枣和酸枣柠檬酸相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

枣和酸枣柠檬酸相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种枣和酸枣柠檬酸相关的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.枣(ziziphus jujuba mill.)是鼠李科最重要的经济树种，有7000年的栽培和利用历史。枣营养价值丰富，含糖量高，含酸量低，主要积累少量苹果酸。枣是由野生酸枣(ziziphus jujuba mill.var.spinosa hu)驯化选育而来，酸枣味道极酸，含酸量高，大量积累柠檬酸和苹果酸。在酸枣到枣驯化过程中存在一系列中间类型，是栽培枣的候选种质库，口感酸甜，为中低酸类型。柠檬酸含量的急剧下降是栽培枣驯化过程中酸味丢失的重要原因。柠檬酸主要通过三羧酸循环及乙醛酸循环过程合成，而合成的柠檬酸可被乌头酸水合酶(aconitate hydratase，aco)转化为异柠檬酸，进一步被降解。早期便有学者提出在柑橘果实中，柠檬酸的积累是由于乌头酸水合酶(aconitate hydratase，aco)的活性受到抑制(bogin and wallace,orgnic acid synthesis and accumulation in sweet and sour lemon fruits.procedings of the american society for horticultural science.1966.89:182
‑
194)。前期我们基于骏枣全基因组测序鉴定到aco基因家族的4个成员，通过对31个栽培枣和野生酸枣的全基因组重测序，发现zjaco3(zj.jz013123003)在枣果实驯化中受到选择(huang et al.the jujube genome provides insights into genome evolution and the domestication of sweetness/acidity taste in fruit trees.plos genetics.2016,12(12):e1006433)，进一步分析发现该基因上游启动子区存在snp(single nucleotide polymorphisms)变异位点，推测其影响了枣果实柠檬酸的积累。
3.早期形态学及酶学的方法被用于分类和鉴定种质资源多样性，近20年随着生物技术的巨大进步，ssr(simple sequence repeats)被用于鉴定物种群遗传多样性及标记重要农艺性状。而近10年随着基因组测序技术的进步及成本的降低，snp(single nucleotide polymorphisms)分子标记被大量开发，其比ssr分子标记更为精确、统计更为简单。其中，kasp(kompetitive allele specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)可对目标snp进行快速精准的双等位基因分型。科研工作者通过对枣全基因组测序及群体重测序(guo et al.genomic analyses of diverse wild and cultivated accessions provide insights into the evolutionary history of jujube.plant biotechnology journal.2020,19:517
‑
531)，开发了大量snp分子标记。但是至今为止，没有关于枣果实品质性状相关的分子标记研究。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种枣和酸枣柠檬酸相关的snp分子标记及其应用。本发明通过鉴定zjaco3启动子序列与柠檬酸积累的关系，开发了与柠檬酸相
关的snp分子标记，并进一步通过kasp分型，实现对实生幼苗直接而快速的遗传鉴定，早期预测估计基因组育种值(genomic estimated breeding value，gebv)，可对野生资源驯化育种及相关杂交育种早期评价，建立快速育种技术体系，推动品种结构优化升级。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供一种枣和酸枣柠檬酸相关的snp分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，其序列中第1070位碱基r为a或g，导致柠檬酸含量出现多态性。具体如下：
