一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用与流程

技术特征：
1.一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，其包括：(1)将经过消毒的毛竹种子接种在愈伤诱导培养基中培养，以诱导得到胚性愈伤组织；所述愈伤诱导培养基中含有200
‑
300mg/l的头孢霉素；(2)将所述胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中培养，并将长出新的愈伤组织剥离并进行酶解，以得到游离的裸露原生质体；(3)利用预冷的改良的原生质体培养基重悬原生质体，并进行活化处理；所述改良的原生质体培养基中含有1.5
‑
2.5mg/l的2,4
‑
d和0.15
‑
0.25mg/l的6
‑
ba；所述活化处理具体为：在43
‑
47℃热激处理4.5
‑
5.5min，然后在
‑
2～4℃处理5
‑
15s；(4)将活化处理后的原生质体接种于所述改良的原生质体培养基进行培养。2.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述愈伤诱导培养基中含有ms培养基、4
‑
6mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、50
‑
100mg/l肌醇、50
‑
100mg/l pvp
‑
40、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶、200
‑
300mg/l头孢霉素，ph值为5.75
‑
5.80。3.根据权利要求1或2所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，通过以下方式对毛竹种子进行消毒：将去掉种皮的毛竹种子在流水中冲泡20
‑
28h后，用180
‑
220mg/l的赤霉素溶液再浸泡1.5
‑
2.5h，剪去其尾部；而后在超净台中，将种子用70
‑
80％酒精浸泡0.5
‑
1.5min后，用无菌水清洗；然后用含1.8
‑
2.2％有效氯和0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的次氯酸钠消毒液浸泡18
‑
25min，用无菌水清洗；再用含0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的0.1％氯化汞浸泡18
‑
25min，最后用无菌水清洗；和/或，步骤(1)中，在每个培养器皿中单独接种一个经过消毒的毛竹种子。4.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述愈伤组织增殖培养基中含有ms培养基、1
‑
3mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、100
‑
200mg/l肌醇、50
‑
100mg/l pvp
‑
40、5
‑
10mg/l抗坏血酸、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶，ph值为5.75
‑
5.80。5.根据权利要求1或4所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，在步骤(2)的所述酶解中，所使用的酶解液中含有2.0
±
0.5％的纤维素酶cellulose r
‑
10、1.0
±
0.5％的半纤维素酶hemicellulase、1.0
±
0.5％的离析酶macerozyme r
‑
10、1.0
±
0.5％的果胶酶pectolyase y
‑
23、0.5
‑
0.7m的甘露醇、18
‑
22mm的mes、18
‑
22mm的kcl、0.008
‑
0.012m的cacl2、0.18
‑
0.22％的bsa，ph值为5.75
‑
5.80；和/或，所述酶解的条件为24
±
2℃、80
‑
120rpm/min下避光酶解。6.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，在步骤(2)中的酶解结束后，将酶解液冷却至0
‑
6℃，而后与预冷的w5溶液混合，并用80
‑
120目的细胞筛过滤混合液；收集滤液并在0
‑
6℃、400
‑
600g离心5
‑
10min，弃上清；而后再利用预冷的改良的原生质体培养基重悬沉淀；优选所述w5溶液中含有8
‑
10g/l的nacl、0.12
‑
0.13m cacl2、4
‑
6mm kcl、1.5
‑
2.5mm mes和1.5
‑
2.0g/l的葡萄糖。7.根据权利要求1所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(3)
‑
(4)中，所述改良的原生质体培养基是以km8p培养基为基础，添加35
‑
45g/l甘露醇、
15
‑
25ml/l椰乳、0.20
‑
0.30g/l酶水解酪蛋白、1.5
‑
2.5mg/l的2,4
‑
d、0.15
‑
0.25mg/l的6
‑
ba，ph值为5.75
‑
5.80。8.根据权利要求1或7所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(4)中，所述培养具体为：在24
±
2℃的黑暗环境下培养；优选地，步骤(4)中，原生质体的接种密度为2
‑
10
×
105cells/ml。9.根据权利要求1或8所述的培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法，其特征在于，具体步骤包括：(1)将去掉种皮的毛竹种子在流水中冲泡20
‑
28h后，用180
‑
