遗传修饰的梭菌属细菌、其制备和用途1.本发明涉及梭菌属(clostridium)细菌、通常为产溶剂梭菌属细菌、特别是在野生型中具有编码酰胺醇–o–乙酰转移酶的基因的细菌的遗传修饰。因此，本发明涉及允许此类遗传修饰、特别是编码酰胺醇–o–乙酰转移酶的序列或控制编码酰胺醇–o–乙酰转移酶的序列转录的序列的移除或修饰的方法、工具和试剂盒，涉及所获得的遗传修饰的细菌，并涉及其用途，特别是优选地在工业规模上用于生产溶剂的用途。
背景技术：
：：2.梭菌属含有属于厚壁菌门的革兰氏阳性、严格厌氧、产孢子的细菌。出于几个原因，梭菌对于科学界来说是一个重要组群。首先是许多严重疾病(例如破伤风、肉毒梭菌中毒)由这个家族的致病成员的感染造成(gonzales等，2014)。其次是在生物技术中使用所谓的产酸或产溶剂菌株的可能性(john&wood，1986和moon等，2016)。这些非致病性梭菌天然具有在被称为abe的发酵过程中转化各种不同糖类以产生感兴趣的化学物质，尤其是丙酮、丁醇和乙醇的能力(john&wood，1986)。同样地，在某些特定菌种中，将丙酮以不同比例还原成异丙醇的ibe发酵是可能的(chen等，1986，george等，1983)，这是由于在这些菌株的基因组中存在编码仲醇脱氢酶的基因(s‑adh；ismael等，1993；hiu等，1987)。3.所述产溶剂梭菌菌种显示出显著的表型相似性，使得在现代测序技术出现之前难以将它们分类(rogers等，2006)。由于可以对这些细菌的完整基因组进行测序，现在可以将该细菌属分为4个主要种：丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)，糖乙酸多丁醇梭菌(c.saccharoperbutylacetonicum)，糖丁醇梭菌(c.saccharobutylicum)和拜氏梭菌(c.beijerinckii)。一份最近的出版物在对30个菌株的完整基因组进行比较分析后，将这些产溶剂梭菌分成4个主要进化枝(图1)。4.具体来说，这些研究组将菌种丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌分开，并将丙酮丁醇梭菌atcc824(也被命名为dsm792或lmg5710)和拜氏梭菌ncimb8052作为用于研究abe型发酵的模式菌株。5.天然能够进行ibe发酵的梭菌菌株很少，并且大部分属于拜氏梭菌种(zhang等，2018，表1)。这些菌株通常选自丁醇梭菌(c.butylicum)lmd27.6、金黄丁酸梭菌(c.aurantibutylicum)ncib10659、拜氏梭菌lmd27.6、拜氏梭菌vpi2968、拜氏梭菌nrrlb–593、拜氏梭菌atcc6014、拜氏梭菌mcclung3081、异丙醇梭菌(c.isopropylicum)iam19239、拜氏梭菌dsm6423、梭菌属菌种a1424、拜氏梭菌optinoii和拜氏梭菌bgs1。6.然而，到目前为止尚无已被遗传修饰过的能够天然产生异丙醇、特别是能够天然进行ibe发酵的梭菌属细菌菌株，特别是被遗传修饰以使其对属于酰胺醇类型的抗生素例如氯霉素或甲砜霉素敏感、优选地能够优化异丙醇生产的菌株。技术实现要素：7.本发明人在本发明的背景中首次描述了一种遗传修饰的拜氏梭菌细菌以及允许对梭菌属细菌进行遗传修饰的工具，所述细菌通常是天然(即在野生型中)能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌，特别是在野生型中包含为所述细菌提供对一种或多种抗生素的抗性的基因、特别是编码酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶的基因的细菌。8.根据本发明的优选的遗传修饰的细菌是不表达提供对一种或多种抗生素的抗性的酶的细菌，特别是不表达酰胺醇–o–乙酰转移酶的细菌，例如缺少或不能表达catb基因的细菌。9.根据本发明的优选的遗传修饰的细菌是在本说明书中被鉴定为拜氏梭菌dsm6423δcatb的细菌，其于2018年12月6日在比利时微生物协调保藏中心(belgianco–ordinatedcollectionsofmicro–organisms)(“bccm”，k.l.ledeganckstraat35,b–9000gent–belgium)登记在保藏号lmgp–31151下(也被标识为拜氏梭菌ifp962δcatb)。本说明书还涉及其任何衍生细菌、克隆、突变体或遗传修饰形式。10.本发明人描述的一个特定主题内容是一种核酸，其识别(至少部分结合)并优选地靶向、即识别并允许切割感兴趣的细菌的基因组中下述序列的至少一条链：i)编码允许所述感兴趣的细菌在含有抗生素、通常为属于酰胺醇类别的抗生素、优选地选自氯霉素、甲砜霉素、叠氮氯霉素和氟苯尼考的培养基中生长的酶，通常为酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶的序列；ii)控制编码所述酶的序列的转录的序列；或iii)在编码所述酶的序列两侧的序列。11.本发明人还描述了这种核酸的用途，其用于转化和/或遗传修饰梭菌属细菌，优选地天然能够产生异丙醇的梭菌属细菌，特别是能够进行ibe发酵的梭菌属细菌。12.具体来说，本发明人描述了识别拜氏梭菌dsm6423的基因组中序列seqidno：18的catb基因或与其具有至少70％同一性的序列的核酸的用途，其用于转化和/或遗传修饰拜氏梭菌dsm6423细菌。13.所述能够在野生型中产生异丙醇的细菌可以是例如选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌(c.diolis)细菌、微紫色梭菌(c.puniceum)细菌、丁酸梭菌(c.butyricum)细菌、糖乙酸多丁醇梭菌细菌、肉毒梭菌(c.botulinum)细菌、德雷克氏梭菌(c.drakei)细菌、粪味梭菌(c.scatologenes)细菌、产气荚膜梭菌(c.perfringens)细菌和突尼斯梭菌(c.tunisiense)细菌的细菌，优选为选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌和糖乙酸多丁醇梭菌细菌的细菌。天然能够产生异丙醇的特别优选的细菌是拜氏梭菌细菌。14.根据一个特定方面，所述识别并优选地靶向i)编码酰胺醇–o–乙酰转移酶的序列、ii)控制这个序列的转录的序列或iii)在这个序列两侧的序列的核酸，被用于转化选自dsm6423、lmg7814、lmg7815、nrrlb–593、nccb27006的拜氏梭菌的进化分枝和与菌株dsm6423具有至少97％同一性的进化分枝。15.本发明人还描述了一种转化并优选地遗传修饰梭菌属细菌的方法。这种方法包括通过在所述细菌中引入核酸来转化这种细菌的步骤，所述核酸识别并优选地靶向i)编码感兴趣的酶、优选为酰胺醇–o–乙酰转移酶的序列、ii)控制编码所述酶的序列的转录的序列或iii)在编码所述酶的序列两侧的序列。这种方法通常使用遗传修饰工具来进行，例如使用选自crispr工具、基于ii类内含子的工具和等位基因交换工具的遗传修饰工具。还描述了使用这种方法转化和遗传修饰的细菌，其实例是拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌。16.本发明人描述的另一方面涉及根据本发明所述的遗传修饰的细菌、优选为登记在保藏号lmgp–31151下的拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌或其遗传修饰形式的用途，其用于优选地在工业规模上生产溶剂、优选为异丙醇，或溶剂的混合物。17.最后，本说明书涉及试剂盒，特别是包含下述组分的试剂盒：本文中描述的核酸和遗传修饰工具，所述遗传修饰工具特别选自crispr工具、基于ii类内含子的工具和等位基因交换工具的遗传工具的元件、作为向导rna(grna)的核酸、作为修复模板的核酸、至少一个引物对和允许由所述工具编码的蛋白质的表达的诱导物。具体实施方式18.尽管在工业上已使用超过一个世纪，但对梭菌属细菌的了解仍受限于对它们进行遗传修饰时遇到的困难。19.近年来已设计了不同的遗传工具来优化这个属的菌株，最新的一代是基于成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)/crispr相关蛋白(cas)技术的使用。这种方法基于使用一种被称为核酸酶的酶(在crispr/cas遗传工具的情况下通常是cas‑型核酸酶，例如来自于酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9蛋白)，它在rna分子指导下在dna分子(感兴趣的靶序列)中进行双链切割。向导rna(grna)的序列决定所述核酸酶的切割位点，赋予其极高的特异性(图17)。20.由于必需dna分子中的双链切割对生物体来说是致命的，因此生物体的存活将取决于它修复所述切割的能力(参见cui&bikard,2016)。在梭菌属细菌中，双链断裂的修复依赖于同源重组机制，需要被切割序列的完整拷贝。通过为细菌提供允许这种修复并同时修饰原始序列的dna片段，有可能迫使所述微生物将所需的变化整合到其基因组中。通过修饰靶序列或pam位点，已进行的修饰必须不再允许cas9‑grna核糖核蛋白复合体靶向基因组dna(图18)。21.已描述了不同方法以尝试制造在梭菌属细菌中有功能的这种遗传工具。事实上，已知这些微生物由于转化和同源重组频率低而难以进行遗传修饰。几种方法是基于使用在拜氏梭菌和扬氏梭菌(c.ljungdahlii)中组成性表达(wang等，2015；huang等，2016)或在拜氏梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌和自养产乙醇梭菌(c.authoethanogenum)中在诱导型启动子控制之下表达(wang等，2016；nagaraju等，2016；wang等，2017)的cas9。其他作者描述了使用所述核酸酶的改良版本cas9n，其在基因组内进行单链而不是双链切割(xu等，2015；li等，2016)。这种选择是由于观察到在测试的实验条件下，cas9对于在梭菌属细菌中使用来说毒性过大。大多数上述工具依靠使用单一质粒。最后，当在微生物的基因组内鉴定到内源crispr/cas系统时，也可以使用它们，正如在巴氏梭菌(c.pasteurianum)中那样(pyne等，2016)。22.除非使用(如上述最后一种情况)待修饰菌株的内源机制，否则基于crispr技术的工具的主要缺点是显著限制了可以插入到细菌基因组中的感兴趣的核酸的尺寸(以及因此编码序列或基因的数目)(根据xu等，2015，最大约1.8kb)。23.基于使用显著解决了这一问题的两种不同的核酸、通常为两种质粒(参见wo2017064439，wasels等，2017和图3)，本发明人已开发并描述了一种用于修饰细菌的更加强有力的遗传工具，其适合于细菌、通常为属于厚壁菌门的细菌、特别是梭菌属细菌。在特定实施方式中，这种工具的第一核酸允许cas9的表达，并且特异性针对待进行的修饰的第二核酸含有一个或多个grna表达盒以及允许被cas9靶向的细菌dna的一部分被感兴趣的序列代替的修复模板。通过将cas9和/或grna表达盒置于诱导型启动子的控制之下，所述系统的毒性受到限制。本发明人最近改进了这种工具，使其能够非常显著地提高转化效率，并因此以有用的数目和数量(特别是在选择用于工业规模生产的鲁棒菌株的情况下)获得感兴趣的遗传修饰的细菌(参见fr18/54835)。在这种改进的工具中，至少一个核酸包含置于诱导型启动子控制之下的编码抗crispr蛋白(“acr”)的序列。这种抗crispr蛋白抑制dna核酸内切酶/向导rna复合体的活性。所述蛋白的表达受到调控，以允许其仅在所述细菌的转化阶段中表达。24.在本说明书的上下文中，属于厚壁菌门的细菌被理解为意味着属于梭菌纲、柔膜菌纲、杆菌纲或togobacteria，优选地属于梭菌纲或杆菌纲的细菌。25.属于厚壁菌门的具体细菌包括例如梭菌属细菌、芽孢杆菌属细菌或乳杆菌属细菌。[0026]“芽孢杆菌属细菌”具体来说意味着解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、苏云金芽孢杆菌(b.thurigiensis)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、蜡样芽孢杆菌(b.cereus)、炭疽芽孢杆菌(b.anthracis)或枯草芽孢杆菌(b.subtilis)。[0027]“梭菌属细菌”具体来说意味着工业上感兴趣的梭菌属菌种，通常为产溶剂或产乙酸梭菌属细菌。表述“梭菌属细菌”涵盖了野生型细菌以及从其衍生的菌株，它们进行了目的在于改进其性能的遗传修饰(例如过表达ctfa、ctfb和adc基因)，但尚未暴露于crispr系统。[0028]“工业上感兴趣的梭菌属菌种”意味着能够从糖或单糖，通常从包含5个碳原子的糖例如木糖、阿拉伯糖或果糖，从包含6个碳原子的糖例如葡萄糖或甘露糖，从多糖例如纤维素或半纤维素，和/或从可以被梭菌属细菌同化和使用的任何其他碳源(例如co、co2和甲醇)，通过发酵产生溶剂和酸例如丁酸或乙酸的菌种。感兴趣的产溶剂细菌的实例是产生丙酮、丁醇、乙醇和/或异丙醇的梭菌属细菌，例如在文献中被标识为“abe菌株”[执行允许产生丙酮、丁醇和乙醇的发酵的菌株]和“ibe菌株”[执行允许产生异丙醇(通过丙酮的还原)、丁醇和乙醇的发酵的菌株]的菌株。产溶剂梭菌属细菌可以例如选自丙酮丁醇梭菌、解纤维梭菌(c.cellulolyticum)、植物发酵梭菌(c.phytofermentans)、拜氏梭菌、糖丁醇梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、产芽胞梭菌(c.sporogenes)、丁酸梭菌、金黄丁酸梭菌和酪丁酸梭菌(c.tyrobutyricum)，最优选地选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、酪丁酸梭菌和解纤维梭菌，甚至更优选地选自丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌。[0029]天然产生异丙醇，通常在基因组中具有编码将丙酮还原成异丙醇的伯醇/仲醇脱氢酶的adh基因的梭菌属细菌，在遗传和功能两方面与能够在天然状态下进行abe发酵的细菌区分开。[0030]有利的是，在本发明的情形中，本发明人成功地对一种天然产异丙醇的梭菌属细菌拜氏梭菌dsm6423细菌以及参比菌株丙酮丁醇梭菌dsm792进行了遗传修饰。[0031]因此，本发明人第一次描述了一种已被遗传修饰的天然(即在野生型中)能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌，以及使所述细菌能够被获得的工具，特别是遗传工具。这些工具的优点在于显著促进能够在野生型中产生异丙醇、特别是进行ibe发酵的细菌，特别是那些带有编码负责抗生素抗性的酶的基因的细菌的转化和遗传修饰。[0032]实验部分中描述的一部分工作在能够进行ibe发酵的菌株即拜氏梭菌菌株dsm6423中进行，所述菌株的基因组和转录组分析最近已被本发明人描述(mátédegerando等，2018)。[0033]具体来说，在该菌株的基因组组装中，本发明人发现除了染色体之外，还存在可移动遗传元件(登记号prjeb11626–https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/prjeb11626)：两个天然质粒(pnf1和pnf2)和一个线性噬菌体(φ6423)。[0034]在本发明的特定实施方式中，本发明人成功地从拜氏梭菌菌株dsm6423中缺失了它的天然质粒pnf2。[0035]在另一个特定实施方式中，他们成功地缺失了拜氏梭菌菌株dsm6423的染色体中最初存在的upp基因。因此，这些实验证实了所述工具以及更广义来说由本发明人在本文中描述的技术对能够在野生型中产生异丙醇、特别是进行ibe发酵的细菌进行遗传修饰的可能用途。[0036]在特别有利的实施方式中，本发明人特别成功地使作为编码负责酰胺醇类抗生素抗性的酶的基因的天然携带者(在野生型中携带)的细菌对这些抗生素敏感。[0037]在本发明的情形中，感兴趣的酰胺醇类抗生素的实例是氯霉素、甲砜霉素、叠氮氯霉素和氟苯尼考(schwarzs.等，2004)，特别是氯霉素和甲砜霉素。[0038]因此，本发明的第一方面涉及一种可用于对感兴趣的细菌进行遗传转化和/或修饰的遗传工具，所述感兴趣的细菌通常是本文中描述的属于厚壁菌门的细菌，例如梭菌属、芽孢杆菌属或乳杆菌属的细菌，优选为天然(即在野生型中)能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌，优选为天然对一种或多种抗生素具有抗性的细菌，例如拜氏梭菌细菌。优选的细菌在野生型中具有细菌染色体和至少一个不同于染色体dna的dna分子两者。[0039]根据一个特定方面，这种遗传工具由识别(至少部分结合)并优选地靶向、即识别并允许切割感兴趣的细菌的基因组中下述序列的至少一条链的核酸(在本文中也被称为“感兴趣的核酸”)构成：i)允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶的编码序列，ii)控制允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶的编码序列的转录的序列，或iii)在允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶的编码序列两侧的序列。这种感兴趣的核酸在本发明的情形中通常用于从所述细菌的基因组缺失所述被识别的序列或修饰其表达，例如调节/调控其表达，特别是抑制它，优选地修饰它以使所述细菌不能表达来自于所述序列的蛋白，特别是功能性蛋白。所述被识别序列在本文中也被称为“靶序列”或“被靶向序列”。[0040]在特定实施方式中，所述感兴趣的核酸包含至少一个与所述靶序列互补的区域，其与所述细菌基因组内被靶向的dna区域/部分/序列具有100％同一性或至少80％同一性，优选地85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且能够杂交到与所述区域/部分/序列互补的序列的全部或一部分，通常杂交到包含至少1个核苷酸，优选地至少1、2、3、4、5、10、14、15、20、25、30、35或40个核苷酸，通常为1、10或20至1000个核苷酸之间，例如1、10或20至900、800、700、600、500、400、300或200个核苷酸之间，1、10或20至100个核苷酸之间，1、10或20至50个核苷酸之间或1、10或20至40个核苷酸之间，例如10至40个核苷酸之间、10至30个核苷酸之间、10至20个核苷酸之间、20至30个核苷酸之间、15至40个核苷酸之间、15至30个核苷酸之间或15至20个核苷酸之间的序列，优选杂交到包含14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的序列。与所述感兴趣的核酸内存在的靶序列互补的区域可以对应于在本文中描述的crispr工具中使用的向导rna(grna)的“sds”区域。[0041]在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的核酸包含至少两个各自与靶序列互补的区域，其与所述细菌基因组内的所述被靶向的dna区域/部分/序列具有100％同一性或至少80％同一性，优选地至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。这些区域能够杂交到与所述区域/部分/序列互补的序列的全部或一部分，通常杂交到如上所述包含至少1个核苷酸，优选地至少100个核苷酸，通常为100至1000个核苷酸之间的序列。所述与感兴趣的核酸内存在的靶序列互补的区域可以识别、优选地靶向本文中描述的遗传修饰工具例如遗传工具、遗传工具或型等位基因交换工具中所述被靶向序列的5′和3′侧翼区。[0042]通常，所述靶序列是在感兴趣的梭菌属细菌的基因组中编码酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶的序列、控制这种序列的转录的序列或在这种序列两侧的序列，所述细菌能够在含有属于酰胺醇类的一种或多种抗生素例如氯霉素和/或甲砜霉素的培养基中生长。[0043]在特定实施方式中，所述被识别的序列是对应于来自于拜氏梭菌dsm6423的编码氯霉素–o–乙酰转移酶的catb基因(cibe_3859)的序列seqidno：18，或与所述氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，或包含序列seqidno：18的全部或至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。换句话说，所述被识别的序列可以是包含序列seqidno：18的至少1个核苷酸，优选地至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个核苷酸，通常为1至40个核苷酸之间的序列，优选为包含序列seqidno：18的14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的序列。[0044]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少70％同一性的氨基酸序列的实例对应于在ncbi数据库中下述条目下标识的序列：wp_077843937.1，seqidno：44(wp_063843219.1)，seqidno：45(wp_078116092.1)，seqidno：46(wp_077840383.1)，seqidno：47(wp_077307770.1)，seqidno：48(wp_103699368.1)，seqidno：49(wp_087701812.1)，seqidno：50(wp_017210112.1)，seqidno：51(wp_077831818.1)，seqidno：52(wp_012059398.1)，seqidno：53(wp_077363893.1)，seqidno：54(wp_015393553.1)，seqidno：55(wp_023973814.1)，seqidno：56(wp_026887895.1)，seqidno：57(awk51568.1)，seqidno：58(wp_003359882.1)，seqidno：59(wp_091687918.1)，seqidno：60(wp_055668544.1)，seqidno：61(kgk90159.1)，seqidno：62(wp_032079033.1)，seqidno：63(wp_029163167.1)，seqidno：64(wp_017414356.1)，seqidno：65(wp_073285202.1)，seqidno：66(wp_063843220.1)，以及seqidno：67(wp_021281995.1)。[0045]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少75％同一性的氨基酸序列的实例对应于序列wp_077843937.1、wp_063843219.1、wp_078116092.1、wp_077840383.1、wp_077307770.1、wp_103699368.1、wp_087701812.1、wp_017210112.1、wp_077831818.1、wp_012059398.1、wp_077363893.1、wp_015393553.1、wp_023973814.1、wp_026887895.1awk51568.1、wp_003359882.1、wp_091687918.1、wp_055668544.1和kgk90159.1。[0046]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少90％同一性的氨基酸序列的实例是序列wp_077843937.1、wp_063843219.1、wp_078116092.1、wp_077840383.1、wp_077307770.1、wp_103699368.1、wp_087701812.1、wp_017210112.1、wp_077831818.1、wp_012059398.1、wp_077363893.1、wp_015393553.1、wp_023973814.1、wp_026887895.1和awk51568.1。