7.atggcgaatcgtaaccgttcattttcatagaaactttaactttgagttcatcccaaacgctacattaaagtacacagtacactacatcataaataatgcaccaccactcgattatcaacaaccacatctagccgttgcattttctatggcccactttccattaagattttgcaaagaacacgtgggccagtgaaaaccaacgctgctattctcgtgtacagcttaaaatatctcttactattcaattcaaagcgaaggaagagagaatagtcgtataagtaggatgatgccacttgaccacgcctcctgcgaaacttccaagagttgccgattcatgggcacgcggctcaatacttaaagcactctctaagatattagatatatatcaaaatacacccagccaggcaatctgaaagtgacacatacacgccccaagtctattaaccgactattatcggaattttcttaatcccattccacacgtctaataaattgttttattatattccacgtagttagaattttttttgggttaatcacgtagttaggatatttgtataatttaaagtggttgtttcaattcaatataattattatataatattctctttctttattgaaatcagcttatttgtaataagccattatttttaggcataagaattaaaaatttaaattatattctatttttttaaaaaaatattatttattattaatgatgagatttatatatcaaataataatttagatagttattattaaaattttatttttaaaattttaaaataagaataataaaattaaatattttaattaaaatttgttagataaattgataattatagtaactaattgtacacaacaaaactcttttttaagaaaaaaaaagattttaaactaataaaaaattcaatttgaagaagaaaatggaaaagaaaaaagaaaaaagaaaaaagaaaaaaagacatttatcaataaaaagaaggttaaaatggccaaaaaatgggttgaattgatagggggatagtttggatttggaacttgttttgggtgcatttgatcacagacargtgaagcccacgaattgggcaaattttcgcagaggggattgagattttgagagggggagagagagagagagaggctcctcaattgtataaagctcgcaacaaaggcagtttacttctagaaaagtggcacgcagccctaggtcttctttcaattttcagcctcgccacacgccacacgccacacgccacacgccacctactatgttaactttctctttctctctctatcactaactcagaccagaacagtcg(seq id no.1)
8.所述snp分子标记位于zjaco3基因启动子区，突变位点为
‑
484a>g的突变。突变位点的确定是基于zjaco3基因，gene id:zj.jz013123003，数据库链接http://dx.doi.org/10.5061/dryad.83fr7.以zjaco3基因起始密码子为 1。该启动子区特征表现为上游
‑
486bp到
‑
481bp高柠檬酸型位点caagtg突变为低酸型位点caggtg(myb顺式结合元件)。当检测到
‑
484bp位点的碱基为纯合a/a型，判定为该基因表达水平低，柠檬酸含量高，是酸枣类群的主要基因型；当检测到
‑
484bp位点的碱基为纯合g/g型，判定为该基因表达水平高，柠檬酸被大量降解，含量低，该基因型是栽培枣类群的主要基因型；当检测到该位点为a/g杂合型时，柠檬酸含量为中低型，该基因型存在于酸甜口感的野生资源类型(驯化育种的后备种质)，也存在于少数栽培型枣类群中。
9.本发明的第二方面，提供上述snp分子标记在如下1)
‑
3)至少一项中的应用：
10.1)检测枣或酸枣柠檬酸含量；
11.2)筛选柠檬酸含量低的枣或酸枣品种；
