含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.缓激肽是一个潜在的炎症性肽段，它是由高分子量激肽原在激肽释放酶的作用下产生的血管活性物质，主要通过自分泌-旁分泌机制以局部激素的形式与缓激肽受体结合来发挥作用，包括血管舒张，平滑肌痉挛，水肿，以及疼痛和痛觉过敏。研究表明缓激肽是许多癌症的一个重要的生长因子，如肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等。它不仅直接刺激癌细胞生长，也通过刺激基质金属蛋白酶(mmp)活性酶来刺激癌迁移和侵袭。并且在肿瘤中，缓激肽主要是通过刺激分泌血管内皮生长因子来刺激新生血管形成。这些活动共同促进某些肿瘤类型的生长和侵袭性。
3.pl-ac-15是江苏普莱医药生物技术公司提供的一种氨基酸衍生物(见中国专利cn107382827a)，具有较好的抗肿瘤作用。在此其基础上通过进一步的结构改造以期获得抗肿瘤效果更佳的化合物。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是提供一种含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物及其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物或异构体(包括立体异构体、对映异构体、互变异构体或其混合物)。
5.本发明所提供的含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物的结构式如式i所示：
[0006][0007]
其中，r选自下述式a-式f中任一所示的基团，或式a-式f上的氢任选被一个或多个r1取代的基团；
12环烷基、c6-12芳基、3-12元杂脂环族、5-12元杂芳基、-cn、-c(＝o)(ch2)nch3、-c(＝o)o(ch2)nch3、-c(＝o)n[(ch2)nch3]2、-c(＝o)oh、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(ch2)nch3、-no2、-nh2、-nh(ch2)nch3、-n[(ch2)nch3]2、-nhc(＝o)(ch2)nch3、-nhs(＝o)2(ch2)nch3、-oh、-oc(ch2)nch3、＝o、-oc(＝o)(ch2)nch3、-s(＝o)(ch2)nch3、-os(＝o)(ch2)nch3以及-s(＝o)2n[(ch2)nch3]2；
[0014]
所述m选自0、1或2；
[0015]
所述n选自0、1、2、3、4或5。
[0016]
在其中一些实施方案中，本发明所述的含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物，可以列举为如下所示结构，但不局限于以下结构：
[0017]
化合物pl-ac-201，其化学结构为：
[0018][0019]
化合物pl-ac-202，其化学结构为：
[0020][0021]
化合物pl-ac-203，其化学结构为：
[0022][0023]
化合物pl-ac-204，其化学结构为：
[0024][0025]
化合物pl-ac-205，其化学结构为：
[0026][0027]
化合物pl-ac-206，其化学结构为：.
[0028][0029]
本发明中使用的术语“烷基”是指仅由碳原子和氢原子组成、且不具有不饱和度(例如双键、三键或环)的基团，其涵盖了各种可能的几何异构基团与立体异构基团。该基团通过单键与分子的其余部分相连。作为烷基的非限制性实例，可以列举以下直链或支链的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基及其另外七种异构体、正己基及其另外十六种异构体、正庚基及其各种异构体、正辛基及其各种异构体、正壬基及其各种异构体、正癸基及其各种异构体。
[0030]
本发明中使用的术语“环烷基”是指由至少3个碳原子组成的饱和非芳香环系，该环系可以是单环、双环、多环，也可以是稠环、桥环、螺环。作为环烷基的非限制性实例，可以列举以下基团：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基；以及由两个或多个上述单环通过公共边和公共碳原子形成的稠环、桥环或螺环基团。
[0031]
本发明中使用的术语“芳基”可以单独使用或作为“芳基烷基”的一部分，是指共含
有6-14元环的单环，双环和三环的碳环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含3-7元环，且只有一个附着点与分子的其余部分相连。术语“芳基”可以和术语“芳香环”交换使用，如芳香环可以包括苯基，萘基和蒽基。
[0032]
本发明中使用的术语“杂芳基”是指具有一个或多个独立地选自n、o或s的杂原子的5-14元芳香族杂环环系，该环系可以是单环、双环、多环，其中双环和多环可以由单环通过单键连接方式或稠合方式形成。作为杂芳基的非限制性实例，可以列举以下基团：噁唑基、异噁唑基、咪唑基、呋喃基、吲哚基、异吲哚基、吡咯基、三唑基、三嗪基、四唑基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并吡喃基、咔唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、噌啉基、萘啶基、蝶啶基、嘌呤基、喹噁啉基、噻二唑基、吲哚嗪基、吖啶基、吩嗪基、酞嗪基、香豆素基、吡唑并吡啶基、吡啶并哒嗪基、吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡唑并哒嗪基；以及由上述杂芳基通过单键连接方式或稠合方式形成的基团。