[0047]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少95％同一性的氨基酸序列的实例对应于序列wp_077843937.1、wp_063843219.1、wp_078116092.1、wp_077840383.1、wp_077307770.1、wp_103699368.1、wp_087701812.1、wp_017210112.1、wp_077831818.1、wp_012059398.1、wp_077363893.1、wp_015393553.1、wp_023973814.1和wp_026887895.1。[0048]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少99％同一性的优选氨基酸序列是序列wp_077843937.1、seqidno：44(wp_063843219.1)和seqidno：45(wp_078116092.1)。[0049]与seqidno：18同一的具体序列是在ncbi数据库中在条目wp_077843937.1下标识的序列。[0050]在特定实施方式中，所述靶序列是对应于来自于产气荚膜梭菌的编码氯霉素–o–乙酰转移酶的catq基因的序列seqidno：68，其氨基酸序列对应于seqidno：66(wp_063843220.1)，或与所述氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列，或包含序列seqidno：68的全部或至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。[0051]换句话说，所述被识别的序列可以是包含序列seqidno：68的至少1个核苷酸，优选地至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个核苷酸，通常为1至40个核苷酸之间的序列，优选为包含序列seqidno：68的14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的序列。[0052]在又一个特定实施方式中，所述被识别的序列选自本领域技术人员已知的天然存在于梭菌属细菌中或被人工引入到此类细菌中的核酸序列catb(seqidno：18)、catq(seqidno：68)、catd(seqidno：69，schwarzs.等，2004)或catp(seqidno：70，schwarzs.等，2004)。[0053]正如上文指明的，根据另一个实施方式，所述靶序列也可以是控制如上所述的编码序列(编码允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶)的转录的序列，通常为启动子序列例如catb基因的启动子序列(seqidno：73)或catq基因的启动子序列(seqidno：74)。[0054]然后，所述用作遗传工具的感兴趣的核酸识别并因此通常能够结合到控制如上所述的编码序列的转录的序列。[0055]根据另一个实施方式，所述靶序列可以是在如上所述的编码序列(编码允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶)两侧的序列，例如在序列seqidno：18的catb基因或与其具有至少70％同一性的序列两侧的序列。这种侧翼序列通常包含1、10或20至1000个核苷酸，例如1、10或20至900、800、700、600、500、400、300或200个核苷酸之间，1、10或20至100个核苷酸之间，1、10或20至50个核苷酸之间或1、10或20至40个核苷酸之间，例如10至40个核苷酸之间、10至30个核苷酸之间、10至20个核苷酸之间、20至30个核苷酸之间、15至40个核苷酸之间、15至30个核苷酸之间或15至20个核苷酸之间。[0056]根据一种特定情况，所述靶序列对应于在此类编码序列两侧的一对序列，每个侧翼序列通常包含至少20个核苷酸，通常为100至1000个核苷酸之间，优选为200至800个核苷酸之间。[0057]在本发明的意义上，“核酸”意味着任何天然、合成、半合成或重组的dna或rna分子，其任选被化学修饰(即包含非天然碱基、含有例如修饰的连键、修饰的碱基和/或修饰的糖的修饰的核苷酸)，或者被优化以使得从所述编码序列合成的转录本的密码子是打算在其中使用的梭菌属细菌中最常发现的密码子。在梭菌属的情况下，所述优化的密码子通常是富含腺嘌呤(“a”)和胸腺嘧啶(“t”)碱基的密码子。[0058]在本文中描述的肽序列中，氨基酸用对应于下述命名法的单字母编码表示：c：半胱氨酸；d：天冬氨酸；e：谷氨酸；f：苯丙氨酸；g：甘氨酸；h：组氨酸；i：异亮氨酸；k：赖氨酸；l：亮氨酸；m：甲硫氨酸；n：天冬酰胺；p：脯氨酸；q：谷氨酰胺；r：精氨酸；s：丝氨酸；t：苏氨酸；v：缬氨酸；w：色氨酸和y：酪氨酸。[0059]在本发明的情形中，所述用作遗传工具以转化和/或遗传修饰感兴趣的细菌的感兴趣的核酸是在梭菌属细菌、特别是天然能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌的基因组中i)识别感兴趣的酶的编码序列、ii)控制所述感兴趣的酶的编码序列的转录或iii)在所述感兴趣的酶的编码序列两侧的dna片段，所述感兴趣的酶优选为酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶。[0060]所述能够天然产生异丙醇的细菌可以是例如选自拜氏梭菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌、丁酸梭菌细菌、糖乙酸多丁醇梭菌细菌、肉毒梭菌细菌、德雷克氏梭菌细菌、粪味梭菌细菌、产气荚膜梭菌细菌和突尼斯梭菌细菌的细菌，优选为选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌(细菌、微紫色梭菌细菌和糖乙酸多丁醇梭菌细菌的细菌。在野生型中能够产生异丙醇的特别优选的细菌是拜氏梭菌细菌。[0061]根据一种特定情况，所述梭菌属细菌是拜氏梭菌细菌，其进化分枝选自dsm6423、lmg7814、lmg7815、nccb27006和与菌株dsm6423具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的进化分枝。[0062]正如上文指明的，根据本发明所述的感兴趣的核酸能够缺失在所述细菌的基因组中识别的序列(“靶序列”)或修饰它的表达，例如调节它，特别是抑制它，优选地修饰它以使所述细菌不能从所述序列表达蛋白，优选为酰胺醇–o–乙酰转移酶，特别是有功能的蛋白。[0063]这种感兴趣的核酸通常采取表达盒(或“构建物”)的形式，例如包含操作性连接(在本领域技术人员所理解的意义上)到一个或多个感兴趣的(编码)序列的转录启动子的核酸，例如包含其表达产物有助于在所述细菌内实现感兴趣的功能的几个感兴趣的编码序列的操纵子，或另外还包含活化序列和/或转录终止子的核酸；或采取包含一个或多个如上所定义的表达盒的环状或线状单链或双链载体的形式，例如质粒、噬菌体、粘粒、人工或合成染色体。优选地，所述载体是质粒。[0064]所述感兴趣的核酸、优选为表达盒或载体，可以通过专业技术人员公知的常规技术来构建，并且可以包含一个或多个启动子、细菌复制原点(ori序列)、终止序列、选择基因例如抗生素抗性基因和允许所述表达盒或载体靶向插入的序列(例如“侧翼区”)。此外，这些表达盒和载体可以通过专业技术人员公知的技术整合到基因组中。[0065]感兴趣的ori序列可以选自pip404、pamβ1、pcb102、reph(丙酮丁醇梭菌中的复制原点)、cole1或rep(大肠埃希氏杆菌中的复制原点)或允许所述载体、通常为质粒在梭菌细胞中维持的任何其他复制原点。[0066]感兴趣的终止序列可以选自adc、thl、bcs操纵子或专业技术人员公知的允许在梭菌中转录终止的任何其他终止子。[0067]感兴趣的选择基因(抗性基因)可以选自ermb、catp、bla、teta、tetm和/或提供针对氨苄青霉素、红霉素、氯霉素、甲砜霉素、四环素或专业技术人员公知的可用于选择梭菌属细菌的任何其他抗生素的抗性的任何其他基因。[0068]在所述被识别的酶编码序列是为细菌提供氯霉素和/或甲砜霉素抗性的序列的特定实施方式中，所述选择基因不是氯霉素和/或甲砜霉素抗性基因，并且优选地不是catb、catq、catd或catp基因中的任一者。[0069]在特定实施方式中，所述感兴趣的核酸包含靶向编码感兴趣的酶、特别是酰胺醇–o–乙酰转移酶、控制所述酶的转录或在所述酶的编码序列两侧的序列(“靶序列”、“被靶向序列”或“被识别的序列”)的一个或多个向导rna(grna)，和/或修饰模板(在本文中也被称为“编辑模板”)，例如能够消除或修饰所述靶序列的全部或一部分优选地以便抑制或压制所述靶序列的表达的模板，通常为包含与位于如上所述的靶序列的上游和下游的序列同源(对应)的序列的模板，通常序列(与所述位于靶序列上游和下游的序列同源)各自包含10或20个碱基对至1000、1500或2000个碱基对之间，例如100、200、300、400或500个碱基对至1000、1200、1300、1400或1500个碱基对之间，优选地100至1500或100至1000个碱基对之间，甚至更优选地500至1000个碱基对或200至800个碱基对之间。[0070]特别感兴趣的核酸采取包含一个或多个表达盒的载体的形式，每个表达盒编码至少一个向导rna(grna)。[0071]根据本发明所述的特定遗传工具包含几个(至少两个)如上所述的感兴趣的核酸，所述感兴趣的核酸彼此不同。[0072]在特定实施方式中，所述用作遗传工具以转化和/或遗传修饰感兴趣的细菌、通常为梭菌属细菌的感兴趣的核酸，是识别为所述细菌提供对一种或多种抗生素的抗性的酶的编码序列、控制所述酶的编码序列的转录的序列或在所述编码序列两侧的序列，并且能够缺失该细菌的基因组中的所述序列或使其无功能的核酸，特别是在被dam–和dcm–型甲基转移酶(从表现出dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备)识别的基序的水平上不表现出甲基化的核酸。[0073]当所述待转化和/或遗传修饰的感兴趣的细菌是拜氏梭菌细菌，特别是属于进化分枝dsm6423、lmg7814、lmg7815、nrrlb–593和nccb27006之一的拜氏梭菌细菌时，所述用作遗传工具例如质粒的感兴趣的核酸是在被dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序的水平上不表现出甲基化的核酸，通常为其中gatc基序的腺苷(“a”)和/或ccwgg基序(w可以对应于腺苷(“a”)或胸苷(“t”))的第二个胞苷“c”被去甲基化的核酸。[0074]被dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序不表现出甲基化的核酸通常可以从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌(例如大肠埃希氏杆菌inv110，invitrogen)制备。这种核酸可能含有例如由ecoki型甲基转移酶进行的其他甲基化，后一种酶靶向aac(n6)gtgc和gcac(n6)gtt基序(n可以对应于任何碱基)的腺嘌呤(“a”)。[0075]在优选实施方式中，所述被靶向的序列对应于编码酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶的基因例如catb基因、控制该基因的转录的序列或在该基因两侧的序列。[0076]在本发明的情形中用作遗传工具的特别感兴趣的核酸是例如载体，优选为质粒，例如在本说明书的实验部分中描述的序列seqidno：21的质粒pcas9ind–δcatb或序列seqidno：38的质粒pcas9ind–grna_catb，特别是所述序列的在被dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序处不表现出甲基化的版本。[0077]本说明书还涉及本文中描述的感兴趣的核酸的用途，其用于转化和/或遗传修饰感兴趣的细菌，特别是能够在野生型中产生异丙醇、特别是能够在野生型中进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌。[0078]能够在野生型中产生异丙醇、特别是能够在野生型中进行ibe发酵的细菌可以是例如选自拜氏梭菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌、丁酸梭菌细菌、糖乙酸多丁醇梭菌细菌、肉毒梭菌细菌、德雷克氏梭菌细菌、粪味梭菌细菌、产气荚膜梭菌细菌和突尼斯梭菌细菌的细菌，优选为选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌和糖乙酸多丁醇梭菌细菌的细菌。[0079](天然)能够在野生型中产生异丙醇、特别是能够在野生型中进行ibe发酵的特别优选的细菌是拜氏梭菌细菌。[0080]所述感兴趣的产乙酸细菌是从co2和h2产生酸和/或溶剂的细菌。产乙酸梭菌属细菌可以例如选自醋酸梭菌(c.aceticum)、嗜热醋酸梭菌(c.thermoaceticum)、扬氏梭菌、自养产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)、艰难梭菌(c.difficile)、粪味梭菌和食一氧化碳梭菌(c.carboxydivorans)。[0081]在特定实施方式中，所述有关的梭菌属细菌是“abe菌株”，优选为丙酮丁醇梭菌菌株dsm792(也被称为atcc菌株824或lmg5710)或拜氏梭菌菌株ncimb8052。[0082]在另一个特定实施方式中，所述有关的梭菌属细菌是“ibe菌株”，通常为本说明书中鉴定的拜氏梭菌细菌之一，例如其进化分枝选自dsm6423、lmg7814、lmg7815、nrrlb–593、nccb27006的拜氏梭菌或金黄丁酸梭菌dszm793细菌(georges等，1983)，和与菌株dsm6423显示出至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的此类拜氏梭菌或金黄丁酸梭菌细菌的进化分枝。特别优选的拜氏梭菌细菌或拜氏梭菌细菌的进化分枝缺少pnf2质粒。[0083]一方面是lmg7814、lmg7815、nrrlb–593和nccb27006进化分枝的相应基因组，另一方面是dszm793的基因组，显示出与dsm6423进化分枝的基因组至少97％的序列同一性百分数。[0084]本发明人已进行了发酵试验，确认了进化分枝dsm6423、lmg7815和nccb27006的拜氏梭菌细菌能够在野生型中产生异丙醇(参见表1)。[0085][表1][0086][0087][0088]使用天然产异丙醇菌株拜氏梭菌dsm6423、lmg7815和nccb27006的葡萄糖发酵试验的概述[0089]在本发明的特别优选实施方式中，所述拜氏梭菌细菌是dsm6423进化分枝细菌。[0090]在本发明的又一个实施方式中，所述拜氏梭菌细菌是拜氏梭菌ifp963δcatbδpnf2菌株(于2019年2月20日在bccm–lmg保藏中心登记在保藏号lmgp–31277下，并且在本文中也被称为拜氏梭菌dsm6423δcatbδpnf2)。[0091]根据一个特定实施方式，所述待转化并优选地遗传修饰的细菌是已暴露于使用根据本发明的核酸或遗传工具的第一转化步骤和第一遗传修饰步骤，使得可以缺失在野生型中天然存在于所述细菌中的至少一个染色体外dna分子(通常为至少一个质粒)的细菌。[0092]本发明人描述的另一方面涉及一种使用根据本发明的遗传工具，通常使用如上所述的根据本发明的感兴趣的核酸来转化并优选地还遗传修饰梭菌属细菌的方法。所述方法包括通过将本文中描述的感兴趣的核酸引入到所述细菌中来转化所述细菌的步骤。所述方法还可以包括获得、回收、选择或分离所述转化的细菌，即具有所需重组/修饰/优化的细菌的步骤。[0093]在特定实施方式中，所述用于转化并优选地遗传修饰梭菌属细菌的方法涉及遗传修饰工具，例如选自crispr、基于使用ii类内含子的工具(例如工具或工具)和等位基因交换工具(例如工具)的遗传修饰工具，并包括通过将如上所述根据本发明的感兴趣的核酸引入到所述细菌中来转化所述细菌的步骤。[0094]通常，本发明有利地在所述被选择用于转化并优选地遗传修饰梭菌属细菌的遗传修饰工具旨在用于在野生型中带有负责对一种或多种抗生素的抗性的酶的编码基因的细菌例如拜氏梭菌的情况下实施，并且所述遗传工具的实施包括在允许该细菌在野生型中有抗性的抗生素的抗性标记物表达的核酸的帮助下转化所述细菌的步骤，和/或在所述抗生素(所述细菌在野生型中对其有抗性)的帮助下选择所述转化和/或遗传修饰的细菌的步骤。[0095]可以例如使用选自crispr工具、基于使用ii类内含子的工具和等位基因交换工具的遗传修饰工具通过本发明有利地实现的修饰，主要在于缺失为所述细菌提供针对一种或多种抗生素的抗性的酶的编码序列，或主要在于使该序列无功能。可以通过本发明有利地实现的另一种修饰主要在于对细菌进行遗传修饰以便提高它的性能，例如它的生产感兴趣的溶剂或溶剂混合物的性能，所述细菌先前已通过本发明进行修饰，使其对它在野生型中有抗性的抗生素敏感。[0096]在优选实施方式中，根据本发明所述的方法是基于成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)技术/遗传工具、特别是crispr/cas(crispr相关蛋白)遗传工具的使用(实施)。[0097]这种方法是基于使用被称为核酸酶的酶(在crispr/cas遗传工具的情况下通常是cas–型核酸酶，例如来自于酿脓链球菌的crispr相关蛋白9(cas9蛋白))，其在rna分子指导下在dna分子(感兴趣的靶序列)中制造双链切割。所述向导rna(grna)的序列决定所述核酸酶的切割位点，为其提供非常高的特异性。由于对微生物的存活来说必需dna分子内的双链切割事实上对生物体是致死的，因此所述生物体的存活取决于它修复所述切割的能力(参见例如cui&bikard，2016)。在梭菌属细菌中，双链断裂的修复依靠同源重组机制，需要被切割序列的完整拷贝。通过为所述细菌提供在修饰原始序列的同时允许发生修复的dna片段，可以迫使所述微生物将所需变化整合在它的基因组中。[0098]本发明可以在梭菌属细菌中使用常规的crispr/cas遗传工具来实施，使用如wang等(2015)所描述的包含核酸酶、grna和修复模板的单一质粒。所述crispr/cas系统含有两个不同的必需元件，即i)核酸内切酶，在这种情况下是crispr相关核酸酶cas，以及ii)向导rna。所述向导rna采取嵌合rna的形式，其由细菌crisprrna(crrna)和tracrrna(反式激活crisprrna)的组合构成。所述grna将充当cas蛋白的向导的对应于“间隔物序列”的crrna的靶向特异性与crrna的构象性质组合在单一转录本中。当所述grna和cas蛋白在细胞中同时表达时，由于提供的修复模板，所述靶基因组序列可以被永久性地修饰。专业技术人员可以使用公知的技术，根据待靶向的染色体区域或可移动遗传元件容易地确定所述grna的序列和结构(参见例如dicarlo等，2013的论文)。[0099]所述遗传工具的元件(核酸或grna)在所述细菌中的引入通过专业技术人员已知的任何直接或间接方法来进行，例如通过转化、接合、微注射、转染、电穿孔等，优选地通过电穿孔(mermelstein等，1993)。[0100]本发明人最近已开发并描述了一种基于使用两种质粒的用于修饰细菌的遗传工具，其适合于梭菌属细菌并且可以在本发明的情形中使用(参见wo2017/064439，wasels等，2017，和与本说明书相关的图15)。[0101]在特定实施方式中，这种工具的“第一”质粒允许cas核酸酶的表达，并且特异性针对待进行的修饰的“第二”质粒含有一个或多个grna表达盒(通常靶向细菌dna的不同区域)，以及允许通过同源重组机制将细菌dna中被cas靶向的部分用感兴趣的序列代替的修复模板。所述cas基因和/或grna表达盒被置于本领域技术人员已知的组成型或诱导型、优选为诱导型，并且优选地不同但可以通过相同的诱导剂诱导的表达启动子(例如在申请wo2017/064439中描述的并通过参考并入本说明书)的控制之下。[0102]所述grna可以是天然rna、合成的rna或通过重组技术产生的rna。这些grna可以通过专业技术人员已知的任何方法来制备，例如化学合成、体内转录或扩增技术。当使用多个grna时，每个grna的表达可以通过不同的启动子控制。优选地，用于所有grna的启动子是相同的。在特定实施方式中，相同的启动子可用于表达几个、例如仅仅一些，或者换句话说全部或某些打算表达的grna。[0103]在适合于在本发明的情形中使用的另一个特定实施方式中，ii)所述“第一”和“第二”核酸中的至少一者还编码一个或多个向导rna(grna)，或者所述遗传工具还包含一个或多个向导rna，每个向导rna包含结合cas酶的rna结构和与所述细菌dna的被靶向部分互补的序列，和iii)所述“第一”和“第二”核酸中的至少一者还包含在诱导型启动子控制之下的编码抗crispr蛋白的序列，或者所述遗传工具还包含在诱导型启动子控制之下的编码抗crispr蛋白的“第三”核酸，所述启动子优选地不同于控制cas和/或rna表达的启动子，并且可以通过另一种诱导剂诱导。[0104]在优选实施方式中，所述抗crispr蛋白优选地在将所述遗传工具的核酸序列引入到感兴趣的细菌菌株的阶段中能够抑制、优选地中和所述核酸酶的作用。[0105]一种涉及crispr技术，可以在本发明的情形中实施以转化并通常通过同源重组遗传修饰梭菌属细菌的特定方法包括下述步骤：[0106]a)在诱导抗crispr蛋白的表达的试剂存在下，将本发明人描述的crispr遗传工具引入到所述细菌中，以及[0107]b)将在步骤a)结束时获得的转化的细菌在不含用于诱导抗crispr蛋白的表达的试剂的培养基上(或在不涉及所述试剂的条件下)培养，通常允许cas/grna核糖核蛋白复合体的表达。[0108]在特定实施方式中，所述方法在步骤b)期间或之后还包括诱导控制cas和/或向导rna的表达的诱导型启动子(在此类启动子存在于所述遗传工具中的情况下)的步骤，以便在所述遗传工具被引入到所述细菌中之后允许所述细菌的感兴趣的遗传修饰。所述诱导使用允许解除与所选诱导型启动子相关的表达抑制的物质来进行。[0109]在另一个特定实施方式中，所述方法还包括除去所述含有修复模板的核酸(然后所述细菌细胞被认为“清除”了所述核酸)和/或除去在步骤a)中使用所述遗传工具引入的向导rna或编码向导rna的序列的另外的步骤c)。[0110]在又一个特定实施方式中，所述方法在步骤b)或步骤c)后，包括在诱导抗crispr蛋白的表达的试剂存在下，引入第n例如第三、第四、第五等的核酸的一个或多个另外的步骤，所述核酸含有不同于已引入的修复模板的修复模板和允许所述不同的修复模板中包含的感兴趣的序列整合到细菌基因组的被靶向区域中的一个或多个向导rna表达盒，每个另外的步骤之后跟有将由此转化的细菌在不含所述用于诱导抗crispr蛋白的表达的试剂的培养基上进行培养，通常允许cas/grna核糖核蛋白复合体的表达的步骤。[0111]在根据本发明的方法的特定实施方式中，所述细菌使用例如上文描述的crispr工具或方法来转化，所述crispr工具或方法使用(例如编码)负责切割感兴趣的靶序列的至少一条链的酶，其中在特定实施方式中所述酶是核酸酶，优选为cas–型核酸酶，优选地选自cas9酶和mad7酶。优选地，所述感兴趣的靶序列是为所述细菌提供对一种或多种抗生素、优选为属于酰胺醇类的一种或多种抗生素的抗性的酶、通常为酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶的编码序列例如catb基因，控制所述编码序列的转录的序列，或在所述编码序列两侧的序列。[0112]适合用于本发明的cas9蛋白的实例包括但不限于来自于酿脓链球菌(参见申请wo2017/064439的seqidno：1和ncbi登记号wp_010922251.1)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、变形链球菌(streptococcusmutans)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、多杀巴氏杆菌(pasteurellamultocida)、新凶手弗朗西斯菌(francisellanovicida)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)、乳糖奈瑟氏菌(neisserialactamica)和嗜肺军团菌(legionellapneumophila)的cas9蛋白(参见fonfara等，2013；makarova等，2015)。