12.3)选育高或低柠檬酸含量的枣或酸枣品种。
13.本发明的第三方面，提供一组用于扩增上述snp分子标记的引物，所述引物的序列
分别如seq id no.2和seq id no.3所示。具体如下：
14.正向引物：5
′‑
atggcgaatcgtaaccgttc
‑3′
；(seq id no.2)
15.反向引物：5
′‑
cgactgttctggtctgagtt
‑3′
。(seq id no.3)
16.本发明的第四方面，提供一种用于检测上述snp分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含上述seq id no.2和seq id no.3所示的引物。
17.本发明的第五方面，提供上述引物或试剂盒在如下1)
‑
3)至少一项中的应用：
18.1)检测枣或酸枣柠檬酸含量；
19.2)筛选柠檬酸含量低的枣或酸枣品种；
20.3)选育高或低柠檬酸含量的枣或酸枣品种。
21.本发明的第六方面，提供一种检测枣或酸枣柠檬酸含量的方法，包括以下步骤：
22.提取待测枣或酸枣的dna并将其作为模板，利用seq id no.2和seq id no.3所示的引物进行pcr扩增；对扩增产物进行测序，根据测序结果对枣或酸枣中的柠檬酸含量的高低进行判断：扩增产物第1070位碱基为g的类型柠檬酸含量低于扩增产物第1070位碱基为a的类型。
23.作为优选，所述pcr扩增的条件为：
24.pcr反应体系为：总体积为50μl，其中包括dna样本(浓度约为200ng/μl)2μl、上游引物1.5μl、下游引物1.5μl、tks gflex dna polymerase(1.25u/μl)(takara)1μl、2
×
gflex pcr buffer(mg
2
，dntp plus)(takara)25μl、ddh2o19μl。
25.pcr反应程序为：94℃预变性1min，然后98℃变性10sec、58℃复性15sec、68℃延伸45sec循环36次，最后4℃保温。
26.本发明的第七方面，提供一种筛选低柠檬酸含量枣或酸枣的方法，包括以下步骤：
27.对待测枣或酸枣zjaco3基因启动子区域的突变位点
‑
484a＞g进行基因分型检测；a/a基因型为高柠檬酸酸型，g/g基因型为低柠檬酸型，a/g基因型为中间型。
28.优选的，利用kasp基因分型技术对突变位点
‑
484a>g进行基因分型检测；kasp引物组合的序列如seq id no.4
‑
seq id no.6所示。具体如下：
29.gene
–
f1：5
′‑
hex
‑
gaaggtcggagtcaacggattgttttgggtgcatttgatcacagacag
‑3′
；(seq id no.4)
30.gene
–
f2：5
′‑
fam
‑
gaaggtgaccaagttcatgctgttttgggtgcatttgatcacagacaa
‑3′
；(seq id no.5)
31.gene
–
r：5
′‑
aaaatctcaatccccrctgcgaaaatttgccc
‑3′
。(seq id no.6)
32.引物用te(ph 8.0)溶解至10μm，然后按照上游分型引物f1：上游分型引物f2：下游通用引物r＝1:1:3的比例混合备用，每3μl反应体系加0.25μl引物混合物。
33.进行检测时，pcr反应体系如下：dna模板1.15μl，2
×
kasp master mix 1.6μl，引物混合物0.25μl。
34.pcr反应条件为：95℃10min，95℃20sec、61
‑
55℃60sec 10个循环，95℃20sec、55℃60sec 35个循环，25℃30sec。
35.根据荧光信号颜色判断各个样本的基因型：如荧光信号呈橘色，则第
‑
484位点的基因型为aa，若荧光信号呈现绿色，则基因型为ga，若荧光信号为蓝色，则基因型为gg。
36.本发明的第八方面，提供一种选育柠檬酸含量低的枣或酸枣品种的方法，包括以
下步骤：
37.对枣或酸枣zjaco3基因启动子区域的突变位点
‑
484a>g进行基因分型检测；将两种a/g基因型，或g/g型和a/g的枣或酸枣进行杂交，筛选g/g基因型的杂交后代。
38.本发明的有益效果：
39.本发明首次提出一种适用于鉴定枣或酸枣柠檬酸含量高低的snp分子标记，该分子标记来自于枣zjaco3基因启动子区。该启动子区特征表现为上游
‑
486bp到
‑
481bp高柠檬酸型位点caagtg突变为低酸型位点caggtg(myb顺式结合元件)。本发明为枣果实有机酸相关的驯化育种提供高效、准确的分子技术。
