来自饮食的多醣的利用性高的新型双歧杆菌属细菌的制作方法

bp
‑
02929)、假链双歧杆菌yit11057(nite bp
‑
02930)、假链双歧杆菌yit11952(nite bp
‑
02931)、假链双歧杆菌yit11954(nite bp
‑
02932)、假链双歧杆菌yit12989(nite bp
‑
02933)或与它们近缘的菌株。
21.8)一种饮食品，含有1)～7)中任一项的双歧杆菌属细菌。
22.9)根据8)的饮食品，是发酵乳饮食品。
23.本发明的新型双歧杆菌属具有分解同化成人饮食中较多地含有的木聚糖类、特别是阿拉伯木聚糖的能力。因此，可期待本发明的假链双歧杆菌在成人的肠内的增殖和较高的有机酸产生能力，可作为面向成人的益活菌而利用于医药品、食品等。
附图说明
24.图1是yit11057株的木糖骨架切割活性。
25.图2是yit11057株的酸、胆汁酸耐受性。
具体实施方式
26.本发明的双歧杆菌属细菌只要在基因组上具有木聚糖酶基因，其种类就没有特别限定。例如可以为假链双歧杆菌(bifidobacterium.pseudocatenulatum)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(b.longum)、双岐双歧杆菌(b.bifidum)、动物双歧杆菌(b.animalis)、猪双歧杆菌(b.suis)、婴儿双歧杆菌(b.infantis)、青春双歧杆菌(b.adolescentis)、链状双歧杆菌(b.catenulatum)、乳双歧杆菌(b.lactis)、球双歧杆菌(b.globosum)、角双歧杆菌(b.angulatum)、齿双歧杆菌(b.dentium)等的任一种，优选可举出假链双歧杆菌。
27.以往，尚未知在基因组上具有木聚糖酶基因的双歧杆菌，可以说本发明的双歧杆菌属细菌是新型的细菌。
[0028]“木聚糖酶基因”是指编码被分类为gh10的木聚糖酶的基因(内切
‑
1,4
‑
β
‑
木聚糖酶a，xyna)，作为本发明的双歧杆菌属细菌在其基因组上所保有的“木聚糖酶基因”，具体而言包含：由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸或与该碱基序列具有70％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、更优选99％以上的同源性且编码具有木聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸。
[0029]
这里，由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸是指后述的yit11057株所保有的木聚糖酶基因。
[0030]
另外，碱基序列的同源性将以应比较的2个核酸序列的碱基尽可能多地一致的方式排列两碱基序列并用一致的碱基数除以总碱基数而得的值用百分率表示。如果是本领域技术人员，则可适当地设定blast、clustalx或genetyx之类的软件的参数来决定碱基序列的同源性。
[0031]
另外，木聚糖酶活性是指以木聚糖类作为底物，将木聚糖类的木糖骨架水解而生成低寡木糖和木糖的活性(木聚糖水解活性)。
[0032]
这里，作为木聚糖类，可举出木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖、乙酰木聚糖等，优选为木聚糖和阿拉伯木聚糖。
[0033]
因此，换言之，本发明的在基因组上具有木聚糖酶基因的双歧杆菌属细菌是具有
分解木聚糖类的木糖骨架的能力的双歧杆菌属细菌。
[0034]
在本发明中，“具有同化木聚糖类的能力”是指具有能够以木聚糖类作为碳源进行增殖的能力。具体而言，例如是指能够在以木聚糖类作为唯一碳源的培养基中进行增殖。例如是指在仅以木聚糖类作为糖源的培养基中培养72小时后的浊度、例如od
600
增加量为0.1以上。浊度优选od
600
增加量为0.3以上，更优选为0.4以上。另外，在不溶性级分多的添加有木聚糖类的培养基等无法测定浊度的变化的情况下，是指培养72小时后的培养上清液中的短链脂肪酸的产生，例如乳酸、乙酸和甲酸的合计产生量为10mm以上。短链脂肪酸产生量的合计优选为20mm以上，更优选为40mm以上。
[0035]
作为木聚糖类同化能力的试验中使用的培养基，只要使用在去除糖源的培养基中添加有木聚糖类的培养基即可，去除糖源的培养基的组成可以为m
