一种基于荧光定量PCR检测木薯绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法与流程

一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的引物、探针、试剂盒及方法。


背景技术：

2.木薯绵粉蚧phenacoccusmanihotimatile
‑
ferrero，属于半翅目（hemiptera）蚧总科（coccoidea）粉蚧科（pseudococcidae）绵粉蚧亚科（phenacoccinae）绵粉蚧属（phenacoccus），是一种世界性检疫害虫，也是目前我国口岸进出境检验检疫中的重要检疫害虫。木薯绵粉蚧嗜食木薯尤其是甜木薯，并常在木薯上暴发成灾，已有的研究表明，木薯绵粉蚧的寄主植物有15科27种加3属，包括农作物、园林植物、杂草和果树等。木薯绵粉蚧原产于南美洲中部，是当地木薯上的一种重要害虫，后随寄主植物及其产品传播扩散，陆续在西非、中非、东非发现，给非洲木薯产业造成巨大损失。木薯绵粉蚧在我国广东、广西、海南等省的绝大部分地区以及福建、江西、贵州、云南等省份部分地区高度适生，在重庆、四川等部分地区中度适生。
3.因此，尽快研发木薯绵粉蚧快速检测技术，加强对木薯绵粉蚧的监测检测，是保障我国木薯及蔬菜花卉产业和水果、棉花产业健康发展的必要前提。目前，针对木薯绵粉蚧phenacoccusmanihoti的检验方案即使用特异性ss
‑
coi引物对木薯绵粉蚧蛾进行普通pcr检测，公开号cn104293970a；该种采用普通pcr检测方法需做电泳检测，耗时较长，而实时荧光定量pcr技术不需经过电泳检测，省时省力，而且具有特异性强、灵敏度高等优点，但目前尚无针对木薯绵粉蚧p.manihoti的实时荧光定量pcr检测方法和试剂盒。因此，提供一种用于特异性检测木薯绵粉蚧的实时荧光定量pcr检测方法，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的引物和探针。
5.本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的试剂盒。
6.本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的方法。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案加以实现：一方面，本发明提供了一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的引物和探针，包括上游引物pm
‑
f1、下游引物pm
‑
r1、特异性探针pm
‑
probel，其核苷酸序列分别如下所示：pm
‑
f1: 5
’‑
acctttgatgatttcttcttctg
‑3’
；pm
‑
r1：5
’‑
tgaagtttaaagtaatgaaattttg
‑3’
；
pm
‑
probel：5
’‑
attttagattttgattactacttccttctt
‑3’
，其中，5’端标记的荧光基团是fam，3’端标记的淬灭基团是bhq1。
8.另一方面，本发明还公开了一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2中所述的检测引物和探针。
9.优选地，该基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的试剂盒，还包括以下成分的部分或全部：(1)模板；(2)阳性对照和阴性对照；(3)pcr 预混液。
10.优选地，所述阳性对照为重组质粒，阴性对照为ddh2o,所述pcr预混液为大连宝生物公司生产的takara premix ex tag。
11.再有，本发明还公开了一种基于荧光定量pcr检测木薯绵粉蚧的方法，包括以下步骤：1）待检样品dna的提取；2）荧光定量pcr反应体系的配制：将步骤1）中提取的待检样品dna加入荧光定量pcr反应体系，所述荧光定量pcr反应体系中含有权利要求1或2中所述的引物和探针；3）标准质粒构建：利用引物对pm
‑
f1/pm
‑
r1对木薯绵粉蚧dna进行常规pcr扩增；得到目的片段与puc57连接，再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，用于pcr鉴定并送杭州擎科生物有限公司进行测序验证；质粒鉴定正确后，用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为本发明方法的基因标准品；4）荧光定量pcr扩增：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量pcr反应体系于荧光定量pcr扩增仪上进行反应，反应程序如下：预变性95℃5min；然后变形95℃10sec，退火58℃30sec，循环40次，反应结束后，保存文件，打开分析软件；5）结果判断：通过观察荧光定量pcr的扩增情况判断检测结果。
12.优选地，荧光定量pcr反应体系为20μl反应体系，其含有10μm上下游引物各0.4μl，rox reference dye
ⅱꢀ
0.5μl，dna模板2μl，10μm taqman探针0.8μl，加ddh2o至20μl。
13.本发明利用实时荧光定量pcr技术，基于木薯绵粉蚧线粒体coi基因，设计特异性引物和taqman探针，建立快速、准确检测木薯绵粉蚧的试剂盒和方法，可以试剂盒的形式在我国口岸、木薯生产基地、有机蔬菜和有机水果生产基地、鲜切花生产基地、棉花种植区，以及蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。
14.本发明可快速准确实现木薯绵粉蚧p. manihoti与绵粉蚧属phenacoccus、灰粉蚧属dysmicoccus昆虫的鉴定，避免形态鉴定可能产生的混淆；与常规pcr相比，实时荧光定量pcr耗时大大缩短，仅需1h就能得到检测结果，同时特异性更强，灵敏度更高，检测的最低dna浓度可达10fg/ul，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。本发明的木薯绵粉蚧p. manihoti实时荧光定量pcr检测的引物、探针及试剂盒，能快速、准确地对木薯绵粉蚧p. manihoti进行检测。
附图说明
15.图1为本发明的引物pm
‑
f1/pm
‑
r1和探针pm
‑