附图说明
40.图1为zjaco3上游启动子区序列；
41.图2为枣和酸枣启动区
‑
484bp及附近测序峰图；
42.图3为
‑
484bp不同基因型的柠檬酸含量箱图；
43.图4为部分样本的kasp基因分型图。
具体实施方式
44.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
45.正如背景技术部分所介绍的，枣或酸枣中柠檬酸含量会影响果实的口感和营养价值。若能发现枣或酸枣中与柠檬酸含量相关的snp分子标记，可对野生资源驯化育种及相关杂交育种早期评价，建立快速育种技术体系。但至今为止，还没有关于枣果实品质性状相关的分子标记研究。
46.基于此，本发明通过鉴定zjaco3启动子序列与柠檬酸积累的关系，开发了一种适用于鉴定枣或酸枣柠檬酸含量高低的snp分子标记。该分子标记来自于zjaco3基因启动子区。该启动子区特征表现为上游
‑
486bp到
‑
481bp高柠檬酸型位点caagtg突变为低酸型位点caggtg(myb顺式结合元件)。
47.当检测到
‑
484bp位点的碱基为纯合a/a型，判定为该基因表达水平低，柠檬酸含量高，是酸枣类群的主要基因型；当检测到
‑
484bp位点的碱基为纯合g/g型，判定为该基因表达水平高，柠檬酸被大量降解，含量低，该基因型是栽培枣类群的主要基因型；当检测到该位点为a/g杂合型时，柠檬酸含量为中低型，该基因型存在于酸甜口感的野生资源类型(驯化育种的后备种质)，也存在于酸甜口感的栽培型枣类群中。
48.本发明还提供了一种利用上述snp分子标记检测酸枣低酸或高柠檬酸的方法。采用pcr扩增和测序检测zjaco3基因启动子区
‑
484bp碱基为a或g，其中a/a型为高酸型，g/g型为低酸型，a/g型为中间型。
49.为实施本发明，根据zjaco3启动子序列及前期重测序结果，设计保守的上下游测序引物，分别为：
50.正向引物：5
′‑
atggcgaatcgtaaccgttc
‑3′
；(seq id no.2)
51.反向引物：5
′‑
cgactgttctggtctgagtt
‑3′
。(seq id no.3)
52.pcr反应体系为：总体积为50μl，其中包括dna样本(浓度约为200ng/μl)2μl、上游引物1.5μl、下游引物1.5μl、tks gflex dna polymerase(1.25u/μl)(takara)1μl、2
×
gflex pcr buffer(mg
2
，dntp plus)(takara)25μl、ddh2o19μl。
53.pcr反应程序为：94℃预变性1min，然后98℃变性10sec、58℃复性15sec、68℃延伸45sec循环36次，最后4℃保温。
54.可以对pcr产物克隆测序，将pcr产物纯化后导入克隆载体，遗传转化dh5a大肠杆菌，分别挑取6个阳性菌斑，对每一个菌斑分别摇菌提质粒测序，鉴定
‑
484bp处基因型；也可以对pcr产物直接测序，鉴定
‑
484处为单峰的a或g，亦或许是a/g重叠峰，判定该样品的基因型。
55.在另一个实施方案中，采用kasp基因分型技术检测待测枣基因组zjaco3基因启动子区上游
‑
484bp碱基为g或a，根据该位点序列及上游区设计kasp引物组合，包括两条上游分型引物f1(3’端为变异类型g)，f2(3’端为变异类型a)和下游通用引物r，其中f1接头与通用荧光接头hex(蓝色)配对，f2接头与通用荧光接头fam(橘色)配对，引物序列分别为
56.gene
–
f1：gaaggtcggagtcaacggattgttttgggtgcatttgatcacagacag
57.gene
–
f2：gaaggtgaccaagttcatgctgttttgggtgcatttgatcacagacaa
58.gene
–
r：aaaatctcaatccccrctgcgaaaatttgccc
59.引物用te(ph 8.0)溶解至10μm，然后按照上游分型引物f1：上游分型引物f2：下游通用引物r＝1:1:3的比例(体积比)混合备用，每3μl反应体系加0.25μl引物混合物。
60.进行检测时，pcr反应体系如下：dna模板1.15μl，2
×
kasp master mix 1.6μl,引物混合物0.25μl。
61.pcr反应条件为：95℃10min，95℃20sec、61
‑
55℃60sec 10个循环，95℃20sec、55℃60sec 35个循环，25℃30sec。