[0113]也被称为“cas12”或“cpf1”的mad7核酸酶(其氨基酸序列对应于seqidno：72)，也可以通过与本领域技术人员已知的能够与此类核酸酶结合的grna的组合，有利地用于本发明的情形(参见garcia–doval等，2017和stellas.等，2017)。[0114]根据一个特定方面，所述编码mad7核酸酶的序列是被优化以容易地在梭菌属菌株中表达的序列，优选为序列seqidno：71。[0115]在使用时，所述crispr蛋白通常是“抗cas”蛋白，即能够抑制或阻止/中和cas的作用的蛋白，和/或能够抑制或阻止/中和crispr/cas系统、例如当所述核酸酶是cas9核酸酶时ii型crispr/cas系统的作用的蛋白。[0116]有利情况下，所述抗crispr蛋白是例如选自acriia1、acriia2、acriia3、acriia4、acriia5、acriic1、acriic2和acriic3的“抗cas9”蛋白(pawluk等，2018)。优选地，所述“抗cas9”蛋白是acriia2或acriia4。这种蛋白通常能够例如通过与所述cas9酶结合，非常显著地限制、理想情况下阻止cas9的作用。[0117]可以有利地使用的另一种抗crispr蛋白是“抗mad7”蛋白，例如acrva1蛋白(marino等，2018)。[0118]与所述被靶向dna部分(“被识别序列”)相似，所述编辑/修复模板自身可以包含对应于天然和/或合成的编码和/或非编码序列的一个或多个核酸序列或核酸序列部分。所述模板也可以包含一个或多个“外来”序列，即在属于梭菌属的细菌的基因组或所述属的特定菌种的基因组中天然不存在的序列。所述模板也可以包括序列的组合。[0119]在本发明中使用的遗传工具允许所述修复模板指导感兴趣的核酸并入到细菌基因组中，所述感兴趣的核酸通常是包含至少1个碱基对(bp)，优选地至少1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、1,000、10,000、100000或1000000bp，通常在1bp至20kb之间例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13kb，或在1bp至10kb之间，优选地在10bp至10kb之间或1kb至10kb之间，例如1bp至5kb之间、2kb至5kb之间或2.5或3kb至5kb之间的dna序列或序列的部分。[0120]在特定实施方式中，所述感兴趣的dna序列的表达允许所述梭菌属细菌发酵(通常同时地)几种不同的糖，例如至少两种不同的糖，通常为在包含5个碳原子的糖(例如葡萄糖或甘露糖)和/或包含6个碳原子的糖(例如木糖、阿拉伯糖或果糖)中的至少两种不同的糖，优选为至少三种不同的糖，例如选自葡萄糖、木糖和甘露糖；葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖；以及葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。[0121]在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的dna序列编码至少一种感兴趣的产物，优选为促进梭菌属细菌的溶剂生产的产物，通常为至少一种感兴趣的蛋白，例如酶、膜蛋白例如转运蛋白、用于其他蛋白的成熟蛋白(伴侣蛋白)、转录因子或其组合。[0122]在另一个实施方式中，根据本发明所述的方法是基于ii类内含子的使用，并实施例如遗传技术/工具或遗传工具。[0123]所述技术依赖于使用可重编程的ii类内含子(基于乳酸乳球菌(lactococcuslactis)的ll.ltrb内含子)，其能够在所需基因座处快速整合细菌基因组(chen等，2005，wang等，2013)，目的通常是失活被靶向的基因。识别被编辑区域以及通过反向剪接插入到基因组中的机制一方面是基于所述内含子与所述区域之间的同源性，另一方面是基于蛋白质(ltra)的活性。[0124]技术是基于类似的方法，并补充了在内含子序列中添加选择标记物(heap等，2007)。这种标记物允许选择所述内含子在基因组中的整合，并因此便于获得所需突变体。这种遗传系统也利用i类内含子。事实上，所述选择标记物(被称为反转录转座活化的标记物或ram)被这种遗传元件中断，这阻止了选择标记物从所述质粒表达(所述系统的更精确的描述：zhong等)。这种遗传元件的剪接发生在整合到基因组中之前，产生具有活化形式的抗性基因的染色体。所述系统的优化版本包括在该基因上游和下游的flp/frt位点，允许使用frt重组酶移除所述抗性基因(heap等，2010)。[0125]在另一个实施方式中，根据本发明所述的方法是基于使用等位基因交换工具，并实施例如遗传技术/工具。[0126]技术是基于使用营养缺陷突变体(对于尿嘧啶营养缺陷来说，在丙酮丁醇梭菌atcc824中通过缺失pyre基因，这也引起对5‑氟乳清酸(a–5–fo)的抗性；heap等，2012)。所述系统使用专业技术人员公知的等位基因交换机制。在用假自杀(极低拷贝)载体转化后，后者通过第一次等位基因交换事件在细菌染色体中的整合通过最初存在于所述质粒上的抗性基因来选择。所述整合步骤可以以两种不同方式进行，即在pyre基因座内或在另一个基因座内：[0127]在pyre基因座处整合的情况下，所述pyre基因也被放置在所述质粒上，但不表达(没有有功能的启动子)。第二次重组恢复了有功能的pyre基因，并因此可以通过营养缺陷(不含尿嘧啶的最低培养基)来选择。由于无功能的pyre基因也具有可选择特点(对a–5–fo的敏感性)，因此可以在同一模型上发生其他整合，使pyre的状态在有功能与无功能之间依次轮换。[0128]在另一个基因座处整合的情况下，靶向允许反选择标记物在重组后表达的基因组区域(通常在另一个基因、优选为高表达基因之后的操纵子中)。然后通过营养缺陷(不含尿嘧啶的最低培养基)选择该第二次重组。[0129]在所描述的基于使用ii类内含子并实施遗传技术/工具或遗传工具或基于使用等位基因交换工具并实施例如遗传技术/工具的实施方式中，所述被靶向的序列优选为感兴趣的酶、优选为上文所解释的酰胺醇–o–乙酰转移酶的编码序列两侧的序列。[0130]本发明的另一个主题内容涉及利用本发明人在本文中描述的方法获得的转化和/或遗传修饰的细菌，通常为属于本发明人描述的物种或对应于本发明人描述的进化分枝之一的梭菌属细菌，及其任何衍生细菌、克隆、突变体或遗传修饰形式。[0131]由此转化和/或遗传修饰的本发明典型的细菌是不再表达为一种或多种抗生素提供抗性的酶的细菌，特别是不再表达酰胺醇–o–乙酰转移酶的细菌，例如在野生型中表达catb基因而由于本发明在被转化和/或遗传修饰后缺少所述catb基因或不能表达所述catb基因的细菌。所述利用本发明而被转化和/或遗传修饰的细菌被赋予对酰胺醇、例如对本文中描述的酰胺醇、特别是对氯霉素或甲砜霉素的敏感性。[0132]根据本发明的优选的遗传修饰的细菌的具体实例是在本说明书中被鉴定为拜氏梭菌dsm6423δcatb的细菌，其于2018年12月6日在比利时微生物协调保藏中心(belgianco–ordinatedcollectionsofmicro–organisms)(“bccm”，k.l.ledeganckstraat35,b–9000gent–belgium)登记在保藏号lmgp–31151下。本说明书还涉及保留了对酰胺醇例如甲砜霉素和/或氯霉素的敏感性的所述细菌的任何衍生细菌、克隆、突变体或遗传修饰形式。[0133]根据特定实施方式，所述根据本发明的不表达为一种或多种抗生素提供抗性的酶、特别是酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶的转化和/或遗传修饰的细菌例如拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌，仍然能够被转化并优选地被遗传修饰。这可以使用在本说明书中，例如在实验部分中描述的核酸例如质粒来进行。可以有利地使用的核酸的实例是序列seqidno：23的质粒pcas9acr(描述在本说明书的实验部分中)。[0134]事实上，本发明的一个特定方面涉及根据本发明所述的遗传修饰的细菌，优选为在编号lmgp–31151下保藏的拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌或其遗传修饰的形式的用途，其例如使用本文中描述的遗传工具或方法之一，通过自主引入到其基因组中的感兴趣的核酸的表达，用于优选地在工业规模上生产一种或多种溶剂，优选至少异丙醇。[0135]本发明还涉及一种试剂盒，其包含：(i)根据本发明所述的感兴趣的核酸，通常为dna片段，其识别在梭菌属细菌、特别是本文中所描述的能够进行ibe发酵的细菌中感兴趣的酶的编码序列或控制所述编码序列的转录的序列；和(ii)至少一种工具，优选为几种工具，其选自用于转化并通常遗传修饰梭菌属细菌以便产生所述细菌的改进变体的遗传修饰工具的元件、作为grna的核酸、作为修复模板的核酸、至少一个引物对例如在本发明的情形中描述的引物对和允许所述工具编码的蛋白质例如cas9或mad7型核酸酶的表达的诱导物。[0136]所述用于转化并通常遗传修饰梭菌属细菌的遗传修饰工具可以选自例如上文所解释的crispr工具、基于ii类内含子的工具和等位基因交换工具。[0137]所述试剂盒还可以包含一种或多种诱导物，其为在所述遗传工具内任选使用的所选诱导型启动子定制，以控制所使用的核酸酶和/或一种或多种向导rna的表达。[0138]根据本发明所述的特定试剂盒允许表达包含标签的核酸酶。[0139]根据本发明所述的试剂盒还可以包含一种或多种消耗品，例如培养基、至少一种感受态梭菌属细菌(即被调制以用于转化)、至少一种grna、核酸酶、一种或多种选择分子或说明性资料。[0140]本说明书还涉及根据本发明所述的试剂盒或该试剂盒的一种或多种元件的用途，其用于实施本文中描述的梭菌属细菌的转化和理想情况下遗传修饰的方法，和/或用于使用梭菌属细菌、优选为天然产生异丙醇的梭菌属细菌，优选地在工业规模上生产溶剂或生物燃料或其混合物。[0141]可以生产的溶剂通常是丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇或其混合物，通常为乙醇/异丙醇、丁醇/异丙醇或乙醇/丁醇混合物，优选为异丙醇/丁醇混合物。[0142]根据本发明转化的细菌的使用通常允许在工业规模上每年生产至少100吨丙酮、至少100吨乙醇、至少1000吨异丙醇、至少1800吨丁醇或至少40000吨它们的混合物。[0143]下面的实施例和附图旨在更充分地说明本发明，但不限制其范围。附图说明[0144][图1]图1示出了来自于poehlein等，2017的30种产溶剂梭菌属菌株的分类。注意进化分枝拜氏梭菌nrrlb–593在文献中也被称为拜氏梭菌dsm6423。[0145][图2]图2示出了pcas9ind–δcatb质粒图谱。[0146][图3]图3示出了pcas9acr质粒图谱。[0147][图4]图4示出了pec750s–upphr质粒图谱。[0148][图5]图5示出了pex–a2–grna–upp质粒图谱。[0149][图6]图6示出了pec750s–δupp质粒图谱。[0150][图7]图7示出了pec750c–δupp质粒图谱。[0151][图8]图8示出了pgrna–pnf2图谱。[0152][图9]图9示出了在源自于拜氏梭菌菌株dsm6423的细菌转化的克隆中catb基因的pcr扩增。[0153]如果所述菌株仍具有catb基因，扩增产物约为1.5kb，或者如果该基因被缺失，则扩增产物约为900bp。[0154][图10]图10示出了拜氏梭菌菌株dsm6423wt和δcatb在2ytg培养基和2ytg甲砜霉素选择性培养基上的生长。[0155][图11]图11示出了在拜氏梭菌菌株dsm6423的含有pcas9acr和具有或不具有修复模板的靶向upp的grna表达质粒的转化体中crispr/cas9acr系统的诱导。图例说明：em，红霉素；tm，甲砜霉素；atc，无水四环素；nd，未稀释。[0156][图12a]图12示出了通过crispr/cas9系统进行的拜氏梭菌dsm6423的upp基因座的修饰。图12a代表了upp基因座的遗传架构：基因，grna靶位点和与基因组dna上的相应同源区相关的修复模板。也标出了用于pcr验证的引物杂交位点(rh010和rh011)。[0157][图12b]图12示出了通过crispr/cas9系统进行的拜氏梭菌dsm6423的upp基因座的修饰。图12b示出了使用引物rh010和rh011对upp基因座进行的扩增。在野生型基因的情况下预期扩增产物为1680bp，与此相比对于修饰的upp基因来说扩增产物为1090bp。m，100bp–3kb尺寸的标志物(lonza)；wt，野生型菌株。[0158][图13]图13示出了验证拜氏梭菌菌株6423δcatb中质粒pcas9ind.的存在的pcr扩增。[0159][图14]图14示出了在crispr–cas9系统在含有atc的培养基上诱导之前(阳性对照1和2)和诱导之后，验证天然质粒pnf2的存在或不存在的pcr扩增(≈900bp)。[0160][图15]图15示出了被改造以适应于梭菌属细菌的基于使用两种质粒的用于细菌修饰的遗传工具(参见wo2017/064439，wasels等，2017)。[0161][图16]图16示出了pcas9ind–grna_catb质粒图谱。[0162][图17]图17示出了作为遗传工具用于基因组编辑的crispr/cas9系统，其使用cas9核酸酶在基因组dna中产生一个或多个grna指导的双链切割。[0163]grna，向导rna；pam，前间区序列邻近基序。图从jinek等，2012修改。[0164][图18]图18示出了由cas9诱导的双链断裂的同源重组修复。pam，前间区序列邻近基序。[0165][图19]图19示出了crispr/cas9在梭菌属中的使用。[0166]ermb，红霉素抗性基因；catp(seqidno：70)，甲砜霉素/氯霉素抗性基因；tetr，该基因的表达产物阻遏从pcm–teto2/1、pcm–2teto1和pcm–teto2/1无水四环素“atc”诱导型启动子的转录(dong等，2012)；minipthl，组成型启动子(dong等，2012)。[0167][图20]图20示出了pcas9acr质粒图谱(seqidno：23)。[0168]ermb，红霉素抗性基因；rep，大肠埃希氏杆菌中的复制原点；reph，丙酮丁醇梭菌中的复制原点；tthl，硫解酶终止子；minipthl，组成型启动子(dong等，2012)；pcm–teto2/1，被tetr的产物阻遏并且可以被无水四环素“atc”诱导的启动子(dong等，2012)；pbgal，被lacr的产物阻遏并且可以被乳糖诱导的启动子(hartman等，2011)；acriia4，编码抗crispr蛋白acrii14的基因；bgar，该基因的表达产物阻遏从pbgal的转录。[0169][图21]图21示出了含有pcas9ind(seqidno：22)或pcas9acr(seqidno：23)的丙酮丁醇梭菌dsm792的相对转化率。频率被表示为在转化中使用的每μgdna获得的转化体的数目相对于pec750c(seqidno：106)的转化频率，并代表至少两个独立实验的平均值。[0170][图22]图22示出了在含有pcas9acr和具有(seqidno：79和seqidno：80)或不具有(seqidno：105)修复模板的靶向bdhb的grna表达质粒的dsm792菌株转化体中crispr/cas9系统的诱导。em，红霉素；tm，甲砜霉素；atc，无水四环素；nd，未稀释。[0171][图23a]图23示出了通过crispr/cas9系统进行的丙酮丁醇梭菌dsm792的bdh基因座的修饰。图23a示出了bdh基因座的遗传架构。修复模板与基因组dna之间的同源性用浅灰色平行四边形突出。也示出了引物v1和v2的杂交位点。[0172][图23b]图23示出了通过crispr/cas9系统进行的丙酮丁醇梭菌dsm792的bdh基因座的修饰。图23b示出了使用引物v1和v2进行的bdh基因座的扩增。m，2–log尺寸标志物(neb)；p，pgrna–δbdhaδbdhb质粒；wt，野生型菌株。[0173][图24]图24示出了20μgpcas9ind质粒在拜氏梭菌菌株dsm6423中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条表示三份生物学平行样的平均值的标准误差。[0174][图25]图25示出了nf3质粒图谱。[0175][图26]图26示出了pec751s质粒图谱。[0176][图27]图27示出了pnf3s质粒图谱。[0177][图28]图28示出了pnf3e质粒图谱。[0178][图29]图29示出了pnf3c质粒图谱。[0179][图30]图30示出了质粒pcas9ind在拜氏梭菌dsm6423的三种菌株中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条是两份生物学平行样的平均值的标准偏差。[0180][图31]图31示出了质粒pec750c在源自于拜氏梭菌dsm6423的两种菌株中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条是两份生物学平行样的平均值的标准偏差。[0181][图32]图32示出了质粒pec750c、pnf3c、pfw01和pnf3e在拜氏梭菌菌株ifp963δcatbδpnf2中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条是三份生物学平行样的平均值的标准偏差。[0182][图33]图33示出了质粒pfw01、pnf3e和pnf3s在拜氏梭菌菌株ncimb8052中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。[0183]实施例[0184]实施例1[0185]材料和方法[0186]培养条件[0187]丙酮丁醇梭菌dsm792生长在2ytg培养基(胰蛋白胨16g.l–1，酵母提取物10g.l–1，葡萄糖5g.l–1，nacl4g.l–1)中。大肠埃希氏杆菌neb10b生长在lb培养基(胰蛋白胨10g.l–1，酵母提取物5g.l–1，nacl5g.l–1)中。固体培养基通过向液体培养基添加15g.l–1琼脂来制造。在需要时使用红霉素(在2ytg或lb培养基中浓度分别为40或500mg.l–1)、氯霉素(在固体或液体lb培养基中分别为25或12.5mg.l–1)和甲砜霉素(在2ytg培养基中15mg.l–1)。[0188]核酸的操作[0189]所有酶和试剂盒按照制造商的推荐使用。[0190]质粒的构建[0191]图20中示出的pcas9acr质粒(seqidno：23)通过将由eurofinsgenomics合成的含有在启动子pbgal控制之下的bgar和acriia4的片段(seqidno：81)克隆在pcas9ind载体的saci位点处来构建(wasels等，2017)。[0192]pgrnaind质粒(seqidno：82)通过将由eurofinsgenomics合成的在pcm–2teto1启动子控制之下的grna的表达盒(seqidno：83)(dong等，2012)克隆在pec750c载体(seqidno：106)的saci位点处来构建(wasels等，2017)。[0193]pgrna–xylb(seqidno：102)、pgrna–xylr(seqidno：103)、pgrna–glcg(seqidno：104)和pgrna–bdhb(seqidno：105)质粒通过将相应的引物对5′–tcatgatttctccatattagctag–3′和5′–aaacctagctaatatggagaaatc–3′、5′–tcatgttacacttggaacaggcgt–3′和5′–aaacacgcctgttccaagtgtaac–3′、5′–tcatttccggcagtaggatcccca–3′和5′–aaactggggatcctactgccggaa–3′、5′–tcatgcttattacgacataacaca–3′和5′–aaactgtgttatgtcgtaataagc–3′克隆在bsai消化的pgrnaind质粒(seqidno：82)中来构建。[0194]pgrna–δbdhb质粒(seqidno：79)通过将一方面使用引物5′–atgcatggatccaaacgaacccaaaaagaaagtttc–3′和5′–ggttgatttcaaatctgtgtaaacctaccg–3′，另一方面使用引物5′–acacagatttgaaatcaaccactttaaccc–3′和5′–atgcatgtcgactcttaagaacatgtataaagtatgg–3′获得的pcr产物通过重叠pcr组装而得到的dna片段克隆到用bamhi和saci消化的pgrna–bdhb载体中来构建。[0195]pgrna–δbdhaδbdhb质粒(seqidno：80)通过将一方面使用引物5′–atgcatggatccaaacgaacccaaaaagaaagtttc–3′和5′–gctaagttttaaatctgtgtaaacctaccg–3′，另一方面使用引物5′–acacagatttaaaacttagcatacttcttacc–3′和5′–atgcatgtcgaccttctaatctcctctactattttag–3′获得的pcr产物通过重叠pcr组装而得到的dna片段克隆到用bamhi和saci消化的pgrna–bdhb载体中来构建。[0196]转化[0197]丙酮丁醇梭菌dsm792按照由mermelstein等，1993描述的方案来转化。用含有grna表达盒的质粒转化的已含有cas9表达质粒(pcas9ind或pcas9acr)的丙酮丁醇梭菌dsm792转化体的选择在含有红霉素(40mg.l–1)、甲砜霉素(15mg.l–1)和乳糖(40nm)的固体2ytg培养基上进行。[0198]cas9表达的诱导[0199]cas9表达的诱导通过将得到的转化体在含有红霉素(40mg.l–1)、甲砜霉素(15mg.l–1)和cas9和grna表达诱导剂atc(1mg.l–1)的固体2ytg培养基上生长来进行。[0200]bdh基因座的扩增[0201]丙酮丁醇梭菌dsm792在bdha和bdhb基因座处的基因组编辑，通过使用高保真dna聚合酶(neb)和引物v1(5′–acacattgaagggagctttt–3′)和v2(5′–ggcaacaacatcaggccttt–3′)的pcr来控制。[0202]结果[0203]转化效率[0204]为了评估acriia4基因的插入对cas9表达质粒的转化效率的影响，将不同的grna表达质粒转化到含有pcas9ind(seqidno：22)或pcas9acr(seqidno：23)的dsm792菌株中，并在增补有乳糖的培养基上选择转化体。得到的转化效率呈现在图21中。[0205]δbdhb和δbdhaδbdhb突变体的产生[0206]将含有靶向bdhb的grna表达盒的靶向质粒(pgrna–bdhb–seqidno：105)以及含有允许单独缺失bdhb基因(pgrna–δbdhb–seqidno：79)或bdha和bdhb两个基因(pgrna–δbdhaδbdhb–seqidno：80)的修复模板的两种衍生质粒转化到含有pcas9ind(seqidno：22)或pcas9acr(seqidno：23)的dsm792菌株中。得到的转化效率呈现在表2中：[0207][表2][0208][0209]靶向bdhb的质粒对含有pcas9ind或pcas9acr的菌株dsm792的转化频率。频率被表示为在转化中使用的每μgdna得到的转化体的数目，并代表至少两个独立实验的平均值。[0210]所述得到的转化体通过在增补有无水四环素atc的培养基上传代，经历crispr/cas9系统表达的诱导阶段(图22)。[0211]所需变化通过对来自于两个atc抗性菌落的基因组dna进行pcr得以确认(图23)。