probe1在木薯绵粉蚧mtdna上的位置示意图；图2为基于taqman探针的实时荧光pcr检测的标准曲线；
图3为荧光引物和探针的种特异性检验，图中，数字1：质粒dna；2：p. manihoti；3
‑
8：p.solani, phenacoccus sp., p. solenopsis, p.aceris, d.neobrevipes和阴性对照；图4为木薯绵粉蚧phenacoccusmanihoti荧光定量检测体系所用荧光引物和探针的灵敏性检测，图中，a
‑
g分别代表1.0ng/ul，100pg/ul，10pg/ul，1.0pg/ul，100fg/ul和10fg/ul。
具体实施方式
16.以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
17.依据目前研究成果，为保证所设计引物的特异性，我们选择了木薯绵粉蚧（phenacoccusmanihoti）及近缘种石蒜绵粉蚧（p.solani）、绵粉蚧（phenacoccus sp.）、扶桑绵粉蚧（p. solenopsis）、槭绵粉蚧（p.aceris）和外缘种新菠萝灰粉蚧（dysmicoccusneobrevipes），基于木薯绵粉蚧p. manihoti线粒体基因组的coi基因序列使用软件primer5设计引物pm
‑
f1/pm
‑
r1后，再根据扩增出来的特异性片段使用软件primer exprss设计探针pm
‑
probe1，可特异性扩增木薯绵粉蚧p. manihoti，引物和探针均由杭州擎科生物公司合成。
18.实施例1：dna提取使用以上六种成虫进行dna提取，虫体放入1.5ml离心管，加液氮磨成粉末状，提取dna采用德国qiagen公司的dneasy
®
tissue kit提取试剂盒，具体步骤参考试剂盒说明书进行。
19.实施例2：目标序列选取对木薯绵粉蚧phenacoccusmanihoti的mtdna中coi基因序列进行分析，选择突变率较高的序列片段作为扩增的目的片段。设计了多组实时荧光定量pcr引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测木薯绵粉蚧p. manihoti的荧光定量pcr引物和探针。
20.实施例3：特异性引物和探针设计针对所做类群，设计上游引物pm
‑
f1，下游引物pm
‑
r1，特异性探针pm
‑
probe1，pm
‑
f1: 5
’‑
acctttgatgatttcttcttctg
‑3’
；pm
‑
r1:5
’‑
tgaagtttaaagtaatgaaattttg
‑3’
，pm
‑
f1/pm
‑
r1的扩增产物长度为179bp；pm
‑
probe1：5
’‑
attttagattttgattactacttccttctt
‑3’
，探针的5’端以fam报告荧光基团标记，3’端以bhq1淬灭基团标记。
21.本发明的引物pm
‑
f1/pm
‑
r1和探针pm
‑
probe1在木薯绵粉蚧mtdna上的位置示意图见图1所示。
22.实施例4：标准质粒构建利用引物对pm
‑
f1/pm
‑
r1对木薯绵粉蚧dna进行常规pcr扩增；得到目的片段与puc57连接，再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，用于pcr鉴定并送杭州擎科生物有限公司进行测序验证；质粒鉴定正确后，用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为本发明方法的
基因标准品。
23.实施例5：实时荧光pcr检测实时荧光定量pcr扩增体系为20μl：2
×
taqman probe real
‑
time pcr master mixture 10μl（大连宝生物公司 takara premix ex tag），上下游引物（10μm）分别0.4μl，rox reference dye
ⅱꢀ
0.5μl，dna模板2μl，taqman探针（10μm）0.8μl，加ddh2o至20μl。实时荧光pcr扩增在cfx opus 96 real
‑
time pcr system定量pcr扩增仪上进行。打开“cfx opus 96 real
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time pcr system software”,设置pcr反应条件,两步法扩增反应程序:预变性95℃5min；然后变形95℃10sec，退火58℃30sec，循环40次。点击运行,进行pcr反应，1h左右反应结束，保存文件，打开分析软件。
24.实施例6：标准曲线建立以重组质粒为标准模板，以空质粒为阴性对照，将重组质粒进行10倍递减梯度稀释，每一浓度取2μl作为模板进行实时荧光定量pcr检测。分析结果显示，模板浓度越高，c
t
值越低，平行试验结果显示，dna浓度（x）与c
t
（y）具有相关性（x单位为ng/ul），其关系式为y=
‑
3.084x 12.148，见图2，相关系数较高，具体为r2=0.998（大于0.98），满足实时荧光定量pcr检测的要求，可用于木薯绵粉蚧的定量快速检测分析。
25.实施例7：荧光引物和探针的种特异性检验以6种粉蚧dna为模板，重组质粒为阳性对照、ddh2o为阴性对照，进行taqman qrt
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pcr特异性检测。检测结果显示，仅木薯绵粉蚧和重组质粒发出明显的荧光信号，有明显的扩增曲线生成，见图3所示，而其他5种粉蚧和阴性对照均无扩增，说明本专利设计的引物和探针具有较好的特异性。此检测体系可用于木薯绵粉蚧的检测鉴定分析。
26.实施例8：荧光引物和探针的灵敏性检测对纯化各稀释度的重组质粒进行taqmanqrt
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pcr检测,结果显示dna浓度为1.0ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1.0pg/ul、100fg/ul、10fg/ul时都能检测到明显的阳性扩增;而低于10fg/ul浓度的dna表现为阴性扩增,无荧光信号的增加。由此可见,所建立的taqmanqrt
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pcr最低可检测到10fg/ul，见图4所示。