一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法。
背景技术：
2.心血管疾病(cvd)是全球慢性非传染性疾病的主要致死原因之一，严重威胁人类健康，造成沉重的社会负担。高血压是一种常见的心血管疾病，是导致心力衰竭的主要危险因素。它可引起ras(肾素
‑
血管紧张素系统)激活，被认为是促进心肌纤维化(mf)的主要原因，是多种心血管疾病发展到终末期的必然过程。心肌纤维化与心律失常、心功能不全甚至心源性猝死密切相关，被认为是心血管疾病发生和死亡的独立危险因素。靶向干预或逆转高血压引起的心肌纤维化是缓解心肌纤维化病理过程的重要组成部分。
3.c
‑
ski(sloan
‑
kettering研究所原癌基因)是tgf
‑
β1/smad信号的转录抑制因子。c
‑
ski通过与smads结合，可以负性调节tgf
‑
β/smad信号通路传导，参与创面愈合、代谢性疾病、器官纤维化等疾病中成纤维细胞的发育和分化。在心血管疾病模型中，c
‑
ski在心肌纤维形成中发挥关键作用，过表达c
‑
ski可降低肌成纤维细胞胶原的合成、分泌和收缩，诱导心肌成纤维细胞凋亡，降低细胞活力，c
‑
ski还可通过上调同源盒基因(meox2)的表达来抑制锌脂蛋白2(zeb2)的功能，从而降低tgf
‑
β1诱导的肌成纤维细胞的表达，抑制心肌纤维化。表明c
‑
ski可能是一种很有前途的改善人冠状动脉内皮细胞(hcaec)内皮
‑
间充质转化(end
‑
mt)和预防或逆转高血压引起的心肌纤维化的药物。
4.mirna是一种新发现的非编码小分子单链rna，它有助于转录后调控基因表达，在心肌纤维化的各种生理和病理过程中发挥着广泛的作用。mir
‑
21在心肌成纤维细胞中特异性高表达，mir
‑
21通过抑制tgf
‑
β受体iii的表达，促进心肌梗死后心肌纤维化的发生发展；mir
‑
29b直接作用于多种胶原、基质金属蛋白酶等，从而抑制心脏成纤维细胞分泌胶原。研究还发现他汀类药物可改善充血性心力衰竭心脏心肌纤维化，其机制涉及mir
‑
208a表达的部分降低。广泛的mirna功能启发了研究人员研究mirna在心肌纤维化或end
‑
mt转化中的表达谱。识别能够靶向c
‑
ski的解除调控的mirnas可能为心肌纤维化治疗提供新的策略。
5.目前，tgf
‑
β与end
‑
mt的对应关系以及c
‑
ski负向调节tgf
‑
β/smad信号通路已被证实，但是具体有哪些c
‑
ski的靶向调控因子参与tgf
‑
β1/smad信号通路并调控end
‑
mt进程还需要进行研究及验证。
技术实现要素：
6.为了克服以上缺陷，本发明提供了一种周期短，操作可行性较高的研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，为心肌纤维化治疗提供新的策略。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，其特征在于：包
括以下步骤：
9.(1)c
‑
ski基因靶向mirna预测；
10.(2)最佳mirna筛选；
11.(3)验证mirna通过c
‑
ski在tgf
‑
β诱导hcaec细胞end
‑
mt转化过程中的作用；
12.(4)体内实验验证mirna在高血压致心肌纤维化过程中的影响；
13.所述步骤(3)或(4)无时间顺序上的限定。
14.进一步的，步骤(1)具体为：通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测能够靶向结合c
‑
ski的3＇
‑
utr的mirna，再结合文献报道能够被tgfβ上调表达的mirna，筛选出潜在的7个目的mirna，分别为：mir
‑
21
‑
5p，mir
‑
155
‑
5p，mir
‑
367
‑
3p，mir
‑
497
‑
5p，mir
‑
15a
‑
5p，mir
‑
195
‑
5p，mir
‑
221
‑
5p。
15.进一步的，步骤(2)具体为：
16.(a1)分别构建7个mirna的模拟物，转染hcaec细胞；48h后收集细胞，q
‑
pcr分别检测各组中目的mirna及c
‑
ski的情况；
17.(a2)突变抑制活性最佳的mirna靶向c
‑
ski的靶位点，进行进一步双荧光素酶报告系统分析。
18.进一步的，步骤(3)具体为：
19.(b1)以人冠脉内皮细胞(hcaec)为研究对象，以tgf
‑
β刺激建立内皮
‑
间充质(end
‑
mt)转化的模型；
20.(b2)hcaec复苏后，用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至80％融合时按1﹕2传代，约每3天传代1次。将处于对数生长期的hcaec改用无血清的dmem/f12培养基继续培养24h后随机分组进行后续实验。细胞分组同上，继续48h后，收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况；
21.(b3)构建c
‑
ski过表达和mirna过表达、敲低慢病毒侵染hcaec细胞，分别设计5组进行实验：c
‑
ski过表达慢病毒组：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec c
‑
ski过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) c