‑
ils培养基、蛋白胨
‑
酵母(py)培养基等组成。
[0036]
添加于培养基中的木聚糖类的添加量在培养基中优选为0.01～10质量％，更优选为0.05～5品质％，进一步优选为0.1～1品质％。应予说明，优选作为对照在去除糖源的培养基中培养作为对象的双歧杆菌属细菌并预先确认od。
[0037]
如此，由于本发明的在基因组上具有木聚糖酶基因的双歧杆菌属细菌具有分解同化木聚糖类的能力，因此，能够有助于通过木聚糖类被分解而产生的乙酸、乳酸、甲酸等短链脂肪酸的供给。
[0038]
本发明的双歧杆菌属细菌能够通过以木聚糖酶基因的存在、上述同化木聚糖类的能力作为指标，例如从存在于人类(例如，成人、婴幼儿)的肠内的双歧杆菌属细菌、优选假链双歧杆菌进行筛选而获得。例如，可以从假链双歧杆菌挑选出后述实施例中所示的16株、进而yit11027、yit11055、yit11057、yit11952、yit11954、yit12989这6株。作为本发明的双歧杆菌属细菌，只要在基因组上具有木聚糖酶基因就不限定于这些，包含在生物学上、遗传学上与它们近缘的菌株。另外，作为本发明的双歧杆菌属细菌，只要在基因组上具有木聚糖酶基因，则可以为自然界中存在的天然株，也可以为天然株的变异种、或转基因种。
[0039]
yit11027株、yit11055株、yit11057株、yit11952株、yit11954株、yit12989株如下所示，在2019年3月25日保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2
‑5‑
8 122号室)。
[0040]
假链双歧杆菌yit11027(nite bp
‑
02928)、
[0041]
假链双歧杆菌yit11055(nite bp
‑
02929)、
[0042]
假链双歧杆菌yit11057(nite bp
‑
02930)、
[0043]
假链双歧杆菌yit11952(nite bp
‑
02931)、
[0044]
假链双歧杆菌yit11954(nite bp
‑
02932)、
[0045]
假链双歧杆菌yit12989(nite bp
‑
02933)。
[0046]
其中，从同化木聚糖类的能力的方面、进而兼具淀粉同化能力的方面出发，优选为yit11027株、yit11057株、yit11954株或与近缘的菌株。进而，从兼具具有酸、胆汁酸耐受性且在基因组中未检测出溶原性噬菌体的特性的方面出发，更优选为yit11057株或其近缘的菌株。
[0047]
这里，淀粉同化能力是指具有能够将淀粉作为碳源进行增殖的能力。酸、胆汁酸耐受性是指人工胃酸和人工胆汁酸的连续暴露处理后的存活性。不存在溶原性噬菌体是指使
用作为噬菌体搜索程序服务器的phaster(http://phaster.ca/)在基因组序列中未检测到与现有的噬菌体同源性高的区域。
[0048]
另外，近缘的菌株是指根据多个持家基因序列进行评价的多位点序列分析(mlsa)法而序列一致的菌株。
[0049]
具体而言，获得作为适于双歧杆菌的mlsa解析的基因而报告(international journal of systematic and evolutionary microbiology(2006),56,2783
‑
2792)的dna促旋酶亚基b(dna gyrase subunit b)(gyrb)、50s核糖体蛋白l2(50s ribosomal protein l2)(rplb)、氨基磷酸核糖转移酶(amidophosphoribosyltransferase)(purf)、dna指导的rna聚合酶亚基β(dna
‑
directed rna polymerase subunit beta)(rpob)、依赖atp的clp蛋白酶atp结合亚基clpc1(atp
‑
dependent clp protease atp
‑
binding subunit clpc1)(clpc)、延长因子g(elongation factor g)(fusa)、异亮氨酸
‑
trna连接酶(isoleucine
‑
trna ligase)(iles)的全长序列，对各菌株连结全部基因后，使用vsearch或blast等程序验证比较对象株间的序列的一致性，在序列同源性为90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、更优选99％以上的氢下可判断为是近缘种。