[0212]结论[0213]在wasels等(2017)中描述的基于crispr/cas9的遗传工具使用两个质粒：[0214]–第一质粒pcas9ind含有在atc诱导型启动子控制之下的cas9，和[0215]–源自于pec750c的第二质粒含有grna表达盒(在第二个atc诱导型启动子的控制之下)和编辑模板，以修复由所述系统诱导的双链断裂。[0216]然而，本发明人观察到某些grna仍显得毒性过高，尽管它们的表达以及cas9的表达已使用atc诱导型启动子进行控制，因此限制了通过所述遗传工具进行细菌转化和因此染色体修饰的效率。[0217]为了改进这种遗传工具，通过插入在乳糖诱导型启动子控制之下的抗crispr基因acriia4，对cas9表达质粒进行修饰。由此显著提高了不同grna表达质粒的转化效率，允许获得所有测试的质粒的转化体。[0218]也可以使用不能被引入到含有pcas9ind的dsm792菌株中的质粒，对丙酮丁醇梭菌dsm792基因组内的bdhb基因座进行编辑。观察到的修饰效率与以前观察到的(wasels等，2017)相同，其中100％的测试的菌落被修饰。[0219]总而言之，cas9表达质粒的修饰允许更好地控制cas9–grna核糖核蛋白复合体，有利地便于获得其中cas9的作用可以被触发的转化体，以便获得感兴趣的突变体。[0220]实施例2[0221]材料和方法[0222]培养条件[0223]拜氏梭菌dsm6423生长在2ytg培养基(胰蛋白胨16g.l–1，酵母提取物10g.l–1，葡萄糖5g.l–1，nacl4g.l–1)中。大肠埃希氏杆菌neb10–β和inv110生长在lb培养基(胰蛋白胨10g.l–1，酵母提取物5g.l–1，nacl5g.l–1)中。固体培养基通过向液体培养基添加15g.l–1琼脂来制造。在需要时使用红霉素(在2ytg或lb培养基中浓度分别为20或500mg.l–1)、氯霉素(在固体或液体lb培养基中分别为25或12.5mg.l–1)和甲砜霉素(在2ytg培养基中15mg.l–1)或壮观霉素(在lb或2ytg培养基中浓度分别为100或650mg.l–1)。[0224]核酸和质粒载体[0225]所有酶和试剂盒按照制造商的推荐使用。[0226]菌落pcr试验遵照下述方案：[0227]将拜氏梭菌dsm6423的分离的菌落重悬浮在100μl10mmtrisph7.5，5mmedta中。将该溶液在不搅拌的情况下在98℃加热10min。然后将0.5μl该细菌裂解液作为pcr模板，用于使用phire(thermoscientific)、phusion(thermoscientific)、q5(neb)或kapa2grobust(sigma–aldrich)聚合酶的10μl反应中。[0228]下面详述了在所有构建物中使用的引物的名单(名称/dna序列)：[0229]δcatb_fwd：tgttatggattataagcggctcgaggacgtcaaaccatgttaatcattgc[0230]δcatb_rev：aatctatcactgatagggactcgagcaatttcaccaaagaattcgctagc[0231]δcatb_grna_rev：aatctatcactgatagggactcgaggggcaaaagtgtaaagacaagcttc[0232]rh076：catataataaaaggaaacctcttgatcg[0233]rh077：attgccagcctaacacttgg[0234]rh001：atctccatggacgcgtgacgtcgacataaggtaccaggaattagagcagc[0235]rh002：tctatctccagctctagaccattattattcctccaagtttgct[0236]rh003：ataatggtctagagctggagatagattatttggtactaag[0237]rh004：tatgaccatgattacgaattcgagctcgaagcgcttattattgcattagc[0238]pex–fwd：cagattgtactgagagtgcacc[0239]pex–rev：gtgagcggataacaatttcacac[0240]pec750c–fwd：caatattccacaatattatattataagctagc[0241]m13–rev：caggaaacagctatgac[0242]rh010：cggatattgcattaccagtagc[0243]rh011：ttatcaatctcttacacatggagc[0244]rh025：tagtatgccgccattattacgaca[0245]rh134：gtcgacgtggaattgtgagc[0246]pnf2_fwd：gggcgcacttatacaccacc[0247]pnf2_rev：tgctacgcaccccctaaagg[0248]rh021：acttgggtcgaccacgataaaacaaggttttaagg[0249]rh022：taccagggatccgtattaatgtaactatgatatcaattcttg[0250]aad9–fwd2：atgcatggtcccaatgaataggtttacacttactttagttttatgg[0251]aad9–rev：atgcgagttaacaacttctaaaatctgattaccaattagrh031：atgcatggatcccaatgaataggtttacacttactttagttttatgg[0252]rh032：atgcgagagctcaacttctaaaatctgattaccaattag[0253]rh138：atgcatggatccgtctgacagttaccaggtcc[0254]rh139：atgcgagagctccaattgttcaaaaaaataatggcggag[0255]rh140：atgcatggatcccggcagtttttctttttcgg[0256]rh141：atgcgagagctcggttaaatactagtttttagttacagac[0257]制备了下述9种质粒载体：[0258]–1号质粒：pex–a258–δcatb(seqidno：17)[0259]它含有被克隆到质粒pex–a258中的合成的dna片段δcatb。该δcatb片段包含i)在无水四环素诱导型启动子控制之下的靶向拜氏梭菌dsm6423的catb基因(编码氯霉素–o–乙酰转移酶的氯霉素抗性基因–seqidno：18)的向导rna表达盒(表达盒：seqidno：19)，和ii)包含位于catb基因的上游和下游的400个同源bp的编辑模板(seqidno：20)。[0260]–2号质粒：pcas9ind–δcatb(参见图2和seqidno：21)[0261]它含有通过pcr扩增(引物δcatb_fwd和δcatb_rev)并在用xhoi限制性酶消化各个dna后克隆到pcas9ind(描述在专利申请wo2017/064439中–seqidno：22)中的δcatb片段。[0262]–3号质粒：pcas9acr(参见图3和seqidno：23)[0263]–4号质粒：pec750s–upphr(参见图4和seqidno：24)[0264]它含有用于缺失upp基因并由在upp基因上游和下游的两个同源dna片段(尺寸分别为：500(seqidno：26)个和377(seqidno：27)个碱基对)构成的修复模板(seqidno：25)。所述组装体使用gibson克隆系统(newenglandbiolabs，gibson组装主混合物2x)来获得。为此目的，使用相应的引物rh001/rh002和rh003/rh004，从菌株dsm6423的基因组dna(参见matédegerando等，2018和登记号prjeb11626(https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/prjeb11626))通过pcr来扩增所述上游和下游部分。然后将这两个片段组装到之前通过限制性酶(sali和saci限制性酶)线性化的pec750s中。[0265]–5号质粒：pex–a2–grna–upp(参见图5和seqidno：28)[0266]这个质粒包含grna–uppdna片段，其对应于插入到名为pex–a2的复制质粒中的在组成型启动子(序列seqidno：30的非编码rna)控制之下的靶向upp基因的向导rna(靶向upp的前间区序列(seqidno：31))的表达盒(seqidno：29)。[0267]–6号质粒：pec750s–δupp(参见图6和seqidno：32)[0268]它具有质粒pec750s–upphr(seqidno：24)作为基础，并另外含有包含在组成型启动子控制之下的靶向upp基因的向导rna表达盒的dna片段。[0269]将这个片段插入到pex–a2中，被命名为pex–a2–grna–upp。然后将所述插入片段用引物pex–fwd和pex–rev通过pcr进行扩增，并用限制性酶xhoi和ncoi消化。最后，通过连接到先前用相同的限制性酶消化的pec750s–upphr中将该片段进行克隆，以获得pec750s–δupp。[0270]–7号质粒：pec750c–δupp(参见图7和seqidno：33)[0271]然后用引物pec750c–fwd和m13–rev扩增含有所述向导rna以及修复模板的表达盒。将所述扩增子用限制性酶xhoi和saci消化，然后通过酶法连接到pec750c中进行克隆，以获得pec750c–δupp。[0272]–8号质粒：pgrna–pnf2(参见图8和seqidno：34)[0273]该质粒具有pec750c作为其基础，并含有靶向pnf2质粒的向导rna表达盒(seqidno：118)。[0274]–9号质粒：pcas9ind–grna_catb(参见图16和seqidno：38)[0275]它含有通过pcr扩增(引物δcatb_fwd和δcatb_grna_rev)的靶向catb基因座的向导rna的编码序列，并将所述编码序列在用限制性酶xhoi消化各个dna并连接后克隆到pcas9ind(描述在专利申请wo2017/064439中)中。[0276]–10号质粒：pnf3(参见图25和seqidno：119)[0277]它含有使用引物rh021和rh022扩增的pnf2的一部分，具体来说包括复制原点和编码质粒复制蛋白(cibe_p20001)的基因。然后将该pcr产物在sali和bamhi限制性位点处克隆到质粒puc19(seqidno：117)中。[0278]–11号质粒：pec751s(参见图26和seqidno：121)[0279]它含有pec750c(seqidno：106)的除了catp氯霉素抗性基因(seqidno：70)之外的所有元件。后者被提供壮观霉素抗性的粪肠球菌(enterococcusfaecalis)aad9基因(seqidno：130)代替。这个元件使用引物aad9–fwd2和aad9–rev从质粒pmtl007s–e1(seqidno：120)扩增，并克隆到pec750c的avaii和hpai位点中代替catp基因(seqidno：70)。[0280]–12号质粒：pnf3s(参见图27和seqidno：123)[0281]它含有pnf3的所有元件，并在bamhi与saci位点之间插入aad9基因(使用引物rh031和rh032从pec751s扩增)。[0282]–13号质粒：pnf3e(参见图28和seqidno：124)[0283]它含有pnf3的所有元件，并插入在minipthl启动子控制之下的艰难梭菌ermb基因(seqidno：131)。该元件使用引物rh138和rh139从pfw01扩增，并克隆在pnf3e的bamhi与saci位点之间。[0284]–14号质粒：pnf3c(参见图29和seqidno：125)[0285]它含有pnf3的所有元件并插入有产气荚膜梭菌catp基因(seqidno：70)。该元件使用引物rh140和rh141从pec750c扩增并克隆在pnf3e的bamhi与saci位点之间。[0286]结果1[0287]拜氏梭菌菌株dsm6423的转化[0288]将质粒引入到大肠埃希氏杆菌dam–dcm–菌株(inv110，invitrogen)中并复制。这允许除去pcas9ind–δcatb质粒上的dam–和dcm–型甲基化，然后按照mermelstein等(1993)描述的方案将其通过转化引入到菌株dsm6423中，并对所述方案做出了下述修改：将菌株在od600为0.8时用更大量的质粒(20μg)并使用下述电穿孔参数进行转化：100ω，25μf，1400v。铺展在含有红霉素(20μg/ml)的皮氏培养皿上，由此得到含有pcas9ind–δcatb质粒的拜氏梭菌dsm6423转化体。[0289]cas9表达的诱导和获得拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb[0290]然后将几个红霉素抗性菌落转移到100μl培养基(2ytg)中，并在培养基中连续稀释到104的稀释倍数。对于每个菌落，将8μl每种稀释液置于含有红霉素和无水四环素(200ng/ml)的皮氏培养皿上，以诱导cas9核酸酶基因的表达。[0291]在提取基因组dna后，在该平板上生长的克隆中catb基因的缺失通过pcr，使用引物rh076和rh077来验证(参见图9)。[0292]拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb对甲砜霉素的敏感性的验证[0293]为了确保catb基因的缺失提供对甲砜霉素的新的敏感性，在琼脂培养基上进行了比较分析。拜氏梭菌dsm6423和拜氏梭菌dsm6423δcatb的预培养物生长在2ytg培养基上，然后将100μl这些预培养物在增补有浓度为15mg/l的甲砜霉素或不含甲砜霉素的2ytg琼脂培养基上铺板。图10显示只有初始的拜氏梭菌dsm6423菌株能够在增补甲砜霉素的培养基上生长。[0294]在拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb中通过crispr–cas9工具缺失upp基因[0295]将拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb的一个克隆预先用在dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序处不表现出甲基化的pcas9acr载体(从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备)转化。维持在拜氏梭菌菌株dsm6423中的质粒pcas9acr的存在，通过使用引物rh025和rh134的菌落pcr来验证。[0296]然后将红霉素抗性克隆用先前去甲基化的pec750c–δupp转化。将得到的菌落在含有红霉素(20μg/ml)、甲砜霉素(15μg/ml)和乳糖(40mm)的培养基上选择。[0297]然后将这些克隆中的几个重悬浮在100μl培养基(2ytg)中，并在培养基中连续稀释(至104的稀释倍数)。将5μl每种稀释液置于含有红霉素、甲砜霉素和无水四环素(200ng/ml)的皮氏培养皿上(参见图11)。[0298]对于每个克隆来说，使用被设计用于扩增upp基因座的引物，通过菌落pcr测试两个atc抗性菌落(参见图12)。[0299]在拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb中通过crispr–cas9工具缺失天然质粒pnf2[0300]将拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb的一个克隆预先用在dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序处不表现出甲基化的pcas9ind载体(从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备)转化。拜氏梭菌菌株dsm6423中质粒pcas9ind的存在，使用引物pcas9ind_fwd(seqidno：42)和pcas9ind_rev(seqidno：43)通过pcr来验证(参见图13)。[0301]然后将红霉素抗性克隆用于转化从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备的pgrna–pnf2。[0302]将在含有红霉素(20μg/ml)和甲砜霉素(15μg/ml)的培养基上获得的几个克隆重悬浮在培养基中并连续稀释至104的稀释倍数。将8μl每种稀释液置于含有红霉素、甲砜霉素和无水四环素(200ng/ml)的皮氏培养皿上，以诱导crispr/cas9表达。[0303]天然质粒pnf2的不存在使用引物pnf2_fwd(seqidno：39)和pnf2_rev(seqidno：40)，通过pcr来验证(参见图14)。[0304]结论[0305]在本工作的过程中，本发明人成功地在拜氏梭菌菌株dsm6423中引入并维持了不同的质粒。他们成功地在使用单个质粒的基础上使用crispr–cas9工具缺失了catb基因。得到的重组菌株对甲砜霉素的敏感性通过琼脂试验得以确认。[0306]这种缺失允许他们使用在专利申请fr1854835中描述的需要两个质粒的crispr–cas9工具。进行了演示本技术的重要性的两个实例：upp基因的缺失和对拜氏梭菌菌株dsm6423来说非必需的天然质粒的移除。[0307]结果2[0308]拜氏梭菌菌株的转化[0309]在大肠埃希氏杆菌菌株neb10–β中制备的质粒也被用于转化拜氏梭菌菌株ncimb8052。相反，对于拜氏梭菌dsm6423来说，将质粒预先引入到大肠埃希氏杆菌dam–dcm–菌株(inv110，invitrogen)中并复制。这允许在将感兴趣的质粒通过转化引入到菌株dsm6423中之前移除所述质粒上的dam–和dcm–型甲基化。[0310]对于每种菌株来说转化类似地进行，即按照mermelstein等，1992描述的方案并进行了下述修改：将菌株在od600为0.6–0.8时用更大量的质粒(5–20μg)转化，并且电穿孔参数为100ω、25μf、1400v。在2ytg中再生3h后，将细菌在含有所需抗生素(红霉素：20–40μg/ml；甲砜霉素：15μg/ml；壮观霉素：650μg/ml)的皮氏培养皿(2ytg琼脂)上铺板。[0311]拜氏梭菌dsm6423菌株的转化效率的比较[0312]转化在下述拜氏梭菌菌株中以两份生物平行样进行：dsm6423野生型，dsm6423δcatb和dsm6423δcatbδpnf2(图30)。为此使用了pcas9ind载体，所述载体由于不允许良好的转化效率而尤其难以用于修饰细菌。它还含有提供红霉素抗性的基因，所有三种菌株都对红霉素敏感。[0313]结果表明转化效率提高约15‑20倍，这可归因于天然质粒pnf2的丧失。[0314]也测试了提供甲砜霉素抗性的质粒pec750c的转化效率，但仅仅在dsm6423δcatb(ifp962δcatb)和dsm6423δcatbδpnf2(ifp963δcatbδpnf2)菌株中，因为野生型菌株对这种抗生素有抗性(图31)。对于这个质粒来说，转化效率的提高甚至更加显著(提高约2000倍)。[0315]pnf3质粒与其他质粒的转化效率的比较[0316]为了确定含有天然质粒pnf2的复制原点的质粒的转化效率，将质粒pnf3e和pnf3c引入到拜氏梭菌菌株dsm6423δcatbδpnf2中。含有红霉素或氯霉素抗性基因的载体的使用允许在抗性基因的本性的基础上比较载体的转化效率。也转化了质粒pfw01和pec750c。这两种质粒含有针对不同抗生素(分别为红霉素和甲砜霉素)的抗性基因，并且常用于转化拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌。[0317]正如在图32中所示，基于pnf3的载体显示出出色的转化效率，并且特别地可用于拜氏梭菌dsm6423δcatbδpnf2。具体来说，pnf3e(其含有红霉素抗性基因)与包含相同抗性基因的pfw01相比显示出明显更高的转化效率。该同一种质粒不能被引入到野生型拜氏梭菌dsm6423菌株中(在两份生物平行样中使用5μg转化质粒获得0个菌落)，证实了存在天然质粒pnf2的影响。[0318]pnf3质粒在其他菌株/菌种中的可转化性的验证[0319]为了说明在其他产溶剂梭菌属菌株中使用这种新质粒的可能性，本发明人在abe菌株拜氏梭菌ncimb8052中进行了质粒pfw01、pnf3e和pnf3s的转化效率的比较性分析(图33)。由于ncimb8052菌株天然对甲砜霉素具有抗性，因此使用提供壮观霉素抗性的pnf3s代替pnf3c。[0320]结果证实了ncimb8052菌株可以用基于pnf3的质粒转化，证明了这些载体适用于广泛意义上的拜氏梭菌菌种。[0321]也在来自于丙酮丁醇梭菌的参比菌株dsm792中测试了所述基于pnf3的合成载体套装的适用性。转化测定法显示了用pnf3c质粒转化这种菌株的可能性(转化效率为每μg转化的dna观察到3个菌落，相比于pec750c质粒的120个菌落/μg)。[0322]pnf3质粒与申请fr18/73492中描述的遗传工具的相容性的验证[0323]专利申请fr18/73492描述了δcatb菌株以及需要使用红霉素抗性基因和甲砜霉素抗性基因的双质粒crispr/cas9系统的用途。为了证实所述新的pnf3质粒套装的价值，将pnf3c载体转化到已含有pcas9acr质粒的δcatb菌株中。所述在两份平行样中进行的转化显示出转化效率为0.625±0.125个菌落/μgdna(平均值±标准误差)，证实了在δcatb菌株中基于pnf3c的载体可以与pcas9acr相组合使用。[0324]与这些结果相平行，所述pnf2质粒的包括其复制原点(seqidno：118)的部分可以成功地重新用于产生新的穿梭载体套装(seqidno：119、123、124和125)，它们可以被任意修饰，以特别是允许它们在大肠埃希氏杆菌菌株中的复制以及它们在拜氏梭菌dsm6423中的重新引入。这些新的载体表现出有利的转化效率，以在例如拜氏梭菌dsm6423及其衍生株中进行基因编辑，特别是使用包含两种不同核酸的crispr/cas9工具进行基因编辑。[0325]这些新的载体也已成功地在另一株拜氏梭菌(ncimb8052)和梭菌属菌种(特别是丙酮丁醇梭菌)中试验，证实了它们在厚壁菌门的其他生物体中的适用性。也在芽孢杆菌属中进行了试验。[0326]结论[0327]这些结果证实，天然质粒pnf2的缺失显著提高了含有它的细菌的转化效率(对于pfw01来说提高约15倍，对于pec750c来说提高约2000倍)。在已知难以转化的梭菌属细菌的情况下，特别是对于天然受制于低转化效率(低于5个菌落/μg质粒)的菌株拜氏梭菌dsm6423来说，这个结果是特别令人感兴趣的。[0328]参考文献[0329]–banerjee,a.,leang,c.,ueki,t.,nevin,k.p.,&lovley,d.r.(2014)，用于扬氏梭菌的代谢工程的乳糖诱导型系统(lactose–induciblesystemformetabolicengineeringofclostridiumljungdahlii)，appliedandenvironmentalmicrobiology,80(8),2410–2416.[0330]–chenj.–s.,hius.f.(1986)，通过拜氏梭菌(同义词，丁醇梭菌)生产丙酮–丁醇–异丙醇(acetone–butanol–isopropanolproductionbyclostridiumbeijerinckii(synonym,clostridiumbutylicum))，biotechnol.lett.8:371–376.[0331]–cui,l.,&bikard,d.(2016)，大肠埃希氏杆菌染色体中cas9切割的后果(consequencesofcas9cleavageinthechromosomeofescherichiacoli)，nucleicacidsresearch,44(9),4243–4251.[0332]–currie,d.h.,herring,c.d.,guss,a.m.,olson,d.g.,hogsett,d.a.,&lynd,l.r.(2013)，来自于热纤维梭菌的工程化全长cipa在解糖嗜热厌氧杆菌中的功能性异源表达(functionalheterologousexpressionofanengineeredfulllengthcipafromclostridiumthermocelluminthermoanaerobacteriumsaccharolyticum)，biotechnologyforbiofuels,6(1),32.