‑
ski过表达慢病毒 mirna过表达慢病毒，e:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) c
‑
ski过表达慢病毒 mirna敲低慢病毒；mirna过表达、敲低慢病毒组：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec mirna过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna过表达慢病毒，e:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna敲低慢病毒。48h后收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况，同时检测end
‑
mt转化标志物vimentin、cd31、相关转录因子twist、slug及snail蛋白和mrna的表达情况；
22.进一步的，步骤(4)具体为：
23.(c1)将含有ang ii的渗透压微泵皮下植入8周龄雄性c57小鼠慢性持续(1.4mg/kg/day)给药，4周后评价心肌肥厚；
24.(c2)第15日，将模型组进一步随机分为三组：慢病毒过表达组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
ski慢病毒，滴度为1
×
108tu)，慢病毒对照组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
nc慢病毒，滴度为1
×
108tu)；模型组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul生理盐水)，western blot检测各组织中tgfβ1、alk5(tgfβ1ⅰ型受体)、tgfbr2(tgfβ1ⅱ型受体)、smad2/3，p
‑
smad2，p
‑
smad3的磷酸化蛋白与总蛋白水平。
25.进一步的，步骤(a2)所述进行进一步双荧光素酶报告系统分析的方法，包括以下步骤：
26.(d1)通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski的3＇
‑
utr的结合位点；
27.(d2)通过ncbi查找到相对应的序列信息，选择结合位点前后300bp序列构建c
‑
ski3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒，并构建c
‑
ski 3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒突变体；
28.(d3)用双荧光素酶检测试剂盒处理细胞，并用多功能酶标仪检测每组细胞的海肾和萤火虫荧光强度，计算各组的相对表达情况.
29.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
30.本发明提供了一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，首先通过文献检索和生物信息学预测出潜在的调控通路(tgf
‑
β/mirna/c
‑
ski通路)，然后通过人冠状动脉内皮细胞建立end
‑
mt模型以及高血压心肌纤维化动物模型，探究tgf
‑
β/mir
‑
155/c
‑
ski通路调控end
‑
mt的具体分子机制，利用本发明提供的方法筛选得到了靶向c
‑
ski调控tgf
‑
β/smad信号通路参与end
‑
mt的关键性靶基因mirna
‑
155。
31.本发明所述方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，且可重复性强，在普通实验室就可完成，且该方法为心肌纤维化的防治提供新的思路和模式，为其治疗的新途径提供理论基础，本发明提供的方法还可用于其他哺乳动物，应用广泛。
具体实施方式
32.为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
33.实施例
34.一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，包括以下步骤：
35.第一步：内皮
‑
间充质转化细胞模型的建立及c
‑
ski的作用机制：
36.1、构建tgfβ诱导人冠状动脉内皮细胞(hcaec)end
‑
mt转化模型；
37.以人冠脉内皮细胞为研究对象，以tgf
‑
β刺激建立内皮
‑
间充质转化的模型。分别给予不同浓度tgf
‑
β(0，1，2.5，5ng/ml)刺激冠脉内皮细胞，后分别于37℃、5％co2培养箱内培养，后检测内皮
‑
间充质的标志物鉴定细胞类型，筛选出最佳刺激浓度，成功建立end
‑
mt转化模型。
38.2、c
‑
ski在tgf
‑
β诱导hcaec细胞end
‑
mt转化过程中的作用分析；
39.(1)检测hcaec细胞end
‑
mt转化过程中c
‑
ski的表达情况
40.hcaec复苏后，用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至80％融合时按1﹕2传代，约每3天传代1次。将处于对数生长期的hcaec改用无血清的dmem/f12培养基继续培养24h后随机分组进行后续实验。细胞分组同上，继续48h后，收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况。