[0033]
本发明化合物也可以以其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物或异构体(包括立体异构体、对映异构体、互变异构体或其混合物)的形式使用。式i所示化合物的生理学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、硬脂酸、鞣酸等的盐。合适的碱盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、n，n，-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。
[0034]
本发明的另一个目的是提供式i所示含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物的制备方法。
[0035]
本发明所提供的式i所示含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物的制备方法，包括下述步骤：
[0036]
1)式1所示化合物与式2所示化合物(1，1，2，2-4甲基-4-氨基哌啶)进行偶联反应，得到式3所示的叔丁氧羰基保护的肽；
[0037][0038]
2)将式3所示的叔丁氧羰基保护的肽脱去叔丁氧羰基保护基，得到式4所示化合物；
[0039]
[0040]
3)将式4所示化合物与式5所示化合物(非甾体抗炎药)进行偶联反应，得到式i所示的化合物。
[0041][0042]
其中，式5所示化合物中r的定义同式i。
[0043]
本发明的再一个目的是提供上述式i所示的含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物或异构体(包括立体异构体、对映异构体、互变异构体或其混合物)的应用。
[0044]
本发明所提供的应用包括下述方面：1)式i所示的含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物或异构体(包括立体异构体、对映异构体、互变异构体或其混合物)在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用；2)式i所示的含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物或异构体(包括立体异构体、对映异构体、互变异构体或其混合物)在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用。
[0045]
所述的癌症包括本领域中已知的各种癌症(实体癌或非实体癌)，包括但不限于：肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、人成骨肉瘤。
[0046]
所述癌细胞包括肝癌细胞(如bel-7402细胞、hepg-2细胞、sk-hep1细胞)、肺癌细胞(如a549细胞、h460细胞、h1299细胞、h292细胞)、乳腺癌细胞(如mcf-7细胞)、胰腺癌细胞(如bxpc-3细胞)、结肠癌细胞(如ht29细胞)、宫颈癌细胞(如hela细胞)、胃癌细胞(如sgc细胞)、前列腺癌细胞(如pc-3细胞)、人成骨肉瘤细胞(如mg63细胞)。
[0047]
以式i所示的含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物或异构体(包括立体异构体、对映异构体、互变异构体或其混合物)为活性成分制备的预防和/或治疗癌症的药物也属于本发明的保护范围。
[0048]
所述预防和/或治疗癌症的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
[0049]
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0050]
上述药物可以制成注射液、冻干注射剂、片剂(包括肠溶片)、胶囊剂、粉剂、口服液、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0051]
本发明还提供一种药物组合物。该药物组合物包括有效剂量的上述任一种含非甾体抗炎药结构的氨基酸衍生物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物或异构体(包括立体异构体、对映异构体、互变异构体或其混合物)。
[0052]
本发明的新型化合物可以通过人工合成的方法制备，该新型化合物具有广谱抗肿瘤作用，可延长肿瘤患者的生存期，提高肿瘤患者的生存质量。该化合物药效稳定，毒性低，易于人体接受，可以应用于大多数癌症的治疗，相对目前上市的抗肿瘤药物具有一定优势。
[0053]
本发明原料药优选制剂剂量范围是0.01-50mg。
[0054]
制备本发明口服固体制剂常用的辅料包括：微晶纤维素、低取代-羟丙基纤维素、