[0333]–dicarlo,j.e.,norville,j.e.,mali,p.,rios,x.,aach,j.,&church,g.m.(2013)，酿酒酵母中使用crispr–cas系统的基因组工程(genomeengineeringinsaccharomycescerevisiaeusingcrispr–cassystems)，nucleicacidsresearch,41(7),4336–4343.[0334]–dong,h.,tao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：：2.梭菌属含有属于厚壁菌门的革兰氏阳性、严格厌氧、产孢子的细菌。出于几个原因，梭菌对于科学界来说是一个重要组群。首先是许多严重疾病(例如破伤风、肉毒梭菌中毒)由这个家族的致病成员的感染造成(gonzales等，2014)。其次是在生物技术中使用所谓的产酸或产溶剂菌株的可能性(john&wood，1986和moon等，2016)。这些非致病性梭菌天然具有在被称为abe的发酵过程中转化各种不同糖类以产生感兴趣的化学物质，尤其是丙酮、丁醇和乙醇的能力(john&wood，1986)。同样地，在某些特定菌种中，将丙酮以不同比例还原成异丙醇的ibe发酵是可能的(chen等，1986，george等，1983)，这是由于在这些菌株的基因组中存在编码仲醇脱氢酶的基因(s‑adh；ismael等，1993；hiu等，1987)。3.所述产溶剂梭菌菌种显示出显著的表型相似性，使得在现代测序技术出现之前难以将它们分类(rogers等，2006)。由于可以对这些细菌的完整基因组进行测序，现在可以将该细菌属分为4个主要种：丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)，糖乙酸多丁醇梭菌(c.saccharoperbutylacetonicum)，糖丁醇梭菌(c.saccharobutylicum)和拜氏梭菌(c.beijerinckii)。一份最近的出版物在对30个菌株的完整基因组进行比较分析后，将这些产溶剂梭菌分成4个主要进化枝(图1)。4.具体来说，这些研究组将菌种丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌分开，并将丙酮丁醇梭菌atcc824(也被命名为dsm792或lmg5710)和拜氏梭菌ncimb8052作为用于研究abe型发酵的模式菌株。5.天然能够进行ibe发酵的梭菌菌株很少，并且大部分属于拜氏梭菌种(zhang等，2018，表1)。这些菌株通常选自丁醇梭菌(c.butylicum)lmd27.6、金黄丁酸梭菌(c.aurantibutylicum)ncib10659、拜氏梭菌lmd27.6、拜氏梭菌vpi2968、拜氏梭菌nrrlb–593、拜氏梭菌atcc6014、拜氏梭菌mcclung3081、异丙醇梭菌(c.isopropylicum)iam19239、拜氏梭菌dsm6423、梭菌属菌种a1424、拜氏梭菌optinoii和拜氏梭菌bgs1。6.然而，到目前为止尚无已被遗传修饰过的能够天然产生异丙醇、特别是能够天然进行ibe发酵的梭菌属细菌菌株，特别是被遗传修饰以使其对属于酰胺醇类型的抗生素例如氯霉素或甲砜霉素敏感、优选地能够优化异丙醇生产的菌株。技术实现要素：7.本发明人在本发明的背景中首次描述了一种遗传修饰的拜氏梭菌细菌以及允许对梭菌属细菌进行遗传修饰的工具，所述细菌通常是天然(即在野生型中)能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌，特别是在野生型中包含为所述细菌提供对一种或多种抗生素的抗性的基因、特别是编码酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶的基因的细菌。8.根据本发明的优选的遗传修饰的细菌是不表达提供对一种或多种抗生素的抗性的酶的细菌，特别是不表达酰胺醇–o–乙酰转移酶的细菌，例如缺少或不能表达catb基因的细菌。9.根据本发明的优选的遗传修饰的细菌是在本说明书中被鉴定为拜氏梭菌dsm6423δcatb的细菌，其于2018年12月6日在比利时微生物协调保藏中心(belgianco–ordinatedcollectionsofmicro–organisms)(“bccm”，k.l.ledeganckstraat35,b–9000gent–belgium)登记在保藏号lmgp–31151下(也被标识为拜氏梭菌ifp962δcatb)。本说明书还涉及其任何衍生细菌、克隆、突变体或遗传修饰形式。10.本发明人描述的一个特定主题内容是一种核酸，其识别(至少部分结合)并优选地靶向、即识别并允许切割感兴趣的细菌的基因组中下述序列的至少一条链：i)编码允许所述感兴趣的细菌在含有抗生素、通常为属于酰胺醇类别的抗生素、优选地选自氯霉素、甲砜霉素、叠氮氯霉素和氟苯尼考的培养基中生长的酶，通常为酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶的序列；ii)控制编码所述酶的序列的转录的序列；或iii)在编码所述酶的序列两侧的序列。11.本发明人还描述了这种核酸的用途，其用于转化和/或遗传修饰梭菌属细菌，优选地天然能够产生异丙醇的梭菌属细菌，特别是能够进行ibe发酵的梭菌属细菌。12.具体来说，本发明人描述了识别拜氏梭菌dsm6423的基因组中序列seqidno：18的catb基因或与其具有至少70％同一性的序列的核酸的用途，其用于转化和/或遗传修饰拜氏梭菌dsm6423细菌。13.所述能够在野生型中产生异丙醇的细菌可以是例如选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌(c.diolis)细菌、微紫色梭菌(c.puniceum)细菌、丁酸梭菌(c.butyricum)细菌、糖乙酸多丁醇梭菌细菌、肉毒梭菌(c.botulinum)细菌、德雷克氏梭菌(c.drakei)细菌、粪味梭菌(c.scatologenes)细菌、产气荚膜梭菌(c.perfringens)细菌和突尼斯梭菌(c.tunisiense)细菌的细菌，优选为选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌和糖乙酸多丁醇梭菌细菌的细菌。天然能够产生异丙醇的特别优选的细菌是拜氏梭菌细菌。14.根据一个特定方面，所述识别并优选地靶向i)编码酰胺醇–o–乙酰转移酶的序列、ii)控制这个序列的转录的序列或iii)在这个序列两侧的序列的核酸，被用于转化选自dsm6423、lmg7814、lmg7815、nrrlb–593、nccb27006的拜氏梭菌的进化分枝和与菌株dsm6423具有至少97％同一性的进化分枝。15.本发明人还描述了一种转化并优选地遗传修饰梭菌属细菌的方法。这种方法包括通过在所述细菌中引入核酸来转化这种细菌的步骤，所述核酸识别并优选地靶向i)编码感兴趣的酶、优选为酰胺醇–o–乙酰转移酶的序列、ii)控制编码所述酶的序列的转录的序列或iii)在编码所述酶的序列两侧的序列。这种方法通常使用遗传修饰工具来进行，例如使用选自crispr工具、基于ii类内含子的工具和等位基因交换工具的遗传修饰工具。还描述了使用这种方法转化和遗传修饰的细菌，其实例是拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌。16.本发明人描述的另一方面涉及根据本发明所述的遗传修饰的细菌、优选为登记在保藏号lmgp–31151下的拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌或其遗传修饰形式的用途，其用于优选地在工业规模上生产溶剂、优选为异丙醇，或溶剂的混合物。17.最后，本说明书涉及试剂盒，特别是包含下述组分的试剂盒：本文中描述的核酸和遗传修饰工具，所述遗传修饰工具特别选自crispr工具、基于ii类内含子的工具和等位基因交换工具的遗传工具的元件、作为向导rna(grna)的核酸、作为修复模板的核酸、至少一个引物对和允许由所述工具编码的蛋白质的表达的诱导物。具体实施方式18.尽管在工业上已使用超过一个世纪，但对梭菌属细菌的了解仍受限于对它们进行遗传修饰时遇到的困难。19.近年来已设计了不同的遗传工具来优化这个属的菌株，最新的一代是基于成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)/crispr相关蛋白(cas)技术的使用。这种方法基于使用一种被称为核酸酶的酶(在crispr/cas遗传工具的情况下通常是cas‑型核酸酶，例如来自于酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9蛋白)，它在rna分子指导下在dna分子(感兴趣的靶序列)中进行双链切割。向导rna(grna)的序列决定所述核酸酶的切割位点，赋予其极高的特异性(图17)。20.由于必需dna分子中的双链切割对生物体来说是致命的，因此生物体的存活将取决于它修复所述切割的能力(参见cui&bikard,2016)。在梭菌属细菌中，双链断裂的修复依赖于同源重组机制，需要被切割序列的完整拷贝。通过为细菌提供允许这种修复并同时修饰原始序列的dna片段，有可能迫使所述微生物将所需的变化整合到其基因组中。通过修饰靶序列或pam位点，已进行的修饰必须不再允许cas9‑grna核糖核蛋白复合体靶向基因组dna(图18)。21.已描述了不同方法以尝试制造在梭菌属细菌中有功能的这种遗传工具。事实上，已知这些微生物由于转化和同源重组频率低而难以进行遗传修饰。几种方法是基于使用在拜氏梭菌和扬氏梭菌(c.ljungdahlii)中组成性表达(wang等，2015；huang等，2016)或在拜氏梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌和自养产乙醇梭菌(c.authoethanogenum)中在诱导型启动子控制之下表达(wang等，2016；nagaraju等，2016；wang等，2017)的cas9。其他作者描述了使用所述核酸酶的改良版本cas9n，其在基因组内进行单链而不是双链切割(xu等，2015；li等，2016)。这种选择是由于观察到在测试的实验条件下，cas9对于在梭菌属细菌中使用来说毒性过大。大多数上述工具依靠使用单一质粒。最后，当在微生物的基因组内鉴定到内源crispr/cas系统时，也可以使用它们，正如在巴氏梭菌(c.pasteurianum)中那样(pyne等，2016)。22.除非使用(如上述最后一种情况)待修饰菌株的内源机制，否则基于crispr技术的工具的主要缺点是显著限制了可以插入到细菌基因组中的感兴趣的核酸的尺寸(以及因此编码序列或基因的数目)(根据xu等，2015，最大约1.8kb)。23.基于使用显著解决了这一问题的两种不同的核酸、通常为两种质粒(参见wo2017064439，wasels等，2017和图3)，本发明人已开发并描述了一种用于修饰细菌的更加强有力的遗传工具，其适合于细菌、通常为属于厚壁菌门的细菌、特别是梭菌属细菌。在特定实施方式中，这种工具的第一核酸允许cas9的表达，并且特异性针对待进行的修饰的第二核酸含有一个或多个grna表达盒以及允许被cas9靶向的细菌dna的一部分被感兴趣的序列代替的修复模板。通过将cas9和/或grna表达盒置于诱导型启动子的控制之下，所述系统的毒性受到限制。本发明人最近改进了这种工具，使其能够非常显著地提高转化效率，并因此以有用的数目和数量(特别是在选择用于工业规模生产的鲁棒菌株的情况下)获得感兴趣的遗传修饰的细菌(参见fr18/54835)。在这种改进的工具中，至少一个核酸包含置于诱导型启动子控制之下的编码抗crispr蛋白(“acr”)的序列。这种抗crispr蛋白抑制dna核酸内切酶/向导rna复合体的活性。所述蛋白的表达受到调控，以允许其仅在所述细菌的转化阶段中表达。24.在本说明书的上下文中，属于厚壁菌门的细菌被理解为意味着属于梭菌纲、柔膜菌纲、杆菌纲或togobacteria，优选地属于梭菌纲或杆菌纲的细菌。25.属于厚壁菌门的具体细菌包括例如梭菌属细菌、芽孢杆菌属细菌或乳杆菌属细菌。[0026]“芽孢杆菌属细菌”具体来说意味着解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、苏云金芽孢杆菌(b.thurigiensis)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、蜡样芽孢杆菌(b.cereus)、炭疽芽孢杆菌(b.anthracis)或枯草芽孢杆菌(b.subtilis)。[0027]“梭菌属细菌”具体来说意味着工业上感兴趣的梭菌属菌种，通常为产溶剂或产乙酸梭菌属细菌。表述“梭菌属细菌”涵盖了野生型细菌以及从其衍生的菌株，它们进行了目的在于改进其性能的遗传修饰(例如过表达ctfa、ctfb和adc基因)，但尚未暴露于crispr系统。[0028]“工业上感兴趣的梭菌属菌种”意味着能够从糖或单糖，通常从包含5个碳原子的糖例如木糖、阿拉伯糖或果糖，从包含6个碳原子的糖例如葡萄糖或甘露糖，从多糖例如纤维素或半纤维素，和/或从可以被梭菌属细菌同化和使用的任何其他碳源(例如co、co2和甲醇)，通过发酵产生溶剂和酸例如丁酸或乙酸的菌种。感兴趣的产溶剂细菌的实例是产生丙酮、丁醇、乙醇和/或异丙醇的梭菌属细菌，例如在文献中被标识为“abe菌株”[执行允许产生丙酮、丁醇和乙醇的发酵的菌株]和“ibe菌株”[执行允许产生异丙醇(通过丙酮的还原)、丁醇和乙醇的发酵的菌株]的菌株。产溶剂梭菌属细菌可以例如选自丙酮丁醇梭菌、解纤维梭菌(c.cellulolyticum)、植物发酵梭菌(c.phytofermentans)、拜氏梭菌、糖丁醇梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、产芽胞梭菌(c.sporogenes)、丁酸梭菌、金黄丁酸梭菌和酪丁酸梭菌(c.tyrobutyricum)，最优选地选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、酪丁酸梭菌和解纤维梭菌，甚至更优选地选自丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌。[0029]天然产生异丙醇，通常在基因组中具有编码将丙酮还原成异丙醇的伯醇/仲醇脱氢酶的adh基因的梭菌属细菌，在遗传和功能两方面与能够在天然状态下进行abe发酵的细菌区分开。[0030]有利的是，在本发明的情形中，本发明人成功地对一种天然产异丙醇的梭菌属细菌拜氏梭菌dsm6423细菌以及参比菌株丙酮丁醇梭菌dsm792进行了遗传修饰。[0031]因此，本发明人第一次描述了一种已被遗传修饰的天然(即在野生型中)能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌，以及使所述细菌能够被获得的工具，特别是遗传工具。这些工具的优点在于显著促进能够在野生型中产生异丙醇、特别是进行ibe发酵的细菌，特别是那些带有编码负责抗生素抗性的酶的基因的细菌的转化和遗传修饰。[0032]实验部分中描述的一部分工作在能够进行ibe发酵的菌株即拜氏梭菌菌株dsm6423中进行，所述菌株的基因组和转录组分析最近已被本发明人描述(mátédegerando等，2018)。[0033]具体来说，在该菌株的基因组组装中，本发明人发现除了染色体之外，还存在可移动遗传元件(登记号prjeb11626–https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/prjeb11626)：两个天然质粒(pnf1和pnf2)和一个线性噬菌体(φ6423)。[0034]在本发明的特定实施方式中，本发明人成功地从拜氏梭菌菌株dsm6423中缺失了它的天然质粒pnf2。[0035]在另一个特定实施方式中，他们成功地缺失了拜氏梭菌菌株dsm6423的染色体中最初存在的upp基因。因此，这些实验证实了所述工具以及更广义来说由本发明人在本文中描述的技术对能够在野生型中产生异丙醇、特别是进行ibe发酵的细菌进行遗传修饰的可能用途。[0036]在特别有利的实施方式中，本发明人特别成功地使作为编码负责酰胺醇类抗生素抗性的酶的基因的天然携带者(在野生型中携带)的细菌对这些抗生素敏感。[0037]在本发明的情形中，感兴趣的酰胺醇类抗生素的实例是氯霉素、甲砜霉素、叠氮氯霉素和氟苯尼考(schwarzs.等，2004)，特别是氯霉素和甲砜霉素。[0038]因此，本发明的第一方面涉及一种可用于对感兴趣的细菌进行遗传转化和/或修饰的遗传工具，所述感兴趣的细菌通常是本文中描述的属于厚壁菌门的细菌，例如梭菌属、芽孢杆菌属或乳杆菌属的细菌，优选为天然(即在野生型中)能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌，优选为天然对一种或多种抗生素具有抗性的细菌，例如拜氏梭菌细菌。优选的细菌在野生型中具有细菌染色体和至少一个不同于染色体dna的dna分子两者。[0039]根据一个特定方面，这种遗传工具由识别(至少部分结合)并优选地靶向、即识别并允许切割感兴趣的细菌的基因组中下述序列的至少一条链的核酸(在本文中也被称为“感兴趣的核酸”)构成：i)允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶的编码序列，ii)控制允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶的编码序列的转录的序列，或iii)在允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶的编码序列两侧的序列。这种感兴趣的核酸在本发明的情形中通常用于从所述细菌的基因组缺失所述被识别的序列或修饰其表达，例如调节/调控其表达，特别是抑制它，优选地修饰它以使所述细菌不能表达来自于所述序列的蛋白，特别是功能性蛋白。所述被识别序列在本文中也被称为“靶序列”或“被靶向序列”。[0040]在特定实施方式中，所述感兴趣的核酸包含至少一个与所述靶序列互补的区域，其与所述细菌基因组内被靶向的dna区域/部分/序列具有100％同一性或至少80％同一性，优选地85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且能够杂交到与所述区域/部分/序列互补的序列的全部或一部分，通常杂交到包含至少1个核苷酸，优选地至少1、2、3、4、5、10、14、15、20、25、30、35或40个核苷酸，通常为1、10或20至1000个核苷酸之间，例如1、10或20至900、800、700、600、500、400、300或200个核苷酸之间，1、10或20至100个核苷酸之间，1、10或20至50个核苷酸之间或1、10或20至40个核苷酸之间，例如10至40个核苷酸之间、10至30个核苷酸之间、10至20个核苷酸之间、20至30个核苷酸之间、15至40个核苷酸之间、15至30个核苷酸之间或15至20个核苷酸之间的序列，优选杂交到包含14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的序列。与所述感兴趣的核酸内存在的靶序列互补的区域可以对应于在本文中描述的crispr工具中使用的向导rna(grna)的“sds”区域。[0041]在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的核酸包含至少两个各自与靶序列互补的区域，其与所述细菌基因组内的所述被靶向的dna区域/部分/序列具有100％同一性或至少80％同一性，优选地至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。这些区域能够杂交到与所述区域/部分/序列互补的序列的全部或一部分，通常杂交到如上所述包含至少1个核苷酸，优选地至少100个核苷酸，通常为100至1000个核苷酸之间的序列。所述与感兴趣的核酸内存在的靶序列互补的区域可以识别、优选地靶向本文中描述的遗传修饰工具例如遗传工具、遗传工具或型等位基因交换工具中所述被靶向序列的5′和3′侧翼区。[0042]通常，所述靶序列是在感兴趣的梭菌属细菌的基因组中编码酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶的序列、控制这种序列的转录的序列或在这种序列两侧的序列，所述细菌能够在含有属于酰胺醇类的一种或多种抗生素例如氯霉素和/或甲砜霉素的培养基中生长。[0043]在特定实施方式中，所述被识别的序列是对应于来自于拜氏梭菌dsm6423的编码氯霉素–o–乙酰转移酶的catb基因(cibe_3859)的序列seqidno：18，或与所述氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，或包含序列seqidno：18的全部或至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。换句话说，所述被识别的序列可以是包含序列seqidno：18的至少1个核苷酸，优选地至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个核苷酸，通常为1至40个核苷酸之间的序列，优选为包含序列seqidno：18的14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的序列。[0044]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少70％同一性的氨基酸序列的实例对应于在ncbi数据库中下述条目下标识的序列：wp_077843937.1，seqidno：44(wp_063843219.1)，seqidno：45(wp_078116092.1)，seqidno：46(wp_077840383.1)，seqidno：47(wp_077307770.1)，seqidno：48(wp_103699368.1)，seqidno：49(wp_087701812.1)，seqidno：50(wp_017210112.1)，seqidno：51(wp_077831818.1)，seqidno：52(wp_012059398.1)，seqidno：53(wp_077363893.1)，seqidno：54(wp_015393553.1)，seqidno：55(wp_023973814.1)，seqidno：56(wp_026887895.1)，seqidno：57(awk51568.1)，seqidno：58(wp_003359882.1)，seqidno：59(wp_091687918.1)，seqidno：60(wp_055668544.1)，seqidno：61(kgk90159.1)，seqidno：62(wp_032079033.1)，seqidno：63(wp_029163167.1)，seqidno：64(wp_017414356.1)，seqidno：65(wp_073285202.1)，seqidno：66(wp_063843220.1)，以及seqidno：67(wp_021281995.1)。[0045]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少75％同一性的氨基酸序列的实例对应于序列wp_077843937.1、wp_063843219.1、wp_078116092.1、wp_077840383.1、wp_077307770.1、wp_103699368.1、wp_087701812.1、wp_017210112.1、wp_077831818.1、wp_012059398.1、wp_077363893.1、wp_015393553.1、wp_023973814.1、wp_026887895.1awk51568.1、wp_003359882.1、wp_091687918.1、wp_055668544.1和kgk90159.1。[0046]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少90％同一性的氨基酸序列的实例是序列wp_077843937.1、wp_063843219.1、wp_078116092.1、wp_077840383.1、wp_077307770.1、wp_103699368.1、wp_087701812.1、wp_017210112.1、wp_077831818.1、wp_012059398.1、wp_077363893.1、wp_015393553.1、wp_023973814.1、wp_026887895.1和awk51568.1。