41.(2)lv
‑
c
‑
ski慢病毒包装
42.a1：c
‑
ski慢病毒过表达质粒构建：(长沙讴睿生物技术有限公司合成c
‑
ski基因全序列)，通过酶切连接的方法将其构建到慢病毒过表达载体plvx
‑
ires
‑
puro获得重组质粒plvx
‑
ires
‑
puro
‑
c
‑
ski。
43.a2：c
‑
ski慢病毒包装：用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的293ft细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.0*107个细胞重新接种于10cm细胞培养皿内，37℃，5％co2培养箱内培养，待细胞汇合度达90％时即可用于转染。转染前2小时，更换新鲜培养基。按照10ug，plvx
‑
ires
‑
puro
‑
c
‑
ski 15ul慢病毒包装mix质粒加入到500ul opti
‑
mem内混匀，另外取35ul lip2000加入到500ul opti
‑
mem内混匀，两者迅速混合，混匀，室温静止15分钟。逐滴加入到培养皿内，充分混匀。12小时后更换不含双抗的含2％fbs的病毒收获培养基。
44.a3：c
‑
ski慢病毒包装浓缩：收获病毒培养基到离心管内，冰上预冷。1500g，4度，离心30分钟。用0.45um滤器过滤病毒上清液。过滤后，按照3：1的比例加入4x病毒浓缩液。4度静置过夜后，1500g，4度，离心45分钟。离心后去掉上清，加入500ul无血清培养基重悬病毒聚集团块。
45.a4：c
‑
ski慢病毒滴度测定：取10ul浓缩病毒lv
‑
ski加入到90ul稀释液中，此为第一稀释度，从第一稀释度中取10ul加入到90ul稀释液中，此为第二稀释度，逐级稀释，共取8个稀释度。取90ul稀释病毒液加入96孔板感染293a细胞，感染2天后，加入嘌呤霉素筛选细胞(被病毒感染了的细胞有嘌呤霉素抗性，嘌呤霉素筛选过后还存活的细胞即被病毒感染)4天后拍照并计数存活的细胞。
46.(3)c
‑
ski对end
‑
mt转化过程中标志蛋白表达的影响及作用机制研究
47.在之前成功建立模型的基础上，在hcaec细胞中过表达c
‑
ski，对end
‑
mt转化过程中标志蛋白表达的影响。细胞分组为：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec c
‑
ski过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) c
‑
ski过表达慢病毒。48h后收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况，同时检测内皮
‑
间质转化标志物vimentin、cd31、相关转录因子twist、slug及snail蛋白和mrna的表达情况。
48.3、阐明c
‑
ski对tgfβ/smad信号通路的影响
49.采用western blot方法，检测各组(n＝10/组)心肌细胞中tgfβ1、alk5(tgfβ1ⅰ型受体)、tgfbr2(tgfβ1ⅱ型受体)、smad2/3，p
‑
smad2，p
‑
smad3的磷酸化蛋白与总蛋白水平。
50.第二步：高血压致心肌纤维化动物模型的建立及c
‑
ski的作用及机制研究
51.1、动物模型的建立及慢性毒c
‑
ski的转染；
52.选取8周龄雄性c57小鼠40只，随机分为高血压心肌纤维化模型组(n＝40)和对照组(n＝10)。在模型组中，将含有ang ii的渗透压微泵皮下植入小鼠慢性持续(1.4mg/kg/day)5给药4周后评价心肌肥厚。而对照组(saline组)则同样利用渗透压微泵持续给予生理盐水(saline,0.9％nacl)。渗透压微泵技术是以渗透压为释药动力，靠给药系统内外的渗透压差控制释药时间而达到按预定时间多次释放药物的目的。到第15日，将模型组进一步随机分为三组：慢病毒过表达组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
ski慢病毒，滴度为1
×
108tu)，慢病毒对照组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
nc慢病毒，滴度为1
×
108tu)；模型组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul生理盐水)。
53.2、血压及心功能检测，包括超声检测及血流动力学检测；
54.b1：血压及超声检测心功能：将小鼠进行尾动脉测压，后异氟烷吸入性麻醉小鼠，将小鼠左胸前区剃毛，涂抹耦合剂，取左侧卧位或仰卧位对小鼠行超声检查。选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量小鼠左室收缩末内径(lvesd)、左室舒张末内径(lvedd)、舒张期室
间隔厚度(ivsd)、左心室后壁厚度(lvpwd)、短轴缩短率(fs)。每组小鼠最少采集15个小鼠的数据。采用设备为高频超声诊断仪(my lab 30，esaote,italy),频率为15
‑
mhz。