62.根据荧光信号颜色判断各个样本的基因型：如荧光信号呈橘色，则第
‑
484位点的基因型为a/a，若荧光信号呈现绿色，则基因型为a/g；若荧光信号为蓝色，则基因型为g/g。
63.实施方案还包括检测所述枣或酸枣成熟果实的柠檬酸含量。
64.本发明进一步提供新型的杂交组合，即将两种中低酸型酸枣杂交，筛选纯合低酸g/g基因型，为多样化育种提供基因型资源。
65.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
66.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
67.实施例1：枣和酸枣柠檬酸含量测定
68.样品采集枣种质资源采集于山东省果树研究所示范基地，酸枣分别采自河北太行山、山东泰山和微山等地，每个品种选取15个成熟期(半红)果实，取样位置包括各对称位置，每五个果实作为一个生物学重复，将样品切块后，立即液氮冰冻处理，
‑
80冰箱保存备用。
69.称取1g果实碎块于预冷的研钵内，加入5ml浓度为3％的kh2po4研磨提取液，于冰上充分研磨至匀浆，转入灭菌的10ml干燥离心管中。常温超声提取有机酸，时间设置20min。4
℃6000r/min离心20min，收集上清液；果肉残渣加入3ml kh2po4，再次超声提取有机酸，合并两次提取液，利用容量瓶定容至10ml，0.22μm滤膜过滤上清至上样瓶内。
70.将柠檬酸标准品用上述kh2po4研磨提取液配置不同浓度的标准液(0.05、0.1、0.25、0.5、1.0mg/m l)，用于绘制柠檬酸标准曲线。
71.柠檬酸检测条件为：agilnet c18(4.6
×
250mm)色谱柱；uv detector l
‑
2400检测器；检测波长210nm；检测温度30℃；流动相为0.01mol/l kh2po4(ph 2.3)：色谱级甲醇(体积比4:1)；流速1ml/min；进样体积10μl。每个样本三次进样重复，每个品种三次生物学重复，柠檬酸含量通过标准曲线公式计算。
72.实施例2：zjaco3荧光定量pcr表达水平分析
73.rna提取：使用takara多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取果实总rna，具体步骤见说明书。
74.反转录：cdna反转录试剂盒为takara反转录试剂盒primescript
tm
rt master mixt。
75.定量分析：荧光定量pcr分析试剂盒为chamq universal sybr qpcr master mix(vazyme)，实验仪器为iq5(bio
‑
rad)pcr仪。pcr体系为cdna 1μl、sybr master mix 10μl、正反向引物各0.4μl(10μm)，总反应体系20μl。反应程序为：95℃3min，95℃5s、56℃30s 40个循环，ubq作为内参基因(zhang et al.,2015)。利用公式2
∧
‑
delta ct
法计算基因的相对表达水平。每个样本的每个基因的结果是3次生物和技术重复的平均值，用spss25.0软件计算具有标准误差的平均值。
76.实施例3：zjaco3表达水平和柠檬酸含量的相关性分析
77.枣和酸枣中柠檬酸含量和zjaco3表达水平的测定结果见表1。
78.表1：不同枣和酸枣类型基因型、柠檬酸含量和zjaco3表达水平
79.[0080][0081]
注：对45个多样性酸枣样本和22个不同枣品种成熟期果实柠檬酸含量测定，并对zjaco3基因表达分析；随机选取了34个酸枣和18个枣启动子区测序；基因型标注ns为未测序样本。
[0082]
利用spss软件，运用spearman计算方法分析zjaco3表达水平和柠檬酸含量的相关性，结果显示呈现显著负相关(
‑
0.620，p<0.01)。
[0083]
实施例4：启动子克隆测序
[0084]
基因组dna提取：枣和酸枣叶片基因组提取方法利用改良ctab方法(参见张春梅酸枣ssr引物开发及遗传多样性研究，西北农林科技大学硕士论文)提取：取0.2g叶片液氮研磨，转入含有300ml 2
×
ctab的1.5ml的灭菌离心管中。65℃水浴30min，加入800μl cia氯仿：异戊醇＝24:1(v:v))混合均匀，12000rpm离心5min。将上清液转至新的1.5ml离心管，加入等体积cia混合均匀，12000rpm离心5min。离心结束后取上清液于新的1.5ml离心管，加入等体积冰异丙醇充分混合，