[0047]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少95％同一性的氨基酸序列的实例对应于序列wp_077843937.1、wp_063843219.1、wp_078116092.1、wp_077840383.1、wp_077307770.1、wp_103699368.1、wp_087701812.1、wp_017210112.1、wp_077831818.1、wp_012059398.1、wp_077363893.1、wp_015393553.1、wp_023973814.1和wp_026887895.1。[0048]与序列seqidno：18编码的氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少99％同一性的优选氨基酸序列是序列wp_077843937.1、seqidno：44(wp_063843219.1)和seqidno：45(wp_078116092.1)。[0049]与seqidno：18同一的具体序列是在ncbi数据库中在条目wp_077843937.1下标识的序列。[0050]在特定实施方式中，所述靶序列是对应于来自于产气荚膜梭菌的编码氯霉素–o–乙酰转移酶的catq基因的序列seqidno：68，其氨基酸序列对应于seqidno：66(wp_063843220.1)，或与所述氯霉素–o–乙酰转移酶具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列，或包含序列seqidno：68的全部或至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。[0051]换句话说，所述被识别的序列可以是包含序列seqidno：68的至少1个核苷酸，优选地至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个核苷酸，通常为1至40个核苷酸之间的序列，优选为包含序列seqidno：68的14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的序列。[0052]在又一个特定实施方式中，所述被识别的序列选自本领域技术人员已知的天然存在于梭菌属细菌中或被人工引入到此类细菌中的核酸序列catb(seqidno：18)、catq(seqidno：68)、catd(seqidno：69，schwarzs.等，2004)或catp(seqidno：70，schwarzs.等，2004)。[0053]正如上文指明的，根据另一个实施方式，所述靶序列也可以是控制如上所述的编码序列(编码允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶)的转录的序列，通常为启动子序列例如catb基因的启动子序列(seqidno：73)或catq基因的启动子序列(seqidno：74)。[0054]然后，所述用作遗传工具的感兴趣的核酸识别并因此通常能够结合到控制如上所述的编码序列的转录的序列。[0055]根据另一个实施方式，所述靶序列可以是在如上所述的编码序列(编码允许所述感兴趣的细菌在含有其赋予抗性的抗生素的培养基中生长的酶)两侧的序列，例如在序列seqidno：18的catb基因或与其具有至少70％同一性的序列两侧的序列。这种侧翼序列通常包含1、10或20至1000个核苷酸，例如1、10或20至900、800、700、600、500、400、300或200个核苷酸之间，1、10或20至100个核苷酸之间，1、10或20至50个核苷酸之间或1、10或20至40个核苷酸之间，例如10至40个核苷酸之间、10至30个核苷酸之间、10至20个核苷酸之间、20至30个核苷酸之间、15至40个核苷酸之间、15至30个核苷酸之间或15至20个核苷酸之间。[0056]根据一种特定情况，所述靶序列对应于在此类编码序列两侧的一对序列，每个侧翼序列通常包含至少20个核苷酸，通常为100至1000个核苷酸之间，优选为200至800个核苷酸之间。[0057]在本发明的意义上，“核酸”意味着任何天然、合成、半合成或重组的dna或rna分子，其任选被化学修饰(即包含非天然碱基、含有例如修饰的连键、修饰的碱基和/或修饰的糖的修饰的核苷酸)，或者被优化以使得从所述编码序列合成的转录本的密码子是打算在其中使用的梭菌属细菌中最常发现的密码子。在梭菌属的情况下，所述优化的密码子通常是富含腺嘌呤(“a”)和胸腺嘧啶(“t”)碱基的密码子。[0058]在本文中描述的肽序列中，氨基酸用对应于下述命名法的单字母编码表示：c：半胱氨酸；d：天冬氨酸；e：谷氨酸；f：苯丙氨酸；g：甘氨酸；h：组氨酸；i：异亮氨酸；k：赖氨酸；l：亮氨酸；m：甲硫氨酸；n：天冬酰胺；p：脯氨酸；q：谷氨酰胺；r：精氨酸；s：丝氨酸；t：苏氨酸；v：缬氨酸；w：色氨酸和y：酪氨酸。[0059]在本发明的情形中，所述用作遗传工具以转化和/或遗传修饰感兴趣的细菌的感兴趣的核酸是在梭菌属细菌、特别是天然能够产生异丙醇、特别是天然能够进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌的基因组中i)识别感兴趣的酶的编码序列、ii)控制所述感兴趣的酶的编码序列的转录或iii)在所述感兴趣的酶的编码序列两侧的dna片段，所述感兴趣的酶优选为酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶或甲砜霉素–o–乙酰转移酶。[0060]所述能够天然产生异丙醇的细菌可以是例如选自拜氏梭菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌、丁酸梭菌细菌、糖乙酸多丁醇梭菌细菌、肉毒梭菌细菌、德雷克氏梭菌细菌、粪味梭菌细菌、产气荚膜梭菌细菌和突尼斯梭菌细菌的细菌，优选为选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌(细菌、微紫色梭菌细菌和糖乙酸多丁醇梭菌细菌的细菌。在野生型中能够产生异丙醇的特别优选的细菌是拜氏梭菌细菌。[0061]根据一种特定情况，所述梭菌属细菌是拜氏梭菌细菌，其进化分枝选自dsm6423、lmg7814、lmg7815、nccb27006和与菌株dsm6423具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的进化分枝。[0062]正如上文指明的，根据本发明所述的感兴趣的核酸能够缺失在所述细菌的基因组中识别的序列(“靶序列”)或修饰它的表达，例如调节它，特别是抑制它，优选地修饰它以使所述细菌不能从所述序列表达蛋白，优选为酰胺醇–o–乙酰转移酶，特别是有功能的蛋白。[0063]这种感兴趣的核酸通常采取表达盒(或“构建物”)的形式，例如包含操作性连接(在本领域技术人员所理解的意义上)到一个或多个感兴趣的(编码)序列的转录启动子的核酸，例如包含其表达产物有助于在所述细菌内实现感兴趣的功能的几个感兴趣的编码序列的操纵子，或另外还包含活化序列和/或转录终止子的核酸；或采取包含一个或多个如上所定义的表达盒的环状或线状单链或双链载体的形式，例如质粒、噬菌体、粘粒、人工或合成染色体。优选地，所述载体是质粒。[0064]所述感兴趣的核酸、优选为表达盒或载体，可以通过专业技术人员公知的常规技术来构建，并且可以包含一个或多个启动子、细菌复制原点(ori序列)、终止序列、选择基因例如抗生素抗性基因和允许所述表达盒或载体靶向插入的序列(例如“侧翼区”)。此外，这些表达盒和载体可以通过专业技术人员公知的技术整合到基因组中。[0065]感兴趣的ori序列可以选自pip404、pamβ1、pcb102、reph(丙酮丁醇梭菌中的复制原点)、cole1或rep(大肠埃希氏杆菌中的复制原点)或允许所述载体、通常为质粒在梭菌细胞中维持的任何其他复制原点。[0066]感兴趣的终止序列可以选自adc、thl、bcs操纵子或专业技术人员公知的允许在梭菌中转录终止的任何其他终止子。[0067]感兴趣的选择基因(抗性基因)可以选自ermb、catp、bla、teta、tetm和/或提供针对氨苄青霉素、红霉素、氯霉素、甲砜霉素、四环素或专业技术人员公知的可用于选择梭菌属细菌的任何其他抗生素的抗性的任何其他基因。[0068]在所述被识别的酶编码序列是为细菌提供氯霉素和/或甲砜霉素抗性的序列的特定实施方式中，所述选择基因不是氯霉素和/或甲砜霉素抗性基因，并且优选地不是catb、catq、catd或catp基因中的任一者。[0069]在特定实施方式中，所述感兴趣的核酸包含靶向编码感兴趣的酶、特别是酰胺醇–o–乙酰转移酶、控制所述酶的转录或在所述酶的编码序列两侧的序列(“靶序列”、“被靶向序列”或“被识别的序列”)的一个或多个向导rna(grna)，和/或修饰模板(在本文中也被称为“编辑模板”)，例如能够消除或修饰所述靶序列的全部或一部分优选地以便抑制或压制所述靶序列的表达的模板，通常为包含与位于如上所述的靶序列的上游和下游的序列同源(对应)的序列的模板，通常序列(与所述位于靶序列上游和下游的序列同源)各自包含10或20个碱基对至1000、1500或2000个碱基对之间，例如100、200、300、400或500个碱基对至1000、1200、1300、1400或1500个碱基对之间，优选地100至1500或100至1000个碱基对之间，甚至更优选地500至1000个碱基对或200至800个碱基对之间。[0070]特别感兴趣的核酸采取包含一个或多个表达盒的载体的形式，每个表达盒编码至少一个向导rna(grna)。[0071]根据本发明所述的特定遗传工具包含几个(至少两个)如上所述的感兴趣的核酸，所述感兴趣的核酸彼此不同。[0072]在特定实施方式中，所述用作遗传工具以转化和/或遗传修饰感兴趣的细菌、通常为梭菌属细菌的感兴趣的核酸，是识别为所述细菌提供对一种或多种抗生素的抗性的酶的编码序列、控制所述酶的编码序列的转录的序列或在所述编码序列两侧的序列，并且能够缺失该细菌的基因组中的所述序列或使其无功能的核酸，特别是在被dam–和dcm–型甲基转移酶(从表现出dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备)识别的基序的水平上不表现出甲基化的核酸。[0073]当所述待转化和/或遗传修饰的感兴趣的细菌是拜氏梭菌细菌，特别是属于进化分枝dsm6423、lmg7814、lmg7815、nrrlb–593和nccb27006之一的拜氏梭菌细菌时，所述用作遗传工具例如质粒的感兴趣的核酸是在被dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序的水平上不表现出甲基化的核酸，通常为其中gatc基序的腺苷(“a”)和/或ccwgg基序(w可以对应于腺苷(“a”)或胸苷(“t”))的第二个胞苷“c”被去甲基化的核酸。[0074]被dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序不表现出甲基化的核酸通常可以从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌(例如大肠埃希氏杆菌inv110，invitrogen)制备。这种核酸可能含有例如由ecoki型甲基转移酶进行的其他甲基化，后一种酶靶向aac(n6)gtgc和gcac(n6)gtt基序(n可以对应于任何碱基)的腺嘌呤(“a”)。[0075]在优选实施方式中，所述被靶向的序列对应于编码酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶的基因例如catb基因、控制该基因的转录的序列或在该基因两侧的序列。[0076]在本发明的情形中用作遗传工具的特别感兴趣的核酸是例如载体，优选为质粒，例如在本说明书的实验部分中描述的序列seqidno：21的质粒pcas9ind–δcatb或序列seqidno：38的质粒pcas9ind–grna_catb，特别是所述序列的在被dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序处不表现出甲基化的版本。[0077]本说明书还涉及本文中描述的感兴趣的核酸的用途，其用于转化和/或遗传修饰感兴趣的细菌，特别是能够在野生型中产生异丙醇、特别是能够在野生型中进行ibe发酵的产溶剂梭菌属细菌。[0078]能够在野生型中产生异丙醇、特别是能够在野生型中进行ibe发酵的细菌可以是例如选自拜氏梭菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌、丁酸梭菌细菌、糖乙酸多丁醇梭菌细菌、肉毒梭菌细菌、德雷克氏梭菌细菌、粪味梭菌细菌、产气荚膜梭菌细菌和突尼斯梭菌细菌的细菌，优选为选自拜氏梭菌细菌、二醇梭菌细菌、微紫色梭菌细菌和糖乙酸多丁醇梭菌细菌的细菌。[0079](天然)能够在野生型中产生异丙醇、特别是能够在野生型中进行ibe发酵的特别优选的细菌是拜氏梭菌细菌。[0080]所述感兴趣的产乙酸细菌是从co2和h2产生酸和/或溶剂的细菌。产乙酸梭菌属细菌可以例如选自醋酸梭菌(c.aceticum)、嗜热醋酸梭菌(c.thermoaceticum)、扬氏梭菌、自养产乙醇梭菌(c.autoethanogenum)、艰难梭菌(c.difficile)、粪味梭菌和食一氧化碳梭菌(c.carboxydivorans)。[0081]在特定实施方式中，所述有关的梭菌属细菌是“abe菌株”，优选为丙酮丁醇梭菌菌株dsm792(也被称为atcc菌株824或lmg5710)或拜氏梭菌菌株ncimb8052。[0082]在另一个特定实施方式中，所述有关的梭菌属细菌是“ibe菌株”，通常为本说明书中鉴定的拜氏梭菌细菌之一，例如其进化分枝选自dsm6423、lmg7814、lmg7815、nrrlb–593、nccb27006的拜氏梭菌或金黄丁酸梭菌dszm793细菌(georges等，1983)，和与菌株dsm6423显示出至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的此类拜氏梭菌或金黄丁酸梭菌细菌的进化分枝。特别优选的拜氏梭菌细菌或拜氏梭菌细菌的进化分枝缺少pnf2质粒。[0083]一方面是lmg7814、lmg7815、nrrlb–593和nccb27006进化分枝的相应基因组，另一方面是dszm793的基因组，显示出与dsm6423进化分枝的基因组至少97％的序列同一性百分数。[0084]本发明人已进行了发酵试验，确认了进化分枝dsm6423、lmg7815和nccb27006的拜氏梭菌细菌能够在野生型中产生异丙醇(参见表1)。[0085][表1][0086][0087][0088]使用天然产异丙醇菌株拜氏梭菌dsm6423、lmg7815和nccb27006的葡萄糖发酵试验的概述[0089]在本发明的特别优选实施方式中，所述拜氏梭菌细菌是dsm6423进化分枝细菌。[0090]在本发明的又一个实施方式中，所述拜氏梭菌细菌是拜氏梭菌ifp963δcatbδpnf2菌株(于2019年2月20日在bccm–lmg保藏中心登记在保藏号lmgp–31277下，并且在本文中也被称为拜氏梭菌dsm6423δcatbδpnf2)。[0091]根据一个特定实施方式，所述待转化并优选地遗传修饰的细菌是已暴露于使用根据本发明的核酸或遗传工具的第一转化步骤和第一遗传修饰步骤，使得可以缺失在野生型中天然存在于所述细菌中的至少一个染色体外dna分子(通常为至少一个质粒)的细菌。[0092]本发明人描述的另一方面涉及一种使用根据本发明的遗传工具，通常使用如上所述的根据本发明的感兴趣的核酸来转化并优选地还遗传修饰梭菌属细菌的方法。所述方法包括通过将本文中描述的感兴趣的核酸引入到所述细菌中来转化所述细菌的步骤。所述方法还可以包括获得、回收、选择或分离所述转化的细菌，即具有所需重组/修饰/优化的细菌的步骤。[0093]在特定实施方式中，所述用于转化并优选地遗传修饰梭菌属细菌的方法涉及遗传修饰工具，例如选自crispr、基于使用ii类内含子的工具(例如工具或工具)和等位基因交换工具(例如工具)的遗传修饰工具，并包括通过将如上所述根据本发明的感兴趣的核酸引入到所述细菌中来转化所述细菌的步骤。[0094]通常，本发明有利地在所述被选择用于转化并优选地遗传修饰梭菌属细菌的遗传修饰工具旨在用于在野生型中带有负责对一种或多种抗生素的抗性的酶的编码基因的细菌例如拜氏梭菌的情况下实施，并且所述遗传工具的实施包括在允许该细菌在野生型中有抗性的抗生素的抗性标记物表达的核酸的帮助下转化所述细菌的步骤，和/或在所述抗生素(所述细菌在野生型中对其有抗性)的帮助下选择所述转化和/或遗传修饰的细菌的步骤。[0095]可以例如使用选自crispr工具、基于使用ii类内含子的工具和等位基因交换工具的遗传修饰工具通过本发明有利地实现的修饰，主要在于缺失为所述细菌提供针对一种或多种抗生素的抗性的酶的编码序列，或主要在于使该序列无功能。可以通过本发明有利地实现的另一种修饰主要在于对细菌进行遗传修饰以便提高它的性能，例如它的生产感兴趣的溶剂或溶剂混合物的性能，所述细菌先前已通过本发明进行修饰，使其对它在野生型中有抗性的抗生素敏感。[0096]在优选实施方式中，根据本发明所述的方法是基于成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)技术/遗传工具、特别是crispr/cas(crispr相关蛋白)遗传工具的使用(实施)。[0097]这种方法是基于使用被称为核酸酶的酶(在crispr/cas遗传工具的情况下通常是cas–型核酸酶，例如来自于酿脓链球菌的crispr相关蛋白9(cas9蛋白))，其在rna分子指导下在dna分子(感兴趣的靶序列)中制造双链切割。所述向导rna(grna)的序列决定所述核酸酶的切割位点，为其提供非常高的特异性。由于对微生物的存活来说必需dna分子内的双链切割事实上对生物体是致死的，因此所述生物体的存活取决于它修复所述切割的能力(参见例如cui&bikard，2016)。在梭菌属细菌中，双链断裂的修复依靠同源重组机制，需要被切割序列的完整拷贝。通过为所述细菌提供在修饰原始序列的同时允许发生修复的dna片段，可以迫使所述微生物将所需变化整合在它的基因组中。[0098]本发明可以在梭菌属细菌中使用常规的crispr/cas遗传工具来实施，使用如wang等(2015)所描述的包含核酸酶、grna和修复模板的单一质粒。所述crispr/cas系统含有两个不同的必需元件，即i)核酸内切酶，在这种情况下是crispr相关核酸酶cas，以及ii)向导rna。所述向导rna采取嵌合rna的形式，其由细菌crisprrna(crrna)和tracrrna(反式激活crisprrna)的组合构成。所述grna将充当cas蛋白的向导的对应于“间隔物序列”的crrna的靶向特异性与crrna的构象性质组合在单一转录本中。当所述grna和cas蛋白在细胞中同时表达时，由于提供的修复模板，所述靶基因组序列可以被永久性地修饰。专业技术人员可以使用公知的技术，根据待靶向的染色体区域或可移动遗传元件容易地确定所述grna的序列和结构(参见例如dicarlo等，2013的论文)。[0099]所述遗传工具的元件(核酸或grna)在所述细菌中的引入通过专业技术人员已知的任何直接或间接方法来进行，例如通过转化、接合、微注射、转染、电穿孔等，优选地通过电穿孔(mermelstein等，1993)。[0100]本发明人最近已开发并描述了一种基于使用两种质粒的用于修饰细菌的遗传工具，其适合于梭菌属细菌并且可以在本发明的情形中使用(参见wo2017/064439，wasels等，2017，和与本说明书相关的图15)。[0101]在特定实施方式中，这种工具的“第一”质粒允许cas核酸酶的表达，并且特异性针对待进行的修饰的“第二”质粒含有一个或多个grna表达盒(通常靶向细菌dna的不同区域)，以及允许通过同源重组机制将细菌dna中被cas靶向的部分用感兴趣的序列代替的修复模板。所述cas基因和/或grna表达盒被置于本领域技术人员已知的组成型或诱导型、优选为诱导型，并且优选地不同但可以通过相同的诱导剂诱导的表达启动子(例如在申请wo2017/064439中描述的并通过参考并入本说明书)的控制之下。[0102]所述grna可以是天然rna、合成的rna或通过重组技术产生的rna。这些grna可以通过专业技术人员已知的任何方法来制备，例如化学合成、体内转录或扩增技术。当使用多个grna时，每个grna的表达可以通过不同的启动子控制。优选地，用于所有grna的启动子是相同的。在特定实施方式中，相同的启动子可用于表达几个、例如仅仅一些，或者换句话说全部或某些打算表达的grna。[0103]在适合于在本发明的情形中使用的另一个特定实施方式中，ii)所述“第一”和“第二”核酸中的至少一者还编码一个或多个向导rna(grna)，或者所述遗传工具还包含一个或多个向导rna，每个向导rna包含结合cas酶的rna结构和与所述细菌dna的被靶向部分互补的序列，和iii)所述“第一”和“第二”核酸中的至少一者还包含在诱导型启动子控制之下的编码抗crispr蛋白的序列，或者所述遗传工具还包含在诱导型启动子控制之下的编码抗crispr蛋白的“第三”核酸，所述启动子优选地不同于控制cas和/或rna表达的启动子，并且可以通过另一种诱导剂诱导。[0104]在优选实施方式中，所述抗crispr蛋白优选地在将所述遗传工具的核酸序列引入到感兴趣的细菌菌株的阶段中能够抑制、优选地中和所述核酸酶的作用。[0105]一种涉及crispr技术，可以在本发明的情形中实施以转化并通常通过同源重组遗传修饰梭菌属细菌的特定方法包括下述步骤：[0106]a)在诱导抗crispr蛋白的表达的试剂存在下，将本发明人描述的crispr遗传工具引入到所述细菌中，以及[0107]b)将在步骤a)结束时获得的转化的细菌在不含用于诱导抗crispr蛋白的表达的试剂的培养基上(或在不涉及所述试剂的条件下)培养，通常允许cas/grna核糖核蛋白复合体的表达。[0108]在特定实施方式中，所述方法在步骤b)期间或之后还包括诱导控制cas和/或向导rna的表达的诱导型启动子(在此类启动子存在于所述遗传工具中的情况下)的步骤，以便在所述遗传工具被引入到所述细菌中之后允许所述细菌的感兴趣的遗传修饰。所述诱导使用允许解除与所选诱导型启动子相关的表达抑制的物质来进行。[0109]在另一个特定实施方式中，所述方法还包括除去所述含有修复模板的核酸(然后所述细菌细胞被认为“清除”了所述核酸)和/或除去在步骤a)中使用所述遗传工具引入的向导rna或编码向导rna的序列的另外的步骤c)。[0110]在又一个特定实施方式中，所述方法在步骤b)或步骤c)后，包括在诱导抗crispr蛋白的表达的试剂存在下，引入第n例如第三、第四、第五等的核酸的一个或多个另外的步骤，所述核酸含有不同于已引入的修复模板的修复模板和允许所述不同的修复模板中包含的感兴趣的序列整合到细菌基因组的被靶向区域中的一个或多个向导rna表达盒，每个另外的步骤之后跟有将由此转化的细菌在不含所述用于诱导抗crispr蛋白的表达的试剂的培养基上进行培养，通常允许cas/grna核糖核蛋白复合体的表达的步骤。[0111]在根据本发明的方法的特定实施方式中，所述细菌使用例如上文描述的crispr工具或方法来转化，所述crispr工具或方法使用(例如编码)负责切割感兴趣的靶序列的至少一条链的酶，其中在特定实施方式中所述酶是核酸酶，优选为cas–型核酸酶，优选地选自cas9酶和mad7酶。优选地，所述感兴趣的靶序列是为所述细菌提供对一种或多种抗生素、优选为属于酰胺醇类的一种或多种抗生素的抗性的酶、通常为酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶的编码序列例如catb基因，控制所述编码序列的转录的序列，或在所述编码序列两侧的序列。[0112]适合用于本发明的cas9蛋白的实例包括但不限于来自于酿脓链球菌(参见申请wo2017/064439的seqidno：1和ncbi登记号wp_010922251.1)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、变形链球菌(streptococcusmutans)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、多杀巴氏杆菌(pasteurellamultocida)、新凶手弗朗西斯菌(francisellanovicida)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)、乳糖奈瑟氏菌(neisserialactamica)和嗜肺军团菌(legionellapneumophila)的cas9蛋白(参见fonfara等，2013；makarova等，2015)。