55.b2：血流动力学检测：异氟烷吸入性麻醉小鼠后颈部剃毛，剪开颈部皮肤，分离出颈动脉，采用1.4f导管(spr
‑
839,millar instruments,houston,tex)经小鼠颈动脉插管至左心室，连接powerlab生物信号采集处理系统，监测小鼠血压(pmin)、心率(hr)、心输出量(co)、心室容积(vmax；vmin)、心脏做功(sw)、射血分数(ef)、左室内压上升速率dp/dt(dp/dt max；dp/dt min)等指标。每组小鼠最少采集15个小鼠的数据。
56.3、心肌组织病理学检查；
57.取出小鼠心脏和肺脏，用滤纸吸干血液后分别称重，计算肺脏重量与体重的比值(lw/bw)、心脏重量与体重的比值(hw/bw)，并肉眼观察心脏大体观。每组都各取10个心脏加入10倍量4％多聚甲醛固定后24小时后将小鼠心脏放于翻拍板上用照相机(尼康d700)拍大体心脏。将拍完后的心脏脱水、石蜡包埋、切片(厚度4μm,每个心脏各切18张)。切片(n＝6/组)进行常规he染色和fitc标记的麦胚芽凝集素(wga；n＝6/组)染色。
58.4、心肌纤维化及内皮间充质转化相关分子标志物检测；
59.将对照组(n＝10)及实验组小鼠(n＝40/组)心室肌组织分别提取总rna和蛋白质，应用real
‑
time pcr和western blot检测collagen i,collagen iii,α
‑
sma，e
‑
cad，vimentin以及关转录因子twist、slug及snail的mrna和蛋白表达水平。
60.5、检测c
‑
ski对tgfβ/smad信号通路的影响；
61.采用western blot方法，检测各组(n＝10/组)心肌组织中tgfβ1、alk5(tgfβ1ⅰ型受体)、tgfbr2(tgfβ1ⅱ型受体)、smad2/3，p
‑
smad2，p
‑
smad3的磷酸化蛋白与总蛋白水平。
62.第三步：深入信息学分析靶向c
‑
ski的microrna筛选及验证
63.1、筛选参与end
‑
mt转化并靶向调控c
‑
ski的mirna；
64.c1：筛选参与end
‑
mt转化并靶向调控c
‑
ski的潜在mirna：课题组前期先通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测能够靶向结合c
‑
ski的3＇
‑
utr的mirna，再结合文献报道能够被tgfβ上调表达的mirna，筛选出潜在的7个目的mirna：mir
‑
21
‑
5p，mir
‑
155
‑
5p，mir
‑
367
‑
3p，mir
‑
497
‑
5p，mir
‑
15a
‑
5p，mir
‑
195
‑
5p，mir
‑
221
‑
5p。
65.分别合成上述7种mirna的mimics和ntc，分别转染hcaec细胞，具体分组如下：对照组：hcaec ntc(终浓度50nm)实验组：hcaec mimics(mir
‑
21
‑
5p或mir
‑
155
‑
5p或mir
‑
367
‑
3p或mir
‑
497
‑
5p或mir
‑
15a
‑
5p或mir
‑
195
‑
5p或mir
‑
221
‑
5p，终浓度50nm)。mimics和ntc的转染浓度均为50nm，48h后收集细胞q
‑
pcr分别检测各组中目的mirna及c
‑
ski的情况，获得参与end
‑
mt转化并靶向调控c
‑
ski的潜在mirna，其中mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski调控关系最为明显。
66.c2：验证mir
‑
155
‑
5p对c
‑
ski的靶向调控关系：通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski的3＇
‑
utr的结合位点，通过ncbi查找到相对应的序列信息，选择结合位点前后300bp序列构建c
‑
ski3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒，并构建c
‑
ski3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒突变体，用双荧光素酶检测试剂盒处理细胞，并用多功能酶标仪检测每组细胞的海肾和萤火虫荧光强度，计算各组的相对表达情况，分析mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski3＇
‑
utr预测靶点的作用情况。
67.2、mir
‑
155在tgf
‑
β诱导hcaec细胞end
‑
mt转化过程中的作用分析；
68.在成功建立end
‑
mt细胞模型的基础上，分别上调或下调mir
‑
155的表达，具体分组
为：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec mirna过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna过表达慢病毒，e:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna敲低慢病毒。免疫荧光法、western blot法检测各组细胞检测vimentin、cd31等内皮
‑
间充质的标志物蛋白的表达情况，观察mir
‑
155在冠脉内皮细胞end