聚乙烯吡咯烷酮、微粉硅胶、淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉等。
[0055]
制备本发明口服液体制剂辅料包括：乙醇、羟苯乙酯、羟苯甲酯、聚山梨酯-80、苯甲酸钠、山梨酸、蜂蜜、蔗糖、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、硫脲、乙二胺四乙酸二钠、磷酸、枸橼酸、甘油、乳糖等。
[0056]
上述原料组分可与一定比例的常用药用辅料相配，按照本领域常规方法可制成包含注射剂、颗粒剂、胶囊剂等中的任一种。
[0057]
本发明提供的式i化合物是从头设计得到的全新的化合物。本发明中的化合物为一类缓激肽受体拮抗剂，通过抑制缓激肽与其受体结合来抑制肿瘤细胞的增长和侵袭，进一步抑制肿瘤的发生。
[0058]
相似结构的化合物可能存在有相同的作用机制，了解不同化合物的作用机制，有助于对本项目中的化合物及其类似物的临床应用前景及可能产生的问题有充分的认识，使研究开发更具有针对性。
附图说明
[0059]
图1为pl-ac-202的结构确证图谱。
[0060]
图2为pl-ac-203的结构确证图谱。
[0061]
图3为pl-ac-205的结构确证图谱。
[0062]
图4为pl-ac-206的结构确证图谱。
具体实施方式
[0063]
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0064]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0065]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0066]
下述实施例中涉及的pl-ac-15化合物的结构式如下所示：
[0067][0068]
其制备的详细内容参见中国专利cn107382827a。
[0069]
一、化合物的制备
[0070]
实施例1、制备化合物pl-ac-202
[0071]
pl-ac-202结构式如下所示：
[0072][0073]
制备方法如下：
[0074][0075]
1)依次将化合物1(1.0g，2.93mmol)、化合物2(458mg，2.93mmol)、bop(1.42mg，3.22mmol)和dipea(1.02ml，5.86mmol)加至干燥乙腈(50ml)中，反应液在室温下搅拌过夜，析出大量白色固体。用旋转蒸发仪减压浓缩，残余固体加入50ml水和50ml乙酸乙酯，分出有机层。水层再用乙酸乙酯萃取两次(50ml
×
2)，合并后依次用饱和nahco3溶液(30ml
×
3)，食盐水(30ml
×
3)洗涤，无水硫酸镁干燥后，硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷/甲醇(20∶1，v/v)洗脱，得产物3(1.25g)，白色固体，产率94％。
[0076]
2)将化合物3(749mg，1.56mmol)加入到25％tfa/dcm(50ml)中，室温下搅拌反应30min，反应完毕。减压浓缩，残余糖浆状物用适量甲醇溶解，在冰浴冷却搅拌下滴入饱和hcl/etoac溶液约10ml，10min后，减压浓缩，并用油泵抽至恒重，得到近白色固体产物4(658mg)，产率93％。
[0077][0078]
3)依次将化合物4(91mg，0.2mmol)，萘普生(0.22mmol)，hatu(114mg，0.3mmol)和dipea(0.13ml，0.8mmol)加至干燥dmf或二氯甲烷(3ml)中，反应液在室温下搅拌24小时。加水15ml，用二氯甲烷萃取三次(20ml
×
3)，合并有机层后用饱和nahco3和食盐水(10ml
×
3)洗涤，无水硫酸钠干燥后，硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷/甲醇洗脱，得目标产物。
[0079]1h-nmr(dmso-d6),d:1.05-1.15(m,2h,ch2),1.23-1.31(s,15h,ch3),1.56-1.57(m,1h,ch2),1.67-1.68(m,1h,ch2),2.83-2.89(m,2h,ch2),3.83(q，1h，ch)3.29(s,1h,3.8(s,3h,och3),3.92-3.94(m,1h,ch),4.49-4.51(m,1h,ch),7.25-7.76(m,15h,nh,arh),7.96(d,1h,arh),8.24(d,1h,arh),8.44(m,1h,nh).msm/z::592.25(mh

)
[0080]
核磁氢谱见图1。
[0081]
其它的式i化合物(如化合物式i-1、式i-3、式i-4、式i-5、式i-6)可参照上述方法进行制备，只需将步骤3中萘普生替换成对应的非甾体抗炎药即可。
[0082]
二、药效试验
[0083]
实施例2、式i所示化合物体外抗肿瘤活性实验
[0084]
选择人类肿瘤细胞株13株，培养于含10％灭活胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的rpmi-1640培养基(gibco公司)中，于37℃，5％co2培养箱培养，2天传代一次。采用mtt法，将对数生长期细胞，以0.25％胰酶消化，1000r/min离心5min，每孔加8
×