[0113]也被称为“cas12”或“cpf1”的mad7核酸酶(其氨基酸序列对应于seqidno：72)，也可以通过与本领域技术人员已知的能够与此类核酸酶结合的grna的组合，有利地用于本发明的情形(参见garcia–doval等，2017和stellas.等，2017)。[0114]根据一个特定方面，所述编码mad7核酸酶的序列是被优化以容易地在梭菌属菌株中表达的序列，优选为序列seqidno：71。[0115]在使用时，所述crispr蛋白通常是“抗cas”蛋白，即能够抑制或阻止/中和cas的作用的蛋白，和/或能够抑制或阻止/中和crispr/cas系统、例如当所述核酸酶是cas9核酸酶时ii型crispr/cas系统的作用的蛋白。[0116]有利情况下，所述抗crispr蛋白是例如选自acriia1、acriia2、acriia3、acriia4、acriia5、acriic1、acriic2和acriic3的“抗cas9”蛋白(pawluk等，2018)。优选地，所述“抗cas9”蛋白是acriia2或acriia4。这种蛋白通常能够例如通过与所述cas9酶结合，非常显著地限制、理想情况下阻止cas9的作用。[0117]可以有利地使用的另一种抗crispr蛋白是“抗mad7”蛋白，例如acrva1蛋白(marino等，2018)。[0118]与所述被靶向dna部分(“被识别序列”)相似，所述编辑/修复模板自身可以包含对应于天然和/或合成的编码和/或非编码序列的一个或多个核酸序列或核酸序列部分。所述模板也可以包含一个或多个“外来”序列，即在属于梭菌属的细菌的基因组或所述属的特定菌种的基因组中天然不存在的序列。所述模板也可以包括序列的组合。[0119]在本发明中使用的遗传工具允许所述修复模板指导感兴趣的核酸并入到细菌基因组中，所述感兴趣的核酸通常是包含至少1个碱基对(bp)，优选地至少1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、1,000、10,000、100000或1000000bp，通常在1bp至20kb之间例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13kb，或在1bp至10kb之间，优选地在10bp至10kb之间或1kb至10kb之间，例如1bp至5kb之间、2kb至5kb之间或2.5或3kb至5kb之间的dna序列或序列的部分。[0120]在特定实施方式中，所述感兴趣的dna序列的表达允许所述梭菌属细菌发酵(通常同时地)几种不同的糖，例如至少两种不同的糖，通常为在包含5个碳原子的糖(例如葡萄糖或甘露糖)和/或包含6个碳原子的糖(例如木糖、阿拉伯糖或果糖)中的至少两种不同的糖，优选为至少三种不同的糖，例如选自葡萄糖、木糖和甘露糖；葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖；以及葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。[0121]在另一个特定实施方式中，所述感兴趣的dna序列编码至少一种感兴趣的产物，优选为促进梭菌属细菌的溶剂生产的产物，通常为至少一种感兴趣的蛋白，例如酶、膜蛋白例如转运蛋白、用于其他蛋白的成熟蛋白(伴侣蛋白)、转录因子或其组合。[0122]在另一个实施方式中，根据本发明所述的方法是基于ii类内含子的使用，并实施例如遗传技术/工具或遗传工具。[0123]所述技术依赖于使用可重编程的ii类内含子(基于乳酸乳球菌(lactococcuslactis)的ll.ltrb内含子)，其能够在所需基因座处快速整合细菌基因组(chen等，2005，wang等，2013)，目的通常是失活被靶向的基因。识别被编辑区域以及通过反向剪接插入到基因组中的机制一方面是基于所述内含子与所述区域之间的同源性，另一方面是基于蛋白质(ltra)的活性。[0124]技术是基于类似的方法，并补充了在内含子序列中添加选择标记物(heap等，2007)。这种标记物允许选择所述内含子在基因组中的整合，并因此便于获得所需突变体。这种遗传系统也利用i类内含子。事实上，所述选择标记物(被称为反转录转座活化的标记物或ram)被这种遗传元件中断，这阻止了选择标记物从所述质粒表达(所述系统的更精确的描述：zhong等)。这种遗传元件的剪接发生在整合到基因组中之前，产生具有活化形式的抗性基因的染色体。所述系统的优化版本包括在该基因上游和下游的flp/frt位点，允许使用frt重组酶移除所述抗性基因(heap等，2010)。[0125]在另一个实施方式中，根据本发明所述的方法是基于使用等位基因交换工具，并实施例如遗传技术/工具。[0126]技术是基于使用营养缺陷突变体(对于尿嘧啶营养缺陷来说，在丙酮丁醇梭菌atcc824中通过缺失pyre基因，这也引起对5‑氟乳清酸(a–5–fo)的抗性；heap等，2012)。所述系统使用专业技术人员公知的等位基因交换机制。在用假自杀(极低拷贝)载体转化后，后者通过第一次等位基因交换事件在细菌染色体中的整合通过最初存在于所述质粒上的抗性基因来选择。所述整合步骤可以以两种不同方式进行，即在pyre基因座内或在另一个基因座内：[0127]在pyre基因座处整合的情况下，所述pyre基因也被放置在所述质粒上，但不表达(没有有功能的启动子)。第二次重组恢复了有功能的pyre基因，并因此可以通过营养缺陷(不含尿嘧啶的最低培养基)来选择。由于无功能的pyre基因也具有可选择特点(对a–5–fo的敏感性)，因此可以在同一模型上发生其他整合，使pyre的状态在有功能与无功能之间依次轮换。[0128]在另一个基因座处整合的情况下，靶向允许反选择标记物在重组后表达的基因组区域(通常在另一个基因、优选为高表达基因之后的操纵子中)。然后通过营养缺陷(不含尿嘧啶的最低培养基)选择该第二次重组。[0129]在所描述的基于使用ii类内含子并实施遗传技术/工具或遗传工具或基于使用等位基因交换工具并实施例如遗传技术/工具的实施方式中，所述被靶向的序列优选为感兴趣的酶、优选为上文所解释的酰胺醇–o–乙酰转移酶的编码序列两侧的序列。[0130]本发明的另一个主题内容涉及利用本发明人在本文中描述的方法获得的转化和/或遗传修饰的细菌，通常为属于本发明人描述的物种或对应于本发明人描述的进化分枝之一的梭菌属细菌，及其任何衍生细菌、克隆、突变体或遗传修饰形式。[0131]由此转化和/或遗传修饰的本发明典型的细菌是不再表达为一种或多种抗生素提供抗性的酶的细菌，特别是不再表达酰胺醇–o–乙酰转移酶的细菌，例如在野生型中表达catb基因而由于本发明在被转化和/或遗传修饰后缺少所述catb基因或不能表达所述catb基因的细菌。所述利用本发明而被转化和/或遗传修饰的细菌被赋予对酰胺醇、例如对本文中描述的酰胺醇、特别是对氯霉素或甲砜霉素的敏感性。[0132]根据本发明的优选的遗传修饰的细菌的具体实例是在本说明书中被鉴定为拜氏梭菌dsm6423δcatb的细菌，其于2018年12月6日在比利时微生物协调保藏中心(belgianco–ordinatedcollectionsofmicro–organisms)(“bccm”，k.l.ledeganckstraat35,b–9000gent–belgium)登记在保藏号lmgp–31151下。本说明书还涉及保留了对酰胺醇例如甲砜霉素和/或氯霉素的敏感性的所述细菌的任何衍生细菌、克隆、突变体或遗传修饰形式。[0133]根据特定实施方式，所述根据本发明的不表达为一种或多种抗生素提供抗性的酶、特别是酰胺醇–o–乙酰转移酶例如氯霉素–o–乙酰转移酶的转化和/或遗传修饰的细菌例如拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌，仍然能够被转化并优选地被遗传修饰。这可以使用在本说明书中，例如在实验部分中描述的核酸例如质粒来进行。可以有利地使用的核酸的实例是序列seqidno：23的质粒pcas9acr(描述在本说明书的实验部分中)。[0134]事实上，本发明的一个特定方面涉及根据本发明所述的遗传修饰的细菌，优选为在编号lmgp–31151下保藏的拜氏梭菌dsm6423δcatb细菌或其遗传修饰的形式的用途，其例如使用本文中描述的遗传工具或方法之一，通过自主引入到其基因组中的感兴趣的核酸的表达，用于优选地在工业规模上生产一种或多种溶剂，优选至少异丙醇。[0135]本发明还涉及一种试剂盒，其包含：(i)根据本发明所述的感兴趣的核酸，通常为dna片段，其识别在梭菌属细菌、特别是本文中所描述的能够进行ibe发酵的细菌中感兴趣的酶的编码序列或控制所述编码序列的转录的序列；和(ii)至少一种工具，优选为几种工具，其选自用于转化并通常遗传修饰梭菌属细菌以便产生所述细菌的改进变体的遗传修饰工具的元件、作为grna的核酸、作为修复模板的核酸、至少一个引物对例如在本发明的情形中描述的引物对和允许所述工具编码的蛋白质例如cas9或mad7型核酸酶的表达的诱导物。[0136]所述用于转化并通常遗传修饰梭菌属细菌的遗传修饰工具可以选自例如上文所解释的crispr工具、基于ii类内含子的工具和等位基因交换工具。[0137]所述试剂盒还可以包含一种或多种诱导物，其为在所述遗传工具内任选使用的所选诱导型启动子定制，以控制所使用的核酸酶和/或一种或多种向导rna的表达。[0138]根据本发明所述的特定试剂盒允许表达包含标签的核酸酶。[0139]根据本发明所述的试剂盒还可以包含一种或多种消耗品，例如培养基、至少一种感受态梭菌属细菌(即被调制以用于转化)、至少一种grna、核酸酶、一种或多种选择分子或说明性资料。[0140]本说明书还涉及根据本发明所述的试剂盒或该试剂盒的一种或多种元件的用途，其用于实施本文中描述的梭菌属细菌的转化和理想情况下遗传修饰的方法，和/或用于使用梭菌属细菌、优选为天然产生异丙醇的梭菌属细菌，优选地在工业规模上生产溶剂或生物燃料或其混合物。[0141]可以生产的溶剂通常是丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇或其混合物，通常为乙醇/异丙醇、丁醇/异丙醇或乙醇/丁醇混合物，优选为异丙醇/丁醇混合物。[0142]根据本发明转化的细菌的使用通常允许在工业规模上每年生产至少100吨丙酮、至少100吨乙醇、至少1000吨异丙醇、至少1800吨丁醇或至少40000吨它们的混合物。[0143]下面的实施例和附图旨在更充分地说明本发明，但不限制其范围。附图说明[0144][图1]图1示出了来自于poehlein等，2017的30种产溶剂梭菌属菌株的分类。注意进化分枝拜氏梭菌nrrlb–593在文献中也被称为拜氏梭菌dsm6423。[0145][图2]图2示出了pcas9ind–δcatb质粒图谱。[0146][图3]图3示出了pcas9acr质粒图谱。[0147][图4]图4示出了pec750s–upphr质粒图谱。[0148][图5]图5示出了pex–a2–grna–upp质粒图谱。[0149][图6]图6示出了pec750s–δupp质粒图谱。[0150][图7]图7示出了pec750c–δupp质粒图谱。[0151][图8]图8示出了pgrna–pnf2图谱。[0152][图9]图9示出了在源自于拜氏梭菌菌株dsm6423的细菌转化的克隆中catb基因的pcr扩增。[0153]如果所述菌株仍具有catb基因，扩增产物约为1.5kb，或者如果该基因被缺失，则扩增产物约为900bp。[0154][图10]图10示出了拜氏梭菌菌株dsm6423wt和δcatb在2ytg培养基和2ytg甲砜霉素选择性培养基上的生长。[0155][图11]图11示出了在拜氏梭菌菌株dsm6423的含有pcas9acr和具有或不具有修复模板的靶向upp的grna表达质粒的转化体中crispr/cas9acr系统的诱导。图例说明：em，红霉素；tm，甲砜霉素；atc，无水四环素；nd，未稀释。[0156][图12a]图12示出了通过crispr/cas9系统进行的拜氏梭菌dsm6423的upp基因座的修饰。图12a代表了upp基因座的遗传架构：基因，grna靶位点和与基因组dna上的相应同源区相关的修复模板。也标出了用于pcr验证的引物杂交位点(rh010和rh011)。[0157][图12b]图12示出了通过crispr/cas9系统进行的拜氏梭菌dsm6423的upp基因座的修饰。图12b示出了使用引物rh010和rh011对upp基因座进行的扩增。在野生型基因的情况下预期扩增产物为1680bp，与此相比对于修饰的upp基因来说扩增产物为1090bp。m，100bp–3kb尺寸的标志物(lonza)；wt，野生型菌株。[0158][图13]图13示出了验证拜氏梭菌菌株6423δcatb中质粒pcas9ind.的存在的pcr扩增。[0159][图14]图14示出了在crispr–cas9系统在含有atc的培养基上诱导之前(阳性对照1和2)和诱导之后，验证天然质粒pnf2的存在或不存在的pcr扩增(≈900bp)。[0160][图15]图15示出了被改造以适应于梭菌属细菌的基于使用两种质粒的用于细菌修饰的遗传工具(参见wo2017/064439，wasels等，2017)。[0161][图16]图16示出了pcas9ind–grna_catb质粒图谱。[0162][图17]图17示出了作为遗传工具用于基因组编辑的crispr/cas9系统，其使用cas9核酸酶在基因组dna中产生一个或多个grna指导的双链切割。[0163]grna，向导rna；pam，前间区序列邻近基序。图从jinek等，2012修改。[0164][图18]图18示出了由cas9诱导的双链断裂的同源重组修复。pam，前间区序列邻近基序。[0165][图19]图19示出了crispr/cas9在梭菌属中的使用。[0166]ermb，红霉素抗性基因；catp(seqidno：70)，甲砜霉素/氯霉素抗性基因；tetr，该基因的表达产物阻遏从pcm–teto2/1、pcm–2teto1和pcm–teto2/1无水四环素“atc”诱导型启动子的转录(dong等，2012)；minipthl，组成型启动子(dong等，2012)。[0167][图20]图20示出了pcas9acr质粒图谱(seqidno：23)。[0168]ermb，红霉素抗性基因；rep，大肠埃希氏杆菌中的复制原点；reph，丙酮丁醇梭菌中的复制原点；tthl，硫解酶终止子；minipthl，组成型启动子(dong等，2012)；pcm–teto2/1，被tetr的产物阻遏并且可以被无水四环素“atc”诱导的启动子(dong等，2012)；pbgal，被lacr的产物阻遏并且可以被乳糖诱导的启动子(hartman等，2011)；acriia4，编码抗crispr蛋白acrii14的基因；bgar，该基因的表达产物阻遏从pbgal的转录。[0169][图21]图21示出了含有pcas9ind(seqidno：22)或pcas9acr(seqidno：23)的丙酮丁醇梭菌dsm792的相对转化率。频率被表示为在转化中使用的每μgdna获得的转化体的数目相对于pec750c(seqidno：106)的转化频率，并代表至少两个独立实验的平均值。[0170][图22]图22示出了在含有pcas9acr和具有(seqidno：79和seqidno：80)或不具有(seqidno：105)修复模板的靶向bdhb的grna表达质粒的dsm792菌株转化体中crispr/cas9系统的诱导。em，红霉素；tm，甲砜霉素；atc，无水四环素；nd，未稀释。[0171][图23a]图23示出了通过crispr/cas9系统进行的丙酮丁醇梭菌dsm792的bdh基因座的修饰。图23a示出了bdh基因座的遗传架构。修复模板与基因组dna之间的同源性用浅灰色平行四边形突出。也示出了引物v1和v2的杂交位点。[0172][图23b]图23示出了通过crispr/cas9系统进行的丙酮丁醇梭菌dsm792的bdh基因座的修饰。图23b示出了使用引物v1和v2进行的bdh基因座的扩增。m，2–log尺寸标志物(neb)；p，pgrna–δbdhaδbdhb质粒；wt，野生型菌株。[0173][图24]图24示出了20μgpcas9ind质粒在拜氏梭菌菌株dsm6423中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条表示三份生物学平行样的平均值的标准误差。[0174][图25]图25示出了nf3质粒图谱。[0175][图26]图26示出了pec751s质粒图谱。[0176][图27]图27示出了pnf3s质粒图谱。[0177][图28]图28示出了pnf3e质粒图谱。[0178][图29]图29示出了pnf3c质粒图谱。[0179][图30]图30示出了质粒pcas9ind在拜氏梭菌dsm6423的三种菌株中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条是两份生物学平行样的平均值的标准偏差。[0180][图31]图31示出了质粒pec750c在源自于拜氏梭菌dsm6423的两种菌株中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条是两份生物学平行样的平均值的标准偏差。[0181][图32]图32示出了质粒pec750c、pnf3c、pfw01和pnf3e在拜氏梭菌菌株ifp963δcatbδpnf2中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。误差条是三份生物学平行样的平均值的标准偏差。[0182][图33]图33示出了质粒pfw01、pnf3e和pnf3s在拜氏梭菌菌株ncimb8052中的转化效率(以每μg转化的dna观察到的菌落数为单位)。[0183]实施例[0184]实施例1[0185]材料和方法[0186]培养条件[0187]丙酮丁醇梭菌dsm792生长在2ytg培养基(胰蛋白胨16g.l–1，酵母提取物10g.l–1，葡萄糖5g.l–1，nacl4g.l–1)中。大肠埃希氏杆菌neb10b生长在lb培养基(胰蛋白胨10g.l–1，酵母提取物5g.l–1，nacl5g.l–1)中。固体培养基通过向液体培养基添加15g.l–1琼脂来制造。在需要时使用红霉素(在2ytg或lb培养基中浓度分别为40或500mg.l–1)、氯霉素(在固体或液体lb培养基中分别为25或12.5mg.l–1)和甲砜霉素(在2ytg培养基中15mg.l–1)。[0188]核酸的操作[0189]所有酶和试剂盒按照制造商的推荐使用。[0190]质粒的构建[0191]图20中示出的pcas9acr质粒(seqidno：23)通过将由eurofinsgenomics合成的含有在启动子pbgal控制之下的bgar和acriia4的片段(seqidno：81)克隆在pcas9ind载体的saci位点处来构建(wasels等，2017)。[0192]pgrnaind质粒(seqidno：82)通过将由eurofinsgenomics合成的在pcm–2teto1启动子控制之下的grna的表达盒(seqidno：83)(dong等，2012)克隆在pec750c载体(seqidno：106)的saci位点处来构建(wasels等，2017)。[0193]pgrna–xylb(seqidno：102)、pgrna–xylr(seqidno：103)、pgrna–glcg(seqidno：104)和pgrna–bdhb(seqidno：105)质粒通过将相应的引物对5′–tcatgatttctccatattagctag–3′和5′–aaacctagctaatatggagaaatc–3′、5′–tcatgttacacttggaacaggcgt–3′和5′–aaacacgcctgttccaagtgtaac–3′、5′–tcatttccggcagtaggatcccca–3′和5′–aaactggggatcctactgccggaa–3′、5′–tcatgcttattacgacataacaca–3′和5′–aaactgtgttatgtcgtaataagc–3′克隆在bsai消化的pgrnaind质粒(seqidno：82)中来构建。[0194]pgrna–δbdhb质粒(seqidno：79)通过将一方面使用引物5′–atgcatggatccaaacgaacccaaaaagaaagtttc–3′和5′–ggttgatttcaaatctgtgtaaacctaccg–3′，另一方面使用引物5′–acacagatttgaaatcaaccactttaaccc–3′和5′–atgcatgtcgactcttaagaacatgtataaagtatgg–3′获得的pcr产物通过重叠pcr组装而得到的dna片段克隆到用bamhi和saci消化的pgrna–bdhb载体中来构建。[0195]pgrna–δbdhaδbdhb质粒(seqidno：80)通过将一方面使用引物5′–atgcatggatccaaacgaacccaaaaagaaagtttc–3′和5′–gctaagttttaaatctgtgtaaacctaccg–3′，另一方面使用引物5′–acacagatttaaaacttagcatacttcttacc–3′和5′–atgcatgtcgaccttctaatctcctctactattttag–3′获得的pcr产物通过重叠pcr组装而得到的dna片段克隆到用bamhi和saci消化的pgrna–bdhb载体中来构建。[0196]转化[0197]丙酮丁醇梭菌dsm792按照由mermelstein等，1993描述的方案来转化。用含有grna表达盒的质粒转化的已含有cas9表达质粒(pcas9ind或pcas9acr)的丙酮丁醇梭菌dsm792转化体的选择在含有红霉素(40mg.l–1)、甲砜霉素(15mg.l–1)和乳糖(40nm)的固体2ytg培养基上进行。[0198]cas9表达的诱导[0199]cas9表达的诱导通过将得到的转化体在含有红霉素(40mg.l–1)、甲砜霉素(15mg.l–1)和cas9和grna表达诱导剂atc(1mg.l–1)的固体2ytg培养基上生长来进行。[0200]bdh基因座的扩增[0201]丙酮丁醇梭菌dsm792在bdha和bdhb基因座处的基因组编辑，通过使用高保真dna聚合酶(neb)和引物v1(5′–acacattgaagggagctttt–3′)和v2(5′–ggcaacaacatcaggccttt–3′)的pcr来控制。[0202]结果[0203]转化效率[0204]为了评估acriia4基因的插入对cas9表达质粒的转化效率的影响，将不同的grna表达质粒转化到含有pcas9ind(seqidno：22)或pcas9acr(seqidno：23)的dsm792菌株中，并在增补有乳糖的培养基上选择转化体。得到的转化效率呈现在图21中。[0205]δbdhb和δbdhaδbdhb突变体的产生[0206]将含有靶向bdhb的grna表达盒的靶向质粒(pgrna–bdhb–seqidno：105)以及含有允许单独缺失bdhb基因(pgrna–δbdhb–seqidno：79)或bdha和bdhb两个基因(pgrna–δbdhaδbdhb–seqidno：80)的修复模板的两种衍生质粒转化到含有pcas9ind(seqidno：22)或pcas9acr(seqidno：23)的dsm792菌株中。得到的转化效率呈现在表2中：[0207][表2][0208][0209]靶向bdhb的质粒对含有pcas9ind或pcas9acr的菌株dsm792的转化频率。频率被表示为在转化中使用的每μgdna得到的转化体的数目，并代表至少两个独立实验的平均值。[0210]所述得到的转化体通过在增补有无水四环素atc的培养基上传代，经历crispr/cas9系统表达的诱导阶段(图22)。[0211]所需变化通过对来自于两个atc抗性菌落的基因组dna进行pcr得以确认(图23)。[0212]结论[0213]在wasels等(2017)中描述的基于crispr/cas9的遗传工具使用两个质粒：[0214]–第一质粒pcas9ind含有在atc诱导型启动子控制之下的cas9，和[0215]–源自于pec750c的第二质粒含有grna表达盒(在第二个atc诱导型启动子的控制之下)和编辑模板，以修复由所述系统诱导的双链断裂。