[0050]
将yit11057株中的gyrb基因、rplb基因、purf基因、rpob基因、clpc基因、fusa基因和iles基因的碱基序列示于序列表(gyrb：序列号2、rplb：序列号3、purf：序列号4、rpob：序列号5、clpc：序列号6、fusa：序列号7、iles：序列号8)。
[0051]
本发明的双歧杆菌属细菌的利用形态没有特别限制，可以为经冷冻干燥的形态，或者也能够以包含这些细菌的培养物的形式利用，但在任一形态中，细菌均优选为活菌的状态。
[0052]
本发明的双歧杆菌属细菌也可以与固体或液体的医药用无毒性载体混合，以惯用的医药品制剂的形态利用。作为这样的制剂，例如可举出片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等固形制剂；溶液剂、悬浮剂、乳剂等液剂；冷冻干燥制剂等。这些制剂可通过制剂上的常规方法制备。作为上述医药用无毒性载体，例如可举出葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。另外，也可以根据需要适当地添加稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂、赋形剂等惯用的添加剂。
[0053]
本发明的双歧杆菌属细菌不仅能够制成如上所述的制剂，也可以在饮食品中配合使用。在配合于饮食品中的氢下，只要直接含有或与各种营养成分一并含有即可。具体而言，在将本发明的双歧杆菌属细菌配合于饮食品中的情况下，可适当地使用可用作饮食品的添加剂，使用惯用的方法，成型为适于食用的形态，即颗粒状、粒状、片剂、胶囊、糊等，另外，也可以添加于各种食品，例如火腿、香肠等肉食加工食品；日式鱼糕、筒状鱼卷等水产加工食品；面包、糕点、黄油、奶粉中使用，或者添加于水、果汁、牛奶、清凉饮料、茶饮料等饮料中使用。应予说明，饮食品中也包括动物的饲料。
[0054]
进而，作为饮食品，可优选使用以活菌的状态含有本发明的双歧杆菌属细菌的发酵乳饮食品、发酵豆乳、发酵果汁、发酵蔬菜汁等发酵饮食品，特别优选利用发酵乳饮食品。发酵乳饮食品的制造依照常规方法即可，例如在制造发酵乳的氢下，在经杀菌的乳培养基中单独或与其它微生物同时接种培养本发明的双歧杆菌属细菌，并对其进行均质化处理，得到发酵乳基料。接着，添加混合另行制备的糖浆溶液，利用均质机等进行均质化，进一步
添加香料，精加工成最终制品即可。如此得到的发酵乳饮食品也可制成不含糖浆(甜味料)的普通型、软型、果味型、固体状、液状等任一形态的制品。
[0055]
可以在该发酵乳饮食品中配合糖浆等甜味料、乳化剂、增稠(稳定)剂、各种维生素等任意成分。作为糖浆，可配合葡萄糖、蔗糖、果糖、果糖葡萄糖液糖、葡萄糖果糖液糖、帕拉金糖、海藻糖、乳糖、木糖、低聚半乳糖(gos)、低聚木糖(xos)、阿拉伯低聚木糖(axos)、木聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯低聚糖(aos)、阿拉伯聚糖、麦芽糖、蜂蜜、糖蜜等糖类；山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、乳糖醇、异麦芽糖醇(palatinit)、还原饴糖、还原麦芽糖饴糖等糖醇；阿斯巴甜、索马甜、三氯蔗糖、安赛蜜k、甜菊等高甜度甜味料；甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、卵磷脂等乳化剂；琼脂、明胶、卡拉胶、瓜尔胶、黄原胶、果胶、刺槐豆胶、结冷胶、羧甲基纤维素、大豆多糖类、海藻酸丙二醇酯等增稠(稳定)剂。此外，也可以配合维生素a、维生素b类、维生素c、维生素e类等维生素类；钙、镁、锌、铁、锰等矿物成分；柠檬酸、乳酸、乙酸、苹果酸、酒石酸、葡糖酸等酸味料；奶油、黄油、酸奶油等乳脂肪；酸乳酪系、浆果系、橙子系、木瓜系、紫苏系、柑橘系、苹果系、薄荷系、葡萄系、杏系、梨、乳蛋糕乳脂、桃、甜瓜、香蕉、热带水果、药草系、红茶、咖啡系等香料类；药草提取物、红糖提取物等。
[0056]
