱细胞溶液，
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80℃冷冻一晚(12h)，然后冻干(使用冻干机冻干)，制备得到pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料(pet
‑
decm或pet
‑
pda
‑
decm)，该复合材料的宏观照片如图4所示，图4结果表明，经过加工(如剪刀、刀片裁剪等)，该复合材料可以制备成多种形状，极大方便了它们在不同场景的应用。
51.实验例1性能测试
52.(1)表面形貌观察
53.将实施例2制备得到的pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料固定在样品台上，然后采用离子溅射仪进行喷金处理，喷金后置于热场发射扫描电镜的真空室中进行真空处理，当真空度达到10
‑3kpa以上时，在加速电压20kv，电流10ma下观察样品。结果如图5所示，图a为pet，图b为聚多巴胺改性的pet(pet/pda)，图c为聚多巴胺改性的pet接枝肺脱细胞外基质复合材料(pet/pda/decm)。
54.从图5可以看出，pet海绵中纤维不规则排列，形成大量孔洞结构，接枝聚多巴胺后，纤维表面出现均匀分布的颗粒；而接枝肺脱细胞外基质后脱细胞外基质呈网状薄膜均匀附着在纤维上，更有利于细胞的粘附。
55.(2)表面元素分析
56.采用x
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射线光电子能谱仪对实施例2制备得到的pet海绵
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肺脱细胞外基质复合材料(pet
‑
decm或pet
‑
pda
‑
decm)进行表面元素分析【以pet或聚多巴胺改性的pet(pet
‑
pda)为对照】，真空度为2
×
10
‑9mpa，x光源使用单色化的al kα源，在结合能为0
‑
1350ev下对样品进行扫描，以表面污染c1s(284.8ev)为标准进行能量校正。结果如图6所示。
57.从图6可以看出，pet接枝聚多巴胺颗粒后，检测出了n元素，在接枝脱细胞外基质后，n元素的含量进一步提升，约为10.93％(表1)。
58.表1 pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料的元素含量
[0059][0060]
(3)官能团分析
[0061]
采用傅里叶变换红外光谱仪分析实施例2制备得到的pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料的表面相关化学键的存在，扫描范围为4000
‑
400cm
‑1，分辨率为4cm
‑1。结果如图7所示。
[0062]
从图7可以看出，pet海绵在接枝聚多巴胺后，在3200
‑
3400cm
‑1之间出现
‑
nh和
‑
oh的伸缩振动峰；接枝脱细胞外基质后，在1624cm
‑1和1535cm
‑1附近出现酰胺i带和酰胺ii带峰，说明细胞外基质蛋白的成功接枝。
[0063]
(4)细胞毒性测试
[0064]
称取0.5g实施例2制备的pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料到无菌离心管中，加入5ml细胞培养基(dmem高糖培养基 10％胎牛血清 1％双抗)，在37℃培养箱中放置72h，然后使用0.22μm滤膜过滤除菌。实验过程一共分为3组：正常培养基组，待测培养基组，正常
‑
待测培养基组(正常培养基：待测培养基＝1:1)。将100万个3t3细胞(购买自武汉普诺赛生命科技有限公司)接种于t75培养瓶中，每两天换一次液，直到细胞长到80％融合度，得到对数生长期的3t3细胞。取对数生长期的3t3细胞按5
×
103个/cm2的密度接种于24孔板中，每组3个平行样，培养24h后更换待测培养基或正常
‑
待测培养基(正常培养基组则不更换培养
基)继续培养24h。弃去培养基，用pbs清洗2遍，每孔加入1ml 0.5mg/ml的mtt溶液，37℃孵育4h后，加入500μl dmso，摇晃10min，吸取100μl液体到96孔板中，使用酶标仪检测490nm处的吸光值。结果如图8所示。
[0065]
图8的结果表明，制备的pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料没有细胞毒性，而且该复合材料的浸提液可以促进细胞生长。
[0066]
(5)细胞增殖率测试
[0067]
将人脐带间充质干细胞(huc
‑
mscs，购买自广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司)接种于t75培养瓶中，每两天换一次液，直到细胞生长至80％的融合度，培养得到对数生长期的huc
‑
mscs细胞，然后按1
×
105/片的密度接种在试验材料(pet/pda，pet/pda/decm)上，置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养，分别于第1、3、5、7、10、14天采用0.2％i型胶原酶消化计数，对照组为在传统塑料瓶(tcps)中培养的细胞，实验组为生长在pet/pda或pet/pda/decm上的细胞。结果如图9所示。
[0068]
从图9中可以看出，在培养前7天，细胞在tcps上增殖最快，而7天之后，tcps上的细胞逐渐停止生长，pet/pda和pet/pda/decm载体则仍保持高速增长。
[0069]
(6)用于人脐带间充质干细胞培养的fda染色实验
[0070]
将huc
‑
mscs细胞培养至对数生长期后按5000个/cm2的密度接种在六孔板中，每两天换一次液，然后取第7天和第14天的细胞做fda染色。
[0071]
1)称取10mg fda粉末放在15ml离心管中，加入5ml丙酮，无需过滤，配成2mg/ml的母液，4℃避光保存；染色时用无菌pbs稀释1000倍，制成2μg/ml的fda工作液。
[0072]
2)吸走孔板中的培养基，用pbs润洗三次，每孔加入1.5ml的2μg/ml fda工作液，在培养箱中避光孵育5min左右；孵育结束后，移走fda溶液，并用pbs润洗三遍，保持样品湿润，采用480nm的激发波长在倒置荧光显微镜下观察细胞的分布形态。结果如图10所示。
[0073]
图10结果表明，干细胞在复合支架内生长状态良好，形态饱满，可观察到细胞均匀分布。
[0074]
(7)用于人脐带间充质干细胞培养的扫描电镜观察
[0075]
按步骤(5)的方法将人脐带间充质干细胞培养至第7和14天时，各取一片载体用pbs清洗两遍，并4％多聚甲醛固定0.5h，然后快速用去离子水清洗2遍，置于
‑
80℃冷冻过夜，然后冻干，对冻干后的样品喷金后置于扫描电镜下观察。结果如图11所示。
[0076]
图11结果表明，细胞在pet海绵
‑
肺脱细胞外基质复合材料上粘附良好，分布于支架材料的表面和内部，可观察到细胞分泌了大量的细胞外基质。
[0077]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。