‑
mt转化过程中的作用。
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法。
背景技术：
2.心血管疾病(cvd)是全球慢性非传染性疾病的主要致死原因之一，严重威胁人类健康，造成沉重的社会负担。高血压是一种常见的心血管疾病，是导致心力衰竭的主要危险因素。它可引起ras(肾素
‑
血管紧张素系统)激活，被认为是促进心肌纤维化(mf)的主要原因，是多种心血管疾病发展到终末期的必然过程。心肌纤维化与心律失常、心功能不全甚至心源性猝死密切相关，被认为是心血管疾病发生和死亡的独立危险因素。靶向干预或逆转高血压引起的心肌纤维化是缓解心肌纤维化病理过程的重要组成部分。
3.c
‑
ski(sloan
‑
kettering研究所原癌基因)是tgf
‑
β1/smad信号的转录抑制因子。c
‑
ski通过与smads结合，可以负性调节tgf
‑
β/smad信号通路传导，参与创面愈合、代谢性疾病、器官纤维化等疾病中成纤维细胞的发育和分化。在心血管疾病模型中，c
‑
ski在心肌纤维形成中发挥关键作用，过表达c
‑
ski可降低肌成纤维细胞胶原的合成、分泌和收缩，诱导心肌成纤维细胞凋亡，降低细胞活力，c
‑
ski还可通过上调同源盒基因(meox2)的表达来抑制锌脂蛋白2(zeb2)的功能，从而降低tgf
‑
β1诱导的肌成纤维细胞的表达，抑制心肌纤维化。表明c
‑
ski可能是一种很有前途的改善人冠状动脉内皮细胞(hcaec)内皮
‑
间充质转化(end
‑
mt)和预防或逆转高血压引起的心肌纤维化的药物。
4.mirna是一种新发现的非编码小分子单链rna，它有助于转录后调控基因表达，在心肌纤维化的各种生理和病理过程中发挥着广泛的作用。mir
‑
21在心肌成纤维细胞中特异性高表达，mir
‑
21通过抑制tgf
‑
β受体iii的表达，促进心肌梗死后心肌纤维化的发生发展；mir
‑
29b直接作用于多种胶原、基质金属蛋白酶等，从而抑制心脏成纤维细胞分泌胶原。研究还发现他汀类药物可改善充血性心力衰竭心脏心肌纤维化，其机制涉及mir
‑
208a表达的部分降低。广泛的mirna功能启发了研究人员研究mirna在心肌纤维化或end
‑
mt转化中的表达谱。识别能够靶向c
‑
ski的解除调控的mirnas可能为心肌纤维化治疗提供新的策略。
5.目前，tgf
‑
β与end
‑
mt的对应关系以及c
‑
ski负向调节tgf
‑
β/smad信号通路已被证实，但是具体有哪些c
‑
ski的靶向调控因子参与tgf
‑
β1/smad信号通路并调控end
‑
mt进程还需要进行研究及验证。
技术实现要素：
6.为了克服以上缺陷，本发明提供了一种周期短，操作可行性较高的研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，为心肌纤维化治疗提供新的策略。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，其特征在于：包
括以下步骤：
9.(1)c
‑
ski基因靶向mirna预测；
10.(2)最佳mirna筛选；
11.(3)验证mirna通过c
‑
ski在tgf
‑
β诱导hcaec细胞end
‑
mt转化过程中的作用；
12.(4)体内实验验证mirna在高血压致心肌纤维化过程中的影响；
13.所述步骤(3)或(4)无时间顺序上的限定。
14.进一步的，步骤(1)具体为：通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测能够靶向结合c
‑
ski的3＇
‑
utr的mirna，再结合文献报道能够被tgfβ上调表达的mirna，筛选出潜在的7个目的mirna，分别为：mir
‑
21
‑
5p，mir
‑
155
‑
5p，mir
‑
367
‑
3p，mir
‑
497
‑
5p，mir
‑
15a
‑
5p，mir
‑
195
‑
5p，mir
‑
221
‑
5p。
15.进一步的，步骤(2)具体为：
16.(a1)分别构建7个mirna的模拟物，转染hcaec细胞；48h后收集细胞，q
‑
pcr分别检测各组中目的mirna及c
‑
ski的情况；
17.(a2)突变抑制活性最佳的mirna靶向c
‑
ski的靶位点，进行进一步双荧光素酶报告系统分析。
18.进一步的，步骤(3)具体为：
19.(b1)以人冠脉内皮细胞(hcaec)为研究对象，以tgf
‑
β刺激建立内皮
‑
间充质(end
‑
mt)转化的模型；
20.(b2)hcaec复苏后，用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至80％融合时按1﹕2传代，约每3天传代1次。将处于对数生长期的hcaec改用无血清的dmem/f12培养基继续培养24h后随机分组进行后续实验。细胞分组同上，继续48h后，收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况；
21.(b3)构建c
‑
ski过表达和mirna过表达、敲低慢病毒侵染hcaec细胞，分别设计5组进行实验：c
‑
ski过表达慢病毒组：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec c
‑