发酵乳饮食品的制造中也可以并用本发明的双歧杆菌属细菌以外的微生物。作为这样的微生物，例如可举出干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、植物乳杆菌(l.plantarum)、布氏乳杆菌(l.buchneri)、鸡乳杆菌(l.gallinarum)、噬淀粉乳杆菌(l.amylovorus)、短乳杆菌(l.brevis)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、克菲尔乳杆菌(l.kefir)、副干酪乳杆菌(l.paracasei)、卷曲乳杆菌(l.crispatus)、玉米乳杆菌(l.zeae)、瑞士乳杆菌(l.helveticus)、唾液乳杆菌(l.salivalius)、加氏乳杆菌(l.gasseri)、发酵乳杆菌(l.fermentum)、罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(l.delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(l.delbrueckii subsp.delbrueckii)、约氏乳杆菌(l.johnsonii)等乳杆菌属细菌；嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)等链球菌属细菌；乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcus lactis subsp.cremoris)等乳球菌属细菌；粪肠球菌(enterococcus faecalis)、屎肠球菌(e.faecium)等肠球菌属细菌；枯草杆菌(bacillus subtilis)等芽孢杆菌属细菌；酿酒酵母(saccharomyses cerevisiae)、德尔布有孢圆酵母(torulaspora delbrueckii)、乳酒假丝酵母(candida kefyr)等属于酵母菌属、有孢圆酵母菌属、假丝酵母菌属等的酵母。如果与本发明的双歧杆菌属细菌一并并用选自乳杆菌属细菌、链球菌属细菌、乳酸球菌属细菌中的1种以上而制造发酵乳饮食品，则可得到高适口性，饮食变得容易，因而优选。
[0057]
使用本发明的双歧杆菌属细菌的情形时的给予量没有严格的限制，其优选的给予量以活菌数计为每天105cfu～10
13
cfu，特别优选为108cfu～10
12
cfu。
[0058]
实施例
[0059]
实施例1具有同化木聚糖类的能力的双歧杆菌属细菌的挑选
[0060]
i)使用菌株
[0061]
将从人类粪便分离并鉴定为假链双歧杆菌的53株作为筛选对象。
[0062]
ii)底物
[0063]
将通过木聚糖(来自燕麦)、阿拉伯木聚糖(来自小麦)、木聚糖的酶处理而工业性
制造的低聚木糖(xos)用于解析。关于木聚糖和阿拉伯木聚糖，利用hplc进行确认，结果未观察到单糖的混入(未刊载数据)。另外，将各构成单糖即木糖和阿拉伯糖、作为增殖确认用对照的代表性的难消化性多醣即淀粉和其构成单糖即葡萄糖、以及乳糖也供于解析。制备各底物的1％悬浮液后，木聚糖、阿拉伯木聚糖、淀粉使用高压釜灭菌，其它底物使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌。
[0064]
iii)同化性试验
[0065]
为了防止因伴随增殖的ph值降低导致的菌的增殖抑制，使用添加有100mm pipes的m
‑
py培养基。在使用前在氮气填充下冷藏保存的2倍浓缩m
‑
py培养基中等量混合1％底物溶液，用于培养试验(最终浓度0.5％)。
[0066]
将冷冻菌液接种于改良gam琼脂培养基中后，培养2～3天，将所得到的菌落在1％葡萄糖
‑
乳糖添加改良gam液体培养基中进行传代。在传代时，注意刮取多个菌落。在37℃静置培养一晚，第二天早晨将5％量的菌液在新鲜的相同培养基中再次进行传代。培养6～9小时左右直至达到对数增殖期后，测定浊度。将培养液100μl离心而去除上清液后，以成为od
600
＝0.2的方式添加未添加糖源的m
‑
py培养基，使颗粒物悬浮。在96孔板中分注各培养基198μl，添加菌液2μl后，将50μl的矿物油分层，在微孔读板机powerwave 340(biotech公司)内，在37℃进行培养。
[0067]
每隔30分钟测定浊度，监测从培养开始至60小时为止的浊度。以上的培养操作全部在厌氧手套箱内进行。60小时后分取一部分培养液，进行去除蛋白质的处理后，供于hplc测定短链脂肪酸产生量。应予说明，在添加木聚糖的m
