一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制、实验方法及应用与流程

一种agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控机制、实验方法及应用
技术领域
1.本发明具体涉及一种agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控机制、实验方法及应用。


背景技术：

2.神经肌肉接头(neuromuscular junction，nmj)是神经元控制肌肉运动的结构单位，正常情况下，每根肌纤维只形成一个成熟的nmj。nmj发育异常会导致多种疾病，包括先天性肌无力综合症(congenital myasthenic syndrome，cms)，重症肌无力(myasthenic gravis，mg)和肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als)。研究表明agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路(agrin由突触前的运动神经元分泌，作为胞外配体作用于突触后的肌纤维)在脊椎动物nmj的发育过程中发挥极其重要的作用，遗传学研究发现敲除dok7会导致该信号通路无法激活以及无法诱导achr聚集，最终导致小鼠无法形成nmj并在出生后因无法呼吸而死亡。同时也有研究表明过表达dok7会导致该通路过度激活，导致每根肌纤维上形成多个nmj，同时伴随突触前运动神经元的突触囊泡数量减少与active zone面积变小等异常。这些研究说明agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活水平需要被精确调控从而保证nmj正常发育。目前的研究比较明确的揭示了agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活机制，但防止该信号通路过度激活的负调控机制还不是很清楚。
3.apc/c(anaphase promoting complex/cyclosome)是一种参与细胞周期调控的多亚基泛素连接酶，apc/c由十四个核心亚基组成，其中大多数亚基扮演支架蛋白的角色，核心亚基apc2是一个具有催化活性的亚基，apc/c介导底物泛素化时，还需要一个识别底物的亚基，这个亚基通常是cdc20或者cdh1(也被称作fzr1)中的一种。虽然apc/c是多亚基泛素化连接酶，但是研究发现在细胞中过表达apc2或者cdh1，都可以导致其底物的泛素化水平上升和蛋白水平的下降。研究表明apc/c在线虫神经元中可以调节谷氨酸受体glr
‑
1的蛋白水平。但apc/c在脊椎动物nmj发育中的功能和机制还有待研究。


技术实现要素：

4.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控机制、实验方法及应用。
5.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控方法，agrin促进dok7泛素化，并通过蛋白酶体系统降解，最终导致dok7蛋白水平下调，实现对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控。
7.进一步地，musk能够促进dok7的泛素化与降解；musk调控dok7泛素化依赖自身激酶活性以及与dok7的结合。
8.进一步地，dok7的泛素化位点是dok7第243位赖氨酸；dok7 lys243的泛素化负调控achr的聚集。
9.进一步地，过表达apc2促进dok7泛素化与降解；dok7泛素化依赖自身第106位酪氨酸磷酸化；dok7 tyr106磷酸化促进dok7二聚体化。
10.进一步地，agrin刺激肌管激活musk后，musk促进dok7 tyr106发生磷酸化，在cdh1的帮助下，apc2与tyr106磷酸化的dok7结合并介导dok7 lys243发生以k48连接方式为主的泛素化，促进dok7通过蛋白酶体系统降解，最终导致dok7蛋白水平下调，实现对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控。
11.一种研究agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控机制的实验方法，所述实验方法能够用于研究以上所述的负调控方法，包括以下步骤：
12.(1)在体外模拟体内的agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路激活过程，用agrin刺激c2c12分化的肌管，在不同的刺激时间点收集样品进行western blot检测；