220mg/l的赤霉素溶液再浸泡1.5
‑
2.5h，剪去其尾部；而后在超净台中，将种子用70
‑
80％酒精浸泡0.5
‑
1.5min后，用无菌水清洗；然后用含1.8
‑
2.2％有效氯和0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的次氯酸钠消毒液浸泡18
‑
25min，用无菌水清洗；再用含0.04
‑
0.06％吐温
‑
20的0.1％氯化汞浸泡18
‑
25min，最后用无菌水清洗，完成种子消毒；将经过消毒的毛竹种子接种在愈伤诱导培养基中培养，在每个培养器皿中单独接种一个毛竹种子，在24
±
2℃的黑暗环境下培养，以诱导得到胚性愈伤组织；所述愈伤诱导培养基中含有ms培养基、4
‑
6mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、50
‑
100mg/l肌醇、50
‑
100mg/l pvp
‑
40、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶、200
‑
300mg/l头孢霉素，ph值为5.75
‑
5.80；(2)将所述胚性愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基中，并在24
±
2℃的黑暗环境下培养，将长出新的愈伤组织剥离并在24
±
2℃、80
‑
120rpm/min下避光酶解，以得到游离的裸露原生质体；所述愈伤组织增殖培养基中含有ms培养基、1
‑
3mg/l 2,4
‑
d、300
‑
500mg/l脯氨酸、300
‑
500mg/l谷氨酰胺、100
‑
300mg/l水解酪蛋白、100
‑
200mg/l肌醇、50
‑
100mg/l pvp
‑
40、5
‑
10mg/l抗坏血酸、25
‑
35g/l蔗糖、2
‑
2.5g/l植物凝胶，ph值为5.75
‑
5.80；在进行所述酶解时，所使用的酶解液中含有2.0
±
0.5％的纤维素酶cellulose r
‑
10、1.0
±
0.5％的半纤维素酶hemicellulase、1.0
±
0.5％的离析酶macerozyme r
‑
10、1.0
±
0.5％的果胶酶pectolyase y
‑
23、0.5
‑
0.7m的甘露醇、18
‑
22mm的mes、18
‑
22mm的kcl、0.008
‑
0.012m的cacl2、0.18
‑
0.22％的bsa，ph值为5.75
‑
5.80；(3)将酶解液冷却至0
‑
6℃，而后与预冷的w5溶液混合，并用80
‑
120目的细胞筛过滤混合液；收集滤液并在0
‑
6℃、400
‑
600g离心5
‑
10min，弃上清；而后再利用预冷的改良的原生质体培养基重悬沉淀，并进行活化处理；所述w5溶液中含有8
‑
10g/l的nacl、0.12
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0.13m cacl2、4
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6mm kcl、1.5
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2.5mm mes和1.5
‑
2.0g/l的葡萄糖；所述改良的原生质体培养基是以km8p培养基为基础，添加35
‑
45g/l甘露醇、15
‑
25ml/l椰乳、0.20
‑
0.30g/l酶水解酪蛋白、1.5
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2.5mg/l的2,4
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d、0.15
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0.25mg/l的6
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ba，ph值为5.75
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5.80；所述活化处理具体为：在43
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47℃热激处理4.5
‑
5.5min，然后在
‑
2～4℃处理5
‑
15s；(4)将活化处理后的原生质体按2
‑
10
×
105cells/ml的接种密度接种于所述改良的原生质体培养基中，在24
±
2℃的黑暗环境下进行培养。10.一种监测毛竹原生质体培养及细胞壁再生情况的方法，其特征在于，包括：利用权
利要求1
‑
9中任一项所述的方法培养毛竹原生质体并诱导其细胞壁再生，其间对原生质体培养情况和/或细胞壁再生过程进行观察和记录。

技术总结
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种培养毛竹原生质体及诱导细胞壁再生的方法及其应用。本发明通过对来源于毛竹胚性愈伤组织的原生质体进行培养，诱导其再生出完整的细胞壁，再生效果优良且成功率高，同时再生结果还具有较高的重复性。此外，利用本发明的方法还可以对原生质体及细胞壁再生过程进行监测，为研究毛竹以及其他物种细胞壁合成与调控机理、材质改良以及生物质能源等领域的研究提供切实可行的模型，为改善竹材细胞壁的质量与产量提供了理论指导，对竹产业的建设发展具有深远影响和长远意义。有深远影响和长远意义。


技术研发人员：卢存福 耿新 陈玉珍 王晓静
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2021.07.13
技术公布日：2021/11/4