‑
30℃沉淀dna 10min。12000rpm 4℃离心5min。倒掉上清液，用冰无水乙醇清洗dna，12000rpm 4℃再次离心5min，弃去上清液，通风厨内干燥dna。加入50μl te缓冲液溶解dna。
[0085]
pcr扩增：根据前期枣基因组测序数据，扩增基因上游约1300bp启动子序列(图1)，设计zjaco3基因上游启动子pcr引物，正向引物5’atggcgaatcgtaaccgttc，反向引物5’cgactgttctggtctgagtt，以上述基因组dna为模板，pcr扩增，pcr试剂盒为takara tks高保
真聚合酶，扩增程序为94℃1min，98℃10s、56℃15s、68℃30s,30个循环。对pcr产物利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的条带，胶回收方法参见天根通用型dna纯化回收试剂盒。
[0086]
启动子区测序：将目的条带构建到克隆载体，转化dh5a大肠杆菌，具体方法为，使用5mintmta/blunt
‑
zero cloning kit(vazyme)，总反应体系为5μl，其中包括5
×
ta/blunt
‑
zero cloning mix1μl、pcr纯化产物(浓度约为90ng/μl)2μl、ddh2o 2μl，25℃反应30min。
[0087]
将反应产物利用热激转化法转入到dh5α化学感受态细胞，加入500μl lb培养基于37℃摇床震荡复苏培养60min，取30μl菌液于3ml含amp的lb液体培养基中，在37℃摇床中，200rpm震荡培养12h，然后在含amp的lb平板上划线，阳性克隆菌液送至睿博兴科生物技术有限公司测序。分别对每个品种的6个阳性克隆测序，以区分是纯合或杂合基因型。也可直接对上述pcr产物测序，比对观察
‑
484bp位点为单峰a，g或含有a和g的套峰(图2)。
[0088]
实施例5：序列比对分析
[0089]
利用bioedit软件，利用clustalw multiple alignment方法对34个多样性酸枣资源和18个枣品种的zjaco3基因测序启动子区序列比对，比对启动子区上游
‑
484bp位点基因型，为g/g、a/g、a/a型，其中柠檬酸极低的栽培枣为g/g型，柠檬酸极高的野生酸枣为a/a型，酸甜口感的酸枣为a/g型(表1，图3)。
[0090]
对表1中52个测序样本(包括枣和酸枣)基因型和柠檬酸含量相关性分析，相关系数为0.812，极显著相关。
[0091]
实施例6：kasp检测体系的建立
[0092]
根据zjaco3启动子上游
‑
484bp位点序列及上游区设计kasp引物组合，包括两条上游分型引物f1(hex荧光接头)，f2(fam荧光接头)和下游通用引物r，引物序列分别为
[0093]
gene
–
f1：gaaggtcggagtcaacggattgttttgggtgcatttgatcacagacag
[0094]
gene
–
f2：gaaggtgaccaagttcatgctgttttgggtgcatttgatcacagacaa
[0095]
gene
–
r：aaaatctcaatccccrctgcgaaaatttgccc
[0096]
引物用te(ph 8.0)溶解至10μm，然后按照上游分型引物1：上游分型引物2：下游通用引物＝1:1:3的比例(体积比)混合备用，每3μl反应体系加0.25μl引物混合物。
[0097]
进行检测时，pcr反应体系如下：dna模板1.15μl，2
×
kasp master mix 1.6μl,引物混合物0.25μl。
[0098]
pcr反应条件为：95℃10min，95℃20sec、61
‑
55℃60sec 10个循环，95℃20sec、55℃60sec 35个循环，25℃30sec。
[0099]
主要试剂耗材为kasp 2
×
pcr mix,sto rox，pcr板，封板摸；主要实验仪器为荧光定量pcr仪。
[0100]
根据荧光信号颜色判断各个样本的基因型：如荧光信号呈橘色，则第
‑
484位点的基因型为a/a，若荧光信号呈现绿色，则基因型为a/g，若荧光信号为蓝色，则基因型为g/g(图4)。
[0101]
对部分测序样本利用上述方法进行基因分型，荧光结果与测序结果一致。
[0102]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。