ski过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) c
‑
ski过表达慢病毒 mirna过表达慢病毒，e:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) c
‑
ski过表达慢病毒 mirna敲低慢病毒；mirna过表达、敲低慢病毒组：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec mirna过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna过表达慢病毒，e:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna敲低慢病毒。48h后收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况，同时检测end
‑
mt转化标志物vimentin、cd31、相关转录因子twist、slug及snail蛋白和mrna的表达情况；
22.进一步的，步骤(4)具体为：
23.(c1)将含有ang ii的渗透压微泵皮下植入8周龄雄性c57小鼠慢性持续(1.4mg/kg/day)给药，4周后评价心肌肥厚；
24.(c2)第15日，将模型组进一步随机分为三组：慢病毒过表达组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
ski慢病毒，滴度为1
×
108tu)，慢病毒对照组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
nc慢病毒，滴度为1
×
108tu)；模型组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul生理盐水)，western blot检测各组织中tgfβ1、alk5(tgfβ1ⅰ型受体)、tgfbr2(tgfβ1ⅱ型受体)、smad2/3，p
‑
smad2，p
‑
smad3的磷酸化蛋白与总蛋白水平。
25.进一步的，步骤(a2)所述进行进一步双荧光素酶报告系统分析的方法，包括以下步骤：
26.(d1)通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski的3＇
‑
utr的结合位点；
27.(d2)通过ncbi查找到相对应的序列信息，选择结合位点前后300bp序列构建c
‑
ski3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒，并构建c
‑
ski 3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒突变体；
28.(d3)用双荧光素酶检测试剂盒处理细胞，并用多功能酶标仪检测每组细胞的海肾和萤火虫荧光强度，计算各组的相对表达情况.
29.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
30.本发明提供了一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，首先通过文献检索和生物信息学预测出潜在的调控通路(tgf
‑
β/mirna/c
‑
ski通路)，然后通过人冠状动脉内皮细胞建立end
‑
mt模型以及高血压心肌纤维化动物模型，探究tgf
‑
β/mir
‑
155/c
‑
ski通路调控end
‑
mt的具体分子机制，利用本发明提供的方法筛选得到了靶向c
‑
ski调控tgf
‑
β/smad信号通路参与end
‑
mt的关键性靶基因mirna
‑
155。
31.本发明所述方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，且可重复性强，在普通实验室就可完成，且该方法为心肌纤维化的防治提供新的思路和模式，为其治疗的新途径提供理论基础，本发明提供的方法还可用于其他哺乳动物，应用广泛。
具体实施方式
32.为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
33.实施例
34.一种研究mir
‑
155/c
‑
ski在高血压致心肌纤维化中的功能的方法，包括以下步骤：
35.第一步：内皮
‑
间充质转化细胞模型的建立及c
‑
ski的作用机制：
36.1、构建tgfβ诱导人冠状动脉内皮细胞(hcaec)end
‑
mt转化模型；
37.以人冠脉内皮细胞为研究对象，以tgf
‑
β刺激建立内皮
‑
间充质转化的模型。分别给予不同浓度tgf
‑
β(0，1，2.5，5ng/ml)刺激冠脉内皮细胞，后分别于37℃、5％co2培养箱内培养，后检测内皮
‑
间充质的标志物鉴定细胞类型，筛选出最佳刺激浓度，成功建立end
‑
mt转化模型。
38.2、c
‑
ski在tgf
‑
β诱导hcaec细胞end
‑
mt转化过程中的作用分析；
39.(1)检测hcaec细胞end
‑
mt转化过程中c
‑
ski的表达情况
40.hcaec复苏后，用含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至80％融合时按1﹕2传代，约每3天传代1次。将处于对数生长期的hcaec改用无血清的dmem/f12培养基继续培养24h后随机分组进行后续实验。细胞分组同上，继续48h后，收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况。