103个细胞，接种于96孔板，每孔加180μl细胞悬液，同时设置空白照孔。将接种肿瘤细胞的96孔板置二氧化碳培养箱中培养24h后加入药物20μl，空白对照孔加等体积的培养液，将药物从50μg/l-0.4μg/l分为8个浓度。每个药物浓度设3个复孔，放置于培养箱中继续培养24h。每孔加入10μl mtt溶液(5mg/ml)，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入100μl二甲基亚砜(dmso)溶液，置于微量震荡器上振荡10min，在酶标仪中以492nm波长测吸光度(a值)，按下列公式求出药物对肿瘤细胞的抑制率。
[0085]
本试验根据化合物抑制率，应用origin软件计算化合物对肿瘤细胞的ic
50
值。结果见表1。下表中的ac-201为pl-ac-201的简称，其它类推。
[0086]
表1.实施例化合物体外抗肿瘤活性实验ic
50
结果(nm)
[0087][0088][0089]
实施例3、实施例化合物溶血活性检测实验报告
[0090]
采用抗凝管抽取人血2-3ml，充分混匀，4℃备用。吸2ml血液加入2-3mlpbs，轻轻吹打，离心，5min，1000rpm，反复3-4次，最后1次离心后吸取pbs，加入pbs至40ml(20倍体积)，
此时血细胞数为2
×
108cells/ml。将红细胞悬液加至平板中(u型96孔板)，70μl/孔作为阴性孔。空白孔仅加入pbs，140μl/孔。将红细胞悬液2ml离心，弃去pbs，加入2ml纯水，混匀，140μl/孔作为阳性孔。将稀释的不同浓度多肽溶液加入平板，70μl/孔。37℃温育，87rpm，震荡2h，离心5min，3000rpm。酶标仪测od值：离心后吸取90μl上清并转移至平底96孔板中，酶标仪测定578nm处od值。od测-od阴＞0.1(符合条件的第一个浓度为mhc)。结果见表2。
[0091]
表2.实施例化合物溶血活性检测实验结果
[0092][0093]
实施例4、式i所示化合物的治疗指数
[0094]
将化合物的溶血浓度mhc与对各肿瘤平均ic
50
的比值称为治疗指数(ti)。通过治疗指数来评价化合物的安全性，治疗指数越高，说明化合物安全范围越大，目前结果显示pl-ac-201至206系列化合物相比pl-ac-15而言，治疗指数提升2-4倍，提示安全性更优，各个化合物治疗指数结果见表3。
[0095]
表3.实施例化合物治疗指数比较
[0096][0097]
实施例5、式i所示化合物单次给药对icr小鼠急性毒性实验
[0098]
采用icr小鼠，18-22g，普通级动物房饲养，喂以普通饲料，自由摄取。摸索实施例化合物dm和dn后确定组距及剂量。配制所需剂量的实施例化合物5个浓度。按体重分别尾静脉注射相应剂量的药物，空白对照组注射生理盐水。给药后立即观察并记录各动物的表现及死亡情况，观察记录单次给药后7天内动物可能出现的毒性反应或死亡情况。结果见表4。
[0099]
表4.实施例化合物单次给药对icr小鼠急性毒性实验结果
[0100][0101]
实施例6、腹腔注射给药对裸鼠移植瘤的抑制作用
[0102]
采用balb/c裸鼠，在无菌操作下按移植性肿瘤研究法接种bel-7402、hepg-2和sk-hep1肝瘤，细胞密度不少于5
×
106/ml，在每只小鼠右后肢腋窝皮下接种0.2ml。待接种细胞成瘤后腹腔给药(浓度为：5mg/kg)，每3d一次，共给药8次，停药第2d后，将荷瘤小鼠全部处死，称体重、瘤重以及肿瘤抑制率。见表5。
[0103]
表5.实施例化合物腹腔给药对balb/c荷瘤小鼠体重和瘤重的影响
[0104][0105][0106]
*p＜0.05，**p＜0.01与模型组比较；
△
p＜0.05，
△△
p＜0.01与pl-ac-15组比较。
[0107]
三、制剂实例实施例7、胶囊剂的处方及工艺(10mg/粒)
[0108]
表6.胶囊剂的处方
[0109][0110]
原辅料分别过100目筛。将预胶化淀粉100g、糊精100g、甘露醇80g、滑石粉7g和硬脂酸镁4g混合均匀，等量递增法与pl-ac-202混合至均匀。以羧甲基纤维素钠1％溶液为粘合剂制备合适软材。16-24目尼龙筛网制粒，制成的颗粒于55-60℃干燥。干颗粒10目筛网整粒，装入胶囊，即得。
[0111]
实施例8、口服液的处方及工艺(10mg/支)
[0112]
表7口服液的处方
[0113][0114]
量取处方量50％的注射用水加蔗糖使其溶解，另量取处方量20％的注射用水将pl-ac-206化合物溶解，与蔗糖水溶液混合均匀。量取处方量10％的注射用水加热至60℃，加入羟苯乙酯使溶解，搅拌均匀。与混合好的蔗糖水溶液中。混合均匀。采用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，检验合格后灌装，得成品。
[0115]
实施例9、颗粒剂的处方及工艺(100mg/袋)
[0116]
表8.颗粒剂的处方
[0117][0118]
原辅料分别过100目筛。将预胶化淀粉135g、乳糖120g、糊精120g、甘露醇100g、滑石粉10g和硬脂酸镁5g混合均匀，等量递增法与pl-ac-202混合至均匀。以聚乙烯吡咯烷酮5％溶液为粘合剂制备合适软材。14目尼龙筛网制粒，制成的颗粒于55-60℃干燥。干颗粒14目筛网整粒，再过65目筛去细粉，分剂量，包装，即得。
[0119]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。