‑
py培养基中观察到大量不溶性粒子的情况下，仅通过测定浊度无法确认菌体的增殖，因此根据短链脂肪酸产生的有无来判断同化性。使用hplc测定培养60小时时的培养上清液中的短链脂肪酸，确认到乳酸、乙酸和甲酸的合计产生量为10mm以上。将各种底物能够同化多少株的结果示于表1。
[0068]
[表1]
[0069] 木聚糖阿拉伯木聚糖xos木糖阿拉伯糖淀粉葡萄糖乳糖同化株数1616533936285153非同化株数3737014172520
[0070]
假链双歧杆菌的全部菌株中确认到低聚木糖的利用性，但更长链的木聚糖类的利用性在菌株间不同，挑选出同化木聚糖和阿拉伯木聚糖的16株作为具有同化木聚糖类的能力的双歧杆菌属细菌。
[0071]
在将木聚糖作为糖源的液体培养基中培养具有同化木聚糖类的能力的双歧杆菌属细菌株，利用hplc解析对数增殖期前期的培养上清液中的低聚糖。其结果，确认到生成有木糖和低聚木糖。由此，确认到本细菌具有将木糖骨架切断成木糖和低聚木糖的活性。以使用上述16株之一的yit11 057株的解析结果为代表例，示于图1。图1中的x1～x6分别表示木糖和相应数量的具有木糖骨架的低聚木糖，可知在培养基中未确认到的木糖和低聚木糖是由yit11057株的培养产生的。
[0072]
实施例2yit11027、yit11055、yit11057、yit11952、yit11954、yit12989的6株的各种性质
[0073]
将从上述具有同化木聚糖类的能力的16株中选择的以下6株yit11027、yit11055、yit11057、yit11952、yit11954、yit12989的同化性示于以下。yit11027、yit11057、
yit11954这3个菌株中确认到木聚糖类的同化性，也确认到淀粉的同化性(表2)。
[0074]
[表2]
[0075][0076]
实施例3基因组解析
[0077]
从菌体提取基因组dna，使用下一代测序仪miseq(illumina公司)决定草图基因
组。预测基因区域后，参照糖代谢基因数据库dbcan，从全部氨基酸序列提取糖代谢基因。搜索分布与木聚糖类的利用性一致的基因，结果具有属于gh10的内切
‑
1,4
‑
β
‑
木聚糖酶a基因(xyna)的株全部能够利用木聚糖类。另外，不具有相同基因的株均无法利用木聚糖类。
[0078]
实施例4yit11057的各种性质
[0079]
关于yit11057，对酸、胆汁酸耐受性、致病因子的穷举搜索、基因组中的溶原性噬菌体的检测进行评价。
[0080]
1)酸、胆汁酸耐受性
[0081]
i)人工液组成
[0082]
<人工胃液组成(ph值3.6)>
[0083]
胃蛋白酶 40mg/l
[0084]
朊蛋白胨 5g/l
[0085]
胃粘蛋白 1.5g/l
[0086]
nacl 5g/l
[0087]
nahco
3 3g/l
[0088]
kh2po
4 1g/l
[0089]
3.6n hcl将ph值调节为3.6
[0090]
<人工肠液>
[0091]
nacl 5g/l
[0092]
kcl 1g/l
[0093]
nahco
3 3g/l
[0094]
3m na2co3将ph值调节为8.0
[0095]
ii)将在1％葡萄糖
‑
乳糖添加mgam液体培养基中培养了一晚的菌液0.1ml添加至人工胃液2ml中，在37℃下孵育1小时。其后，加入人工肠液5.5ml和16％胆汁酸0.5ml，在37℃静置1小时。在酸处理前后、胆汁酸处理后采集菌液，利用生理盐水稀释后，将50μl涂抹于mgam琼脂培养基，测定cfu。其结果，即使在胆汁酸处理后也表现出0.1％程度的存活率(图2)。在不具有耐受性的情况下，由于各处理后的cfu为检测下限值以下，因此，可知yit11057具有相对较高的酸、胆汁酸耐受性。
[0096]
2)致病因子的穷举搜索
[0097]
向patric服务器(https://www.patricbrc.org/)(wattam et al.,2017)输入草图基因组信息，确认与致病因子数据库的序列具有高同源性的基因的有无。其结果，未检测到致病因子基因。
[0098]
3)基因组中的溶原性噬菌体的检测
[0099]
关于菌株的基因组信息，使用phaster服务器(http://phaster.ca/)(arndt et al.,2016)，尝试在噬菌体数据库中注册的溶原性噬菌体的检测。其结果，未检测到溶原性噬菌体。