41.(2)lv
‑
c
‑
ski慢病毒包装
42.a1：c
‑
ski慢病毒过表达质粒构建：(长沙讴睿生物技术有限公司合成c
‑
ski基因全序列)，通过酶切连接的方法将其构建到慢病毒过表达载体plvx
‑
ires
‑
puro获得重组质粒plvx
‑
ires
‑
puro
‑
c
‑
ski。
43.a2：c
‑
ski慢病毒包装：用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的293ft细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.0*107个细胞重新接种于10cm细胞培养皿内，37℃，5％co2培养箱内培养，待细胞汇合度达90％时即可用于转染。转染前2小时，更换新鲜培养基。按照10ug，plvx
‑
ires
‑
puro
‑
c
‑
ski 15ul慢病毒包装mix质粒加入到500ul opti
‑
mem内混匀，另外取35ul lip2000加入到500ul opti
‑
mem内混匀，两者迅速混合，混匀，室温静止15分钟。逐滴加入到培养皿内，充分混匀。12小时后更换不含双抗的含2％fbs的病毒收获培养基。
44.a3：c
‑
ski慢病毒包装浓缩：收获病毒培养基到离心管内，冰上预冷。1500g，4度，离心30分钟。用0.45um滤器过滤病毒上清液。过滤后，按照3：1的比例加入4x病毒浓缩液。4度静置过夜后，1500g，4度，离心45分钟。离心后去掉上清，加入500ul无血清培养基重悬病毒聚集团块。
45.a4：c
‑
ski慢病毒滴度测定：取10ul浓缩病毒lv
‑
ski加入到90ul稀释液中，此为第一稀释度，从第一稀释度中取10ul加入到90ul稀释液中，此为第二稀释度，逐级稀释，共取8个稀释度。取90ul稀释病毒液加入96孔板感染293a细胞，感染2天后，加入嘌呤霉素筛选细胞(被病毒感染了的细胞有嘌呤霉素抗性，嘌呤霉素筛选过后还存活的细胞即被病毒感染)4天后拍照并计数存活的细胞。
46.(3)c
‑
ski对end
‑
mt转化过程中标志蛋白表达的影响及作用机制研究
47.在之前成功建立模型的基础上，在hcaec细胞中过表达c
‑
ski，对end
‑
mt转化过程中标志蛋白表达的影响。细胞分组为：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec c
‑
ski过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) c
‑
ski过表达慢病毒。48h后收集细胞wb检测c
‑
ski的表达情况，同时检测内皮
‑
间质转化标志物vimentin、cd31、相关转录因子twist、slug及snail蛋白和mrna的表达情况。
48.3、阐明c
‑
ski对tgfβ/smad信号通路的影响
49.采用western blot方法，检测各组(n＝10/组)心肌细胞中tgfβ1、alk5(tgfβ1ⅰ型受体)、tgfbr2(tgfβ1ⅱ型受体)、smad2/3，p
‑
smad2，p
‑
smad3的磷酸化蛋白与总蛋白水平。
50.第二步：高血压致心肌纤维化动物模型的建立及c
‑
ski的作用及机制研究
51.1、动物模型的建立及慢性毒c
‑
ski的转染；
52.选取8周龄雄性c57小鼠40只，随机分为高血压心肌纤维化模型组(n＝40)和对照组(n＝10)。在模型组中，将含有ang ii的渗透压微泵皮下植入小鼠慢性持续(1.4mg/kg/day)5给药4周后评价心肌肥厚。而对照组(saline组)则同样利用渗透压微泵持续给予生理盐水(saline,0.9％nacl)。渗透压微泵技术是以渗透压为释药动力，靠给药系统内外的渗透压差控制释药时间而达到按预定时间多次释放药物的目的。到第15日，将模型组进一步随机分为三组：慢病毒过表达组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
ski慢病毒，滴度为1
×
108tu)，慢病毒对照组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul lv
‑
nc慢病毒，滴度为1
×
108tu)；模型组(在第18、21、24、27、30日分别尾静脉注射100ul生理盐水)。
53.2、血压及心功能检测，包括超声检测及血流动力学检测；
54.b1：血压及超声检测心功能：将小鼠进行尾动脉测压，后异氟烷吸入性麻醉小鼠，将小鼠左胸前区剃毛，涂抹耦合剂，取左侧卧位或仰卧位对小鼠行超声检查。选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量小鼠左室收缩末内径(lvesd)、左室舒张末内径(lvedd)、舒张期室
间隔厚度(ivsd)、左心室后壁厚度(lvpwd)、短轴缩短率(fs)。每组小鼠最少采集15个小鼠的数据。采用设备为高频超声诊断仪(my lab 30，esaote,italy),频率为15
‑
mhz。
55.b2：血流动力学检测：异氟烷吸入性麻醉小鼠后颈部剃毛，剪开颈部皮肤，分离出颈动脉，采用1.4f导管(spr