[0216]然而，本发明人观察到某些grna仍显得毒性过高，尽管它们的表达以及cas9的表达已使用atc诱导型启动子进行控制，因此限制了通过所述遗传工具进行细菌转化和因此染色体修饰的效率。[0217]为了改进这种遗传工具，通过插入在乳糖诱导型启动子控制之下的抗crispr基因acriia4，对cas9表达质粒进行修饰。由此显著提高了不同grna表达质粒的转化效率，允许获得所有测试的质粒的转化体。[0218]也可以使用不能被引入到含有pcas9ind的dsm792菌株中的质粒，对丙酮丁醇梭菌dsm792基因组内的bdhb基因座进行编辑。观察到的修饰效率与以前观察到的(wasels等，2017)相同，其中100％的测试的菌落被修饰。[0219]总而言之，cas9表达质粒的修饰允许更好地控制cas9–grna核糖核蛋白复合体，有利地便于获得其中cas9的作用可以被触发的转化体，以便获得感兴趣的突变体。[0220]实施例2[0221]材料和方法[0222]培养条件[0223]拜氏梭菌dsm6423生长在2ytg培养基(胰蛋白胨16g.l–1，酵母提取物10g.l–1，葡萄糖5g.l–1，nacl4g.l–1)中。大肠埃希氏杆菌neb10–β和inv110生长在lb培养基(胰蛋白胨10g.l–1，酵母提取物5g.l–1，nacl5g.l–1)中。固体培养基通过向液体培养基添加15g.l–1琼脂来制造。在需要时使用红霉素(在2ytg或lb培养基中浓度分别为20或500mg.l–1)、氯霉素(在固体或液体lb培养基中分别为25或12.5mg.l–1)和甲砜霉素(在2ytg培养基中15mg.l–1)或壮观霉素(在lb或2ytg培养基中浓度分别为100或650mg.l–1)。[0224]核酸和质粒载体[0225]所有酶和试剂盒按照制造商的推荐使用。[0226]菌落pcr试验遵照下述方案：[0227]将拜氏梭菌dsm6423的分离的菌落重悬浮在100μl10mmtrisph7.5，5mmedta中。将该溶液在不搅拌的情况下在98℃加热10min。然后将0.5μl该细菌裂解液作为pcr模板，用于使用phire(thermoscientific)、phusion(thermoscientific)、q5(neb)或kapa2grobust(sigma–aldrich)聚合酶的10μl反应中。[0228]下面详述了在所有构建物中使用的引物的名单(名称/dna序列)：[0229]δcatb_fwd：tgttatggattataagcggctcgaggacgtcaaaccatgttaatcattgc[0230]δcatb_rev：aatctatcactgatagggactcgagcaatttcaccaaagaattcgctagc[0231]δcatb_grna_rev：aatctatcactgatagggactcgaggggcaaaagtgtaaagacaagcttc[0232]rh076：catataataaaaggaaacctcttgatcg[0233]rh077：attgccagcctaacacttgg[0234]rh001：atctccatggacgcgtgacgtcgacataaggtaccaggaattagagcagc[0235]rh002：tctatctccagctctagaccattattattcctccaagtttgct[0236]rh003：ataatggtctagagctggagatagattatttggtactaag[0237]rh004：tatgaccatgattacgaattcgagctcgaagcgcttattattgcattagc[0238]pex–fwd：cagattgtactgagagtgcacc[0239]pex–rev：gtgagcggataacaatttcacac[0240]pec750c–fwd：caatattccacaatattatattataagctagc[0241]m13–rev：caggaaacagctatgac[0242]rh010：cggatattgcattaccagtagc[0243]rh011：ttatcaatctcttacacatggagc[0244]rh025：tagtatgccgccattattacgaca[0245]rh134：gtcgacgtggaattgtgagc[0246]pnf2_fwd：gggcgcacttatacaccacc[0247]pnf2_rev：tgctacgcaccccctaaagg[0248]rh021：acttgggtcgaccacgataaaacaaggttttaagg[0249]rh022：taccagggatccgtattaatgtaactatgatatcaattcttg[0250]aad9–fwd2：atgcatggtcccaatgaataggtttacacttactttagttttatgg[0251]aad9–rev：atgcgagttaacaacttctaaaatctgattaccaattagrh031：atgcatggatcccaatgaataggtttacacttactttagttttatgg[0252]rh032：atgcgagagctcaacttctaaaatctgattaccaattag[0253]rh138：atgcatggatccgtctgacagttaccaggtcc[0254]rh139：atgcgagagctccaattgttcaaaaaaataatggcggag[0255]rh140：atgcatggatcccggcagtttttctttttcgg[0256]rh141：atgcgagagctcggttaaatactagtttttagttacagac[0257]制备了下述9种质粒载体：[0258]–1号质粒：pex–a258–δcatb(seqidno：17)[0259]它含有被克隆到质粒pex–a258中的合成的dna片段δcatb。该δcatb片段包含i)在无水四环素诱导型启动子控制之下的靶向拜氏梭菌dsm6423的catb基因(编码氯霉素–o–乙酰转移酶的氯霉素抗性基因–seqidno：18)的向导rna表达盒(表达盒：seqidno：19)，和ii)包含位于catb基因的上游和下游的400个同源bp的编辑模板(seqidno：20)。[0260]–2号质粒：pcas9ind–δcatb(参见图2和seqidno：21)[0261]它含有通过pcr扩增(引物δcatb_fwd和δcatb_rev)并在用xhoi限制性酶消化各个dna后克隆到pcas9ind(描述在专利申请wo2017/064439中–seqidno：22)中的δcatb片段。[0262]–3号质粒：pcas9acr(参见图3和seqidno：23)[0263]–4号质粒：pec750s–upphr(参见图4和seqidno：24)[0264]它含有用于缺失upp基因并由在upp基因上游和下游的两个同源dna片段(尺寸分别为：500(seqidno：26)个和377(seqidno：27)个碱基对)构成的修复模板(seqidno：25)。所述组装体使用gibson克隆系统(newenglandbiolabs，gibson组装主混合物2x)来获得。为此目的，使用相应的引物rh001/rh002和rh003/rh004，从菌株dsm6423的基因组dna(参见matédegerando等，2018和登记号prjeb11626(https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/prjeb11626))通过pcr来扩增所述上游和下游部分。然后将这两个片段组装到之前通过限制性酶(sali和saci限制性酶)线性化的pec750s中。[0265]–5号质粒：pex–a2–grna–upp(参见图5和seqidno：28)[0266]这个质粒包含grna–uppdna片段，其对应于插入到名为pex–a2的复制质粒中的在组成型启动子(序列seqidno：30的非编码rna)控制之下的靶向upp基因的向导rna(靶向upp的前间区序列(seqidno：31))的表达盒(seqidno：29)。[0267]–6号质粒：pec750s–δupp(参见图6和seqidno：32)[0268]它具有质粒pec750s–upphr(seqidno：24)作为基础，并另外含有包含在组成型启动子控制之下的靶向upp基因的向导rna表达盒的dna片段。[0269]将这个片段插入到pex–a2中，被命名为pex–a2–grna–upp。然后将所述插入片段用引物pex–fwd和pex–rev通过pcr进行扩增，并用限制性酶xhoi和ncoi消化。最后，通过连接到先前用相同的限制性酶消化的pec750s–upphr中将该片段进行克隆，以获得pec750s–δupp。[0270]–7号质粒：pec750c–δupp(参见图7和seqidno：33)[0271]然后用引物pec750c–fwd和m13–rev扩增含有所述向导rna以及修复模板的表达盒。将所述扩增子用限制性酶xhoi和saci消化，然后通过酶法连接到pec750c中进行克隆，以获得pec750c–δupp。[0272]–8号质粒：pgrna–pnf2(参见图8和seqidno：34)[0273]该质粒具有pec750c作为其基础，并含有靶向pnf2质粒的向导rna表达盒(seqidno：118)。[0274]–9号质粒：pcas9ind–grna_catb(参见图16和seqidno：38)[0275]它含有通过pcr扩增(引物δcatb_fwd和δcatb_grna_rev)的靶向catb基因座的向导rna的编码序列，并将所述编码序列在用限制性酶xhoi消化各个dna并连接后克隆到pcas9ind(描述在专利申请wo2017/064439中)中。[0276]–10号质粒：pnf3(参见图25和seqidno：119)[0277]它含有使用引物rh021和rh022扩增的pnf2的一部分，具体来说包括复制原点和编码质粒复制蛋白(cibe_p20001)的基因。然后将该pcr产物在sali和bamhi限制性位点处克隆到质粒puc19(seqidno：117)中。[0278]–11号质粒：pec751s(参见图26和seqidno：121)[0279]它含有pec750c(seqidno：106)的除了catp氯霉素抗性基因(seqidno：70)之外的所有元件。后者被提供壮观霉素抗性的粪肠球菌(enterococcusfaecalis)aad9基因(seqidno：130)代替。这个元件使用引物aad9–fwd2和aad9–rev从质粒pmtl007s–e1(seqidno：120)扩增，并克隆到pec750c的avaii和hpai位点中代替catp基因(seqidno：70)。[0280]–12号质粒：pnf3s(参见图27和seqidno：123)[0281]它含有pnf3的所有元件，并在bamhi与saci位点之间插入aad9基因(使用引物rh031和rh032从pec751s扩增)。[0282]–13号质粒：pnf3e(参见图28和seqidno：124)[0283]它含有pnf3的所有元件，并插入在minipthl启动子控制之下的艰难梭菌ermb基因(seqidno：131)。该元件使用引物rh138和rh139从pfw01扩增，并克隆在pnf3e的bamhi与saci位点之间。[0284]–14号质粒：pnf3c(参见图29和seqidno：125)[0285]它含有pnf3的所有元件并插入有产气荚膜梭菌catp基因(seqidno：70)。该元件使用引物rh140和rh141从pec750c扩增并克隆在pnf3e的bamhi与saci位点之间。[0286]结果1[0287]拜氏梭菌菌株dsm6423的转化[0288]将质粒引入到大肠埃希氏杆菌dam–dcm–菌株(inv110，invitrogen)中并复制。这允许除去pcas9ind–δcatb质粒上的dam–和dcm–型甲基化，然后按照mermelstein等(1993)描述的方案将其通过转化引入到菌株dsm6423中，并对所述方案做出了下述修改：将菌株在od600为0.8时用更大量的质粒(20μg)并使用下述电穿孔参数进行转化：100ω，25μf，1400v。铺展在含有红霉素(20μg/ml)的皮氏培养皿上，由此得到含有pcas9ind–δcatb质粒的拜氏梭菌dsm6423转化体。[0289]cas9表达的诱导和获得拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb[0290]然后将几个红霉素抗性菌落转移到100μl培养基(2ytg)中，并在培养基中连续稀释到104的稀释倍数。对于每个菌落，将8μl每种稀释液置于含有红霉素和无水四环素(200ng/ml)的皮氏培养皿上，以诱导cas9核酸酶基因的表达。[0291]在提取基因组dna后，在该平板上生长的克隆中catb基因的缺失通过pcr，使用引物rh076和rh077来验证(参见图9)。[0292]拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb对甲砜霉素的敏感性的验证[0293]为了确保catb基因的缺失提供对甲砜霉素的新的敏感性，在琼脂培养基上进行了比较分析。拜氏梭菌dsm6423和拜氏梭菌dsm6423δcatb的预培养物生长在2ytg培养基上，然后将100μl这些预培养物在增补有浓度为15mg/l的甲砜霉素或不含甲砜霉素的2ytg琼脂培养基上铺板。图10显示只有初始的拜氏梭菌dsm6423菌株能够在增补甲砜霉素的培养基上生长。[0294]在拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb中通过crispr–cas9工具缺失upp基因[0295]将拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb的一个克隆预先用在dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序处不表现出甲基化的pcas9acr载体(从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备)转化。维持在拜氏梭菌菌株dsm6423中的质粒pcas9acr的存在，通过使用引物rh025和rh134的菌落pcr来验证。[0296]然后将红霉素抗性克隆用先前去甲基化的pec750c–δupp转化。将得到的菌落在含有红霉素(20μg/ml)、甲砜霉素(15μg/ml)和乳糖(40mm)的培养基上选择。[0297]然后将这些克隆中的几个重悬浮在100μl培养基(2ytg)中，并在培养基中连续稀释(至104的稀释倍数)。将5μl每种稀释液置于含有红霉素、甲砜霉素和无水四环素(200ng/ml)的皮氏培养皿上(参见图11)。[0298]对于每个克隆来说，使用被设计用于扩增upp基因座的引物，通过菌落pcr测试两个atc抗性菌落(参见图12)。[0299]在拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb中通过crispr–cas9工具缺失天然质粒pnf2[0300]将拜氏梭菌菌株dsm6423δcatb的一个克隆预先用在dam–和dcm–型甲基转移酶识别的基序处不表现出甲基化的pcas9ind载体(从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备)转化。拜氏梭菌菌株dsm6423中质粒pcas9ind的存在，使用引物pcas9ind_fwd(seqidno：42)和pcas9ind_rev(seqidno：43)通过pcr来验证(参见图13)。[0301]然后将红霉素抗性克隆用于转化从具有dam–dcm–基因型的大肠埃希氏杆菌细菌制备的pgrna–pnf2。[0302]将在含有红霉素(20μg/ml)和甲砜霉素(15μg/ml)的培养基上获得的几个克隆重悬浮在培养基中并连续稀释至104的稀释倍数。将8μl每种稀释液置于含有红霉素、甲砜霉素和无水四环素(200ng/ml)的皮氏培养皿上，以诱导crispr/cas9表达。[0303]天然质粒pnf2的不存在使用引物pnf2_fwd(seqidno：39)和pnf2_rev(seqidno：40)，通过pcr来验证(参见图14)。[0304]结论[0305]在本工作的过程中，本发明人成功地在拜氏梭菌菌株dsm6423中引入并维持了不同的质粒。他们成功地在使用单个质粒的基础上使用crispr–cas9工具缺失了catb基因。得到的重组菌株对甲砜霉素的敏感性通过琼脂试验得以确认。[0306]这种缺失允许他们使用在专利申请fr1854835中描述的需要两个质粒的crispr–cas9工具。进行了演示本技术的重要性的两个实例：upp基因的缺失和对拜氏梭菌菌株dsm6423来说非必需的天然质粒的移除。[0307]结果2[0308]拜氏梭菌菌株的转化[0309]在大肠埃希氏杆菌菌株neb10–β中制备的质粒也被用于转化拜氏梭菌菌株ncimb8052。相反，对于拜氏梭菌dsm6423来说，将质粒预先引入到大肠埃希氏杆菌dam–dcm–菌株(inv110，invitrogen)中并复制。这允许在将感兴趣的质粒通过转化引入到菌株dsm6423中之前移除所述质粒上的dam–和dcm–型甲基化。[0310]对于每种菌株来说转化类似地进行，即按照mermelstein等，1992描述的方案并进行了下述修改：将菌株在od600为0.6–0.8时用更大量的质粒(5–20μg)转化，并且电穿孔参数为100ω、25μf、1400v。在2ytg中再生3h后，将细菌在含有所需抗生素(红霉素：20–40μg/ml；甲砜霉素：15μg/ml；壮观霉素：650μg/ml)的皮氏培养皿(2ytg琼脂)上铺板。[0311]拜氏梭菌dsm6423菌株的转化效率的比较[0312]转化在下述拜氏梭菌菌株中以两份生物平行样进行：dsm6423野生型，dsm6423δcatb和dsm6423δcatbδpnf2(图30)。为此使用了pcas9ind载体，所述载体由于不允许良好的转化效率而尤其难以用于修饰细菌。它还含有提供红霉素抗性的基因，所有三种菌株都对红霉素敏感。[0313]结果表明转化效率提高约15‑20倍，这可归因于天然质粒pnf2的丧失。[0314]也测试了提供甲砜霉素抗性的质粒pec750c的转化效率，但仅仅在dsm6423δcatb(ifp962δcatb)和dsm6423δcatbδpnf2(ifp963δcatbδpnf2)菌株中，因为野生型菌株对这种抗生素有抗性(图31)。对于这个质粒来说，转化效率的提高甚至更加显著(提高约2000倍)。[0315]pnf3质粒与其他质粒的转化效率的比较[0316]为了确定含有天然质粒pnf2的复制原点的质粒的转化效率，将质粒pnf3e和pnf3c引入到拜氏梭菌菌株dsm6423δcatbδpnf2中。含有红霉素或氯霉素抗性基因的载体的使用允许在抗性基因的本性的基础上比较载体的转化效率。也转化了质粒pfw01和pec750c。这两种质粒含有针对不同抗生素(分别为红霉素和甲砜霉素)的抗性基因，并且常用于转化拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌。[0317]正如在图32中所示，基于pnf3的载体显示出出色的转化效率，并且特别地可用于拜氏梭菌dsm6423δcatbδpnf2。具体来说，pnf3e(其含有红霉素抗性基因)与包含相同抗性基因的pfw01相比显示出明显更高的转化效率。该同一种质粒不能被引入到野生型拜氏梭菌dsm6423菌株中(在两份生物平行样中使用5μg转化质粒获得0个菌落)，证实了存在天然质粒pnf2的影响。[0318]pnf3质粒在其他菌株/菌种中的可转化性的验证[0319]为了说明在其他产溶剂梭菌属菌株中使用这种新质粒的可能性，本发明人在abe菌株拜氏梭菌ncimb8052中进行了质粒pfw01、pnf3e和pnf3s的转化效率的比较性分析(图33)。由于ncimb8052菌株天然对甲砜霉素具有抗性，因此使用提供壮观霉素抗性的pnf3s代替pnf3c。[0320]结果证实了ncimb8052菌株可以用基于pnf3的质粒转化，证明了这些载体适用于广泛意义上的拜氏梭菌菌种。[0321]也在来自于丙酮丁醇梭菌的参比菌株dsm792中测试了所述基于pnf3的合成载体套装的适用性。转化测定法显示了用pnf3c质粒转化这种菌株的可能性(转化效率为每μg转化的dna观察到3个菌落，相比于pec750c质粒的120个菌落/μg)。[0322]pnf3质粒与申请fr18/73492中描述的遗传工具的相容性的验证[0323]专利申请fr18/73492描述了δcatb菌株以及需要使用红霉素抗性基因和甲砜霉素抗性基因的双质粒crispr/cas9系统的用途。为了证实所述新的pnf3质粒套装的价值，将pnf3c载体转化到已含有pcas9acr质粒的δcatb菌株中。所述在两份平行样中进行的转化显示出转化效率为0.625±0.125个菌落/μgdna(平均值±标准误差)，证实了在δcatb菌株中基于pnf3c的载体可以与pcas9acr相组合使用。[0324]与这些结果相平行，所述pnf2质粒的包括其复制原点(seqidno：118)的部分可以成功地重新用于产生新的穿梭载体套装(seqidno：119、123、124和125)，它们可以被任意修饰，以特别是允许它们在大肠埃希氏杆菌菌株中的复制以及它们在拜氏梭菌dsm6423中的重新引入。这些新的载体表现出有利的转化效率，以在例如拜氏梭菌dsm6423及其衍生株中进行基因编辑，特别是使用包含两种不同核酸的crispr/cas9工具进行基因编辑。[0325]这些新的载体也已成功地在另一株拜氏梭菌(ncimb8052)和梭菌属菌种(特别是丙酮丁醇梭菌)中试验，证实了它们在厚壁菌门的其他生物体中的适用性。也在芽孢杆菌属中进行了试验。[0326]结论[0327]这些结果证实，天然质粒pnf2的缺失显著提高了含有它的细菌的转化效率(对于pfw01来说提高约15倍，对于pec750c来说提高约2000倍)。在已知难以转化的梭菌属细菌的情况下，特别是对于天然受制于低转化效率(低于5个菌落/μg质粒)的菌株拜氏梭菌dsm6423来说，这个结果是特别令人感兴趣的。[0328]参考文献[0329]–banerjee,a.,leang,c.,ueki,t.,nevin,k.p.,&lovley,d.r.(2014)，用于扬氏梭菌的代谢工程的乳糖诱导型系统(lactose–induciblesystemformetabolicengineeringofclostridiumljungdahlii)，appliedandenvironmentalmicrobiology,80(8),2410–2416.[0330]–chenj.–s.,hius.f.(1986)，通过拜氏梭菌(同义词，丁醇梭菌)生产丙酮–丁醇–异丙醇(acetone–butanol–isopropanolproductionbyclostridiumbeijerinckii(synonym,clostridiumbutylicum))，biotechnol.lett.8:371–376.[0331]–cui,l.,&bikard,d.(2016)，大肠埃希氏杆菌染色体中cas9切割的后果(consequencesofcas9cleavageinthechromosomeofescherichiacoli)，nucleicacidsresearch,44(9),4243–4251.[0332]–currie,d.h.,herring,c.d.,guss,a.m.,olson,d.g.,hogsett,d.a.,&lynd,l.r.(2013)，来自于热纤维梭菌的工程化全长cipa在解糖嗜热厌氧杆菌中的功能性异源表达(functionalheterologousexpressionofanengineeredfulllengthcipafromclostridiumthermocelluminthermoanaerobacteriumsaccharolyticum)，biotechnologyforbiofuels,6(1),32.[0333]–dicarlo,j.e.,norville,j.e.,mali,p.,rios,x.,aach,j.,&church,g.m.(2013)，酿酒酵母中使用crispr–cas系统的基因组工程(genomeengineeringinsaccharomycescerevisiaeusingcrispr–cassystems)，nucleicacidsresearch,41(7),4336–4343.[0334]–dong,h.,tao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