13.(2)采用q
‑
pcr检测agrin刺激前后的lrp4，musk和dok7的mrna水平；
14.(3)在agrin刺激肌管前，预先用蛋白酶体抑制剂mg132和自噬
‑
溶酶体抑制剂cq处理肌管1h，然后再用agrin刺激肌管后收样进行western blot检测。
15.进一步地，通过转染泛素野生型质粒(ha
‑
ubi
‑
wt)、只保留第48位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒(ha
‑
ubi
‑
k48)和只保留第63位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒(ha
‑
ubi
‑
k63)来检测dok7泛素化的泛素连接方式。
16.进一步地，对dok7 tyr106磷酸化是否调控apc2
cdh1
对dok7的底物识别进行检测：在hek 293t细胞转染相应的质粒，转染24h后收样用gfp抗体对gfp
‑
dok7进行co
‑
ip，再用flag抗体检测co
‑
ip产物中与dok7结合的apc2蛋白水平。
17.进一步地，对agrin是否调控肌管内源性dok7与apc2的结合进行检测：用dok7的抗体co
‑
ip，再用apc2抗体检测co
‑
ip产物中与dok7结合的apc2蛋白水平。
18.一种agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控机制在维持正常的achr聚集与神经肌肉接头发育中的应用。
19.本发明的有益效果是：
20.(1)本发明中，agrin刺激能够诱导dok7与apc2的结合从而导致dok7发生泛素化；musk与dok7的结合以及musk依赖自身激酶活性对dok7 tyr106的磷酸化修饰是apc2介导dok7 lys243发生泛素化的前提条件；apc2在nmj突触后区域富集并负调控achr聚集与nmj发育。
21.(2)本发明着重对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控机制进行了探索。首先，在体外培养的肌管中模拟了agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活过程，经过检测发现agrin激活musk后导致dok7发生泛素化并通过蛋白酶体系统降解，并且musk的激酶活性对调控dok7泛素化是必需的。其次，结合过表达和敲低实验，发现apc/c的核心亚基apc2和底物识别亚基cdh1是介导dok7泛素化必需的，dok7tyr106被musk磷酸化后增强dok7与apc2的结合，从而促进dok7 lys243发生泛素化。最后，在体外培养的肌管和小鼠胫前肌中对dok7泛素化进行功能检测发现，敲低apc2抑制dok7泛素化后可以增强achr聚集。综上所述，本发明中公开了apc2
cdh1
通过促进dok7泛素化与降解从而实现对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控，避免agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的过度激活导致nmj发育异常。本发明的发现为深入了解神经肌肉接头发育的分子机制提供新的理论依据，也为开发相关疾病的治疗方法提供新的思路。
附图说明
22.图1是agrin促进dok7发生泛素化修饰并通过蛋白酶体系统降解的结果示意图；其中，(a)是agrin刺激肌管导致dok7蛋白水平降低的示意图；(b)是agrin刺激肌管4h，lrp4，musk和dok7的mrna水平检测结果示意图；(c)是agrin刺激促进dok7通过蛋白酶体系统降解的示意图(d)是图(c)的统计结果；(e)是agrin刺激诱导dok7泛素化的示意图。
23.图2是musk促进dok7泛素化与降解的结果示意图，其中，(a)是musk促进dok7泛素化的示意图；(b)是musk促进dok7降解的示意图；(c)是图(b)的统计结果；(d)是musk促进dok7通过蛋白酶体系统降解的示意图；(e)ip样品中dok7的泛素化水平示意图。
24.图3是musk调控dok7泛素化依赖自身激酶活性及与dok7结合的示意图，其中，(a)是ip样品中dok7泛素化水平示意图(b)是co
‑
ip样品中dok7泛素化水平与co
‑
ip样品中musk的蛋白水平示意图；(c)是co
‑
ip样品中dok7泛素化水平与musk的蛋白水平示意图，(d)质粒转染后，不同的chx处理时间点收样后进行western blot检测的结果示意图，(e)是图(d)的统计结果示意图。