‑
839,millar instruments,houston,tex)经小鼠颈动脉插管至左心室，连接powerlab生物信号采集处理系统，监测小鼠血压(pmin)、心率(hr)、心输出量(co)、心室容积(vmax；vmin)、心脏做功(sw)、射血分数(ef)、左室内压上升速率dp/dt(dp/dt max；dp/dt min)等指标。每组小鼠最少采集15个小鼠的数据。
56.3、心肌组织病理学检查；
57.取出小鼠心脏和肺脏，用滤纸吸干血液后分别称重，计算肺脏重量与体重的比值(lw/bw)、心脏重量与体重的比值(hw/bw)，并肉眼观察心脏大体观。每组都各取10个心脏加入10倍量4％多聚甲醛固定后24小时后将小鼠心脏放于翻拍板上用照相机(尼康d700)拍大体心脏。将拍完后的心脏脱水、石蜡包埋、切片(厚度4μm,每个心脏各切18张)。切片(n＝6/组)进行常规he染色和fitc标记的麦胚芽凝集素(wga；n＝6/组)染色。
58.4、心肌纤维化及内皮间充质转化相关分子标志物检测；
59.将对照组(n＝10)及实验组小鼠(n＝40/组)心室肌组织分别提取总rna和蛋白质，应用real
‑
time pcr和western blot检测collagen i,collagen iii,α
‑
sma，e
‑
cad，vimentin以及关转录因子twist、slug及snail的mrna和蛋白表达水平。
60.5、检测c
‑
ski对tgfβ/smad信号通路的影响；
61.采用western blot方法，检测各组(n＝10/组)心肌组织中tgfβ1、alk5(tgfβ1ⅰ型受体)、tgfbr2(tgfβ1ⅱ型受体)、smad2/3，p
‑
smad2，p
‑
smad3的磷酸化蛋白与总蛋白水平。
62.第三步：深入信息学分析靶向c
‑
ski的microrna筛选及验证
63.1、筛选参与end
‑
mt转化并靶向调控c
‑
ski的mirna；
64.c1：筛选参与end
‑
mt转化并靶向调控c
‑
ski的潜在mirna：课题组前期先通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测能够靶向结合c
‑
ski的3＇
‑
utr的mirna，再结合文献报道能够被tgfβ上调表达的mirna，筛选出潜在的7个目的mirna：mir
‑
21
‑
5p，mir
‑
155
‑
5p，mir
‑
367
‑
3p，mir
‑
497
‑
5p，mir
‑
15a
‑
5p，mir
‑
195
‑
5p，mir
‑
221
‑
5p。
65.分别合成上述7种mirna的mimics和ntc，分别转染hcaec细胞，具体分组如下：对照组：hcaec ntc(终浓度50nm)实验组：hcaec mimics(mir
‑
21
‑
5p或mir
‑
155
‑
5p或mir
‑
367
‑
3p或mir
‑
497
‑
5p或mir
‑
15a
‑
5p或mir
‑
195
‑
5p或mir
‑
221
‑
5p，终浓度50nm)。mimics和ntc的转染浓度均为50nm，48h后收集细胞q
‑
pcr分别检测各组中目的mirna及c
‑
ski的情况，获得参与end
‑
mt转化并靶向调控c
‑
ski的潜在mirna，其中mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski调控关系最为明显。
66.c2：验证mir
‑
155
‑
5p对c
‑
ski的靶向调控关系：通过在线软件(http://www.targetscan.org/vert_70/)预测mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski的3＇
‑
utr的结合位点，通过ncbi查找到相对应的序列信息，选择结合位点前后300bp序列构建c
‑
ski3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒，并构建c
‑
ski3＇
‑
utr双荧光素酶报告质粒突变体，用双荧光素酶检测试剂盒处理细胞，并用多功能酶标仪检测每组细胞的海肾和萤火虫荧光强度，计算各组的相对表达情况，分析mir
‑
155
‑
5p与c
‑
ski3＇
‑
utr预测靶点的作用情况。
67.2、mir
‑
155在tgf
‑
β诱导hcaec细胞end
‑
mt转化过程中的作用分析；
68.在成功建立end
‑
mt细胞模型的基础上，分别上调或下调mir
‑
155的表达，具体分组
为：a:hcaec对照；b:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml)；c:hcaec mirna过表达慢病毒；d:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna过表达慢病毒，e:hcaec tgfβ(终浓度5ng/ml) mirna敲低慢病毒。免疫荧光法、western blot法检测各组细胞检测vimentin、cd31等内皮
‑
间充质的标志物蛋白的表达情况，观察mir
‑
155在冠脉内皮细胞end
‑
mt转化过程中的作用。
再多了解一些
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