25.图4中，(a)是ip样品中dok7的泛素化水平示意图，(b)是ph结构域的8个赖氨酸共同突变不影响dok7泛素化的示意图；(c)是用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平示意图；(d)是hek293t细胞转染相应质粒，在不同的chx处理时间点收样后进行western blot检测的结果示意图。
26.图5是dok7 lys243的泛素化负调控achr的聚集示意图，其中，(a)是不同种属dok7 k243及其周围氨基酸序列比对结果；红色标记为保守赖氨酸；(b)样品染色后的结果示意图，(c)是图(b)的统计结果；(d)是电转示意图；(e)胫前肌染色结果示意图(f)图(e)的统计结果。
27.图6是apc2促进dok7泛素化与降解的结果示意图，(a)dok7蛋白水平与e3表达结果示意图；(b)是图(a)的统计结果；(c)ip样品中dok7的泛素化水平的结果示意图，(d)apc2在c2c12分化前后的表达情况示意图；(e)过表达apc2导致肌管内源dok7蛋白水平降低的示意图。
28.图7是敲低apc2抑制dok7泛素化的示意图，(a)敲低apc2抑制musk调控的dok7泛素化的示意图；(b)敲低apc2抑制agrin诱导的dok7泛素化的示意图。
29.图8是cdh1是介导dok7泛素化的底物识别亚基的示意图，(a)敲低cdh1抑制dok7泛素化的示意图；(b)用q
‑
pcr检测cdc20 shrna敲低效率的结果示意图；(c)q
‑
pcr检测cdh1 shrna敲低效率的结果示意图。
30.图9是apc2定位于nmj并在突触后的肌管中富集的结果示意图，(a)apc2定位于nmj的示意图；(b)是小鼠膈肌分离突触区与非突触区示意图；(c)荧光定量pcr检测apc2 mrna在突触区和非突触区富集程度的示意图；(d)apc2在突触区富集的示意图。
31.图10是apc2负调控achr聚集与nmj发育的结果示意图，(a)过表达apc2抑制achr聚集的示意图；(b)图(a)的统计结果；(c)敲低apc2促进achr聚集的示意图；(d)图(c)的统计结果；(e)小鼠体内敲低apc2促进achr聚集的示意图；(f)是图(e)的统计结果；(g)图(e)的统计结果；对各组achr聚集的平均面积大小进行统计，每组三只小鼠，数值为mean
±
sem，**p<0.01。
32.图11是dok7 tyr106的磷酸化调控dok7泛素化的结果示意图，(a)ip产物中dok7的
泛素化水平的示意图(b)dok7 tyr106磷酸化促进dok7泛素化的示意图；(c)dok7 tyr106磷酸化促进dok7降解的示意图；(d)ip产物中dok7的酪氨酸磷酸化水平示意图。
33.图12是dok7 tyr106磷酸化促进dok7二聚体化的示意图，(a)co
‑
ip产物中与flag
‑
dok7结合的ha
‑
dok7蛋白水平的示意图；(b)dok7 tyr106磷酸化促进achr聚集的示意图；(c)图(b)的统计结果；图示为至少三次独立重复实验的结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。
34.图13是dok7 tyr106磷酸化促进dok7与apc2结合的示意图，(a)dok7氨基酸序列比对结果示意图，(b)是dok7 tyr106磷酸化促进dok7与apc2结合的示意图；(c)apc2特异性结合dok7的示意图；(d)agrin刺激促进dok7与apc2结合。在c2c12分化5d后用agrin刺激肌管，刺激1h后收样用dok7抗体co
‑
ip，再用apc2抗体检测co
‑
ip产物中与dok7结合的apc2蛋白水平。
具体实施方式
35.以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。本发明所采用的试剂、仪器等均能够通过商业途径购得。
36.1.2试剂与耗材
37.高糖dmem细胞培养基c11995500cp；gibco,胎牛血清fsp500；excell bio；马血清100
‑
508；gemcell；山羊血清16210064；gibco；10％青霉素/链霉素溶液sv30010；hyclone；无血清mem培养基31985
‑
070；gibco；0.05％胰酶25300
‑
054；gibco；1
×
pbs溶液c10010500cp；gibco；明胶(gelatin)g7041；sigma
‑
aldrich；泛素活化酶e1抑制剂pyr
‑
41 s7129；selleck；放线菌酮(chx)5087390001；sigma
‑
aldrich；26s蛋白酶体抑制剂mg132 c2211；sigma
‑
aldrich；氯喹(cq)c6628；sigma
‑
aldrich；脂质体核酸转染试剂40802es02；上海翊圣有限公司；嘌呤霉素(puromycin)a1113803；thermo；30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29:1)b546017；上海生工有限公司；temed t9281；sigma
‑
aldrich；sds l3771；sigma
‑
aldrich；apsa3678；sigma
‑
aldrich；tris a600194；上海生工有限公司；甘油g5516；sigma
‑
aldrich；溴酚蓝a100449；上海生工有限公司；bca法蛋白质定量试剂盒c503021；上海生工有限公司；脱脂奶粉a600669；上海生工有限公司；
38.pmsf 93482；sigma
‑
aldrich；蛋白酶抑制剂混合片a32953；thermo；蛋白磷酸酶抑制剂a32957；thermo；甘氨酸a100167；上海生工有限公司；无水甲醇a601617；上海生工有限公司；无水乙醇a500737；上海生工有限公司；triton x
‑
100 t8787；sigma
‑
aldrich；tween
‑
20 v900548；sigma
‑
aldrich；异丙醇a600918；上海生工有限公司；trizol 15596026；thermo；cdna synthesis kit 6210a；takara；sybr green mix a25780；thermo；2
×
primestar max mix r045a；takara；xho i 1094a；takara；kpn i 1068s；takara；hind iii 1060s；takara；xba i 1093s；takara；bamh i 1010s；takara；mlu i 1071a；takara；dpn i er1701；thermo；高保真phusion dna聚合酶f531s；thermo；多聚甲醛(pfa)158127；sigma
‑
aldrich；蔗糖a100335；上海生工有限公司；氯化钠a100241；上海生工有限公司；牛血清蛋白v900933；sigma
‑
aldrich；dapie607303；上海生工有限公司；封片剂e675005；上海生工有限公司；蛋白胨a505247；上海生工有限公司；酵母提取物a100850；上海生工有限公司；琼脂
粉a100637；上海生工有限公司；质粒小抽试剂盒d6943
‑
02；omega；质粒中抽试剂盒d6905
‑
03；omega；oct组织包埋剂4583；sakura；protein a/g plus
‑
agarose sc
‑
2003，santa
‑
cruz；荧光标记α
‑
bungarotoxin alomone labs；pvdf膜(0.45μm)88518；thermo；丽春红染色液c520005；上海生工有限公司；ripa裂解液c500005；上海生工有限公司；
[0039]2×
sds loading p0015b；碧云天生物科技有限公司；氨苄青霉素(ampicillin)a100339；上海生工有限公司；卡那霉素(kanamycin)a100408、上海生工有限公司；化学发光底物32132；thermo；超敏化学发光底物34095；thermo；
[0040]
1.3引物序列与质粒构建
[0041]
引物名称、引物序列(5'
→
3')分别为：
[0042]
apc2
‑
xhoi
‑
f:actcgagatggaggccgagggtgtggc；
[0043]
apc2
‑
kpni
‑
r:aggtaccgtgttggaattcttaggcaggc；
[0044]
dok7
‑
hindiii
‑
f:aaagcttatgaccgaggcggcgc；dok7
‑
xbai
‑
r:atctagaaggaggggggtttac；
[0045]
dok7
‑
xhoi
‑
f:actcgagatgaccgaggcggcgctgg；
[0046]
dok7
‑
kpni
‑
r:aggtaccgtaggaggggggtttaccttgag；
[0047]
dok7
‑
r158/159a
‑
f:tgtctgacctcgccgcgtacgggg；
[0048]
dok7
‑
r158/159a
‑
r:cggccccgtacgcggcgaggtcag；
[0049]
dok7
‑
r174a
‑
f:gaaggcgggaccgcctgtgggtac；
[0050]
dok7
‑
r174a
‑
r:gtacccacaggcggtcccgccttc；
[0051]
musk
‑
k608r
‑
f:cactatggtggccgtggcgatgcttaaggaagag；
[0052]
musk
‑
k608r
‑
r:ctcttccttaagcatcgccacggccaccatagtg；
[0053]
musk
‑
y553f
‑
f:ccatcccaaccccatgttccagaggatgccactcc；
[0054]
musk
‑
y553f
‑
r；ggagtggcatcctctggaacatggggttgggatgg；
[0055]
dok7
‑
k12r
‑
f:ggtggagggccaggtcaggctgcgggacggcaag；
[0056]
dok7
‑
k12r
‑
r:cttgccgtcccgcagcctgacctggccctccacc；
[0057]
dok7
‑
k17/18r
‑
f:gctgcgggacggcaggaggtggaagagtaggtg；
[0058]
dok7
‑
k17/18r
‑
f:cacctactcttccacctcctgccgtcccgcagc；
[0059]
dok7
‑
k17/18/20r
‑
f:gacggcaggaggtggaggagtaggtggctggtg；
[0060]
dok7
‑
k17/18/20r
‑
r:caccagccacctactcctccacctcctgccgtc；
[0061]
dok7
‑
k28r
‑
f:tggctggtgctgcggaggccgtcgcccgtggcagac；
[0062]
dok7
‑
k28r
‑
r:gtctgccacgggcgacggcctccgcagcaccagcca；
[0063]
dok7
‑
k42/44r
‑
f:ctggtctacagggacaggtcggagcgtatcaag；
[0064]
dok7
‑
k42/44r
‑
r:cttgatacgctccgacctgtccctgtagaccag；
[0065]
dok7
‑
k49r
‑
f:gtcggagcgtatcaggggcctgcgggagcgcagcag；
[0066]
dok7
‑
k49r
‑
r:ctgctgcgctcccgcaggcccctgatacgctccgac；
[0067]
dok7
‑
k123r
‑
f:agtggctccaggcaccaggttggagagcggcccgg；
[0068]
dok7
‑
k123r
‑
r:ccgggccgctctccaacctggtgcctggagccact；
[0069]
dok7
‑
k153r
‑
f:gtcacggggcagtggaggctgtctgacctccggcg；
[0070]
dok7
‑
k153r
‑
r:cgccggaggtcagacagcctccactgccccgtgac；
[0071]
dok7
‑
k207r
‑
f:gcatctcccccaccaggggcccctttgggctgcgg；
[0072]
dok7
‑
k207r
‑
r:ccgcagcccaaaggggcccctggtgggggagatgc；
[0073]
dok7
‑
k243r
‑
f；ccctacagctggagaggcggctgagcctcctctca；
[0074]
dok7
‑
k243r
‑
r：tgagaggaggctcagccgcctctccagctgtaggg；
[0075]
dok7
‑
y41a
‑
f:cctgctgatgctggtcgcaaaggacaagtcggagc；
[0076]
dok7
‑
y41a
‑
r:gctccgacttgtcctttgcgaccagcatcagcagg；
[0077]
dok7
‑
y71a
‑
f:gagcccggcctgcccgcagagggcctggtccacac；
[0078]
dok7
‑
y71a
‑
r:ggccctcgccgggcaggccgggctccagcccgc；
[0079]
dok7
‑
y106a
‑
f:ggatgcccggatccgcgctgcgctcggcgaggtg；
[0080]
dok7
‑
y106a
‑
r:cacctcgcccagcgcagcgcggatccgggcatcc；
[0081]
dok7
‑
y160a
‑
f:tctgacctccggcgcgcaggggccgtgccaagcg；
[0082]
dok7
‑
y160a
‑
r:cgcttggcacggcccctgcgcgccggaggtcaga；
[0083]
dok7
‑
y177a
‑
f:ggaccaggtgtggggcatgggctggcgtcttcttc；
[0084]
dok7
‑
y177a
‑
r:gaagaagacgccagcccatgccccacacctggtcc；
[0085]
dok7
‑
y349a
‑
f；ctcctctggctccagcagcctctcgtcctacgc；
[0086]
dok7
‑
y349a
‑
r:tgctggagccagaggagtggctgccagtggcgatg；
[0087]
dok7
‑
y355a
‑
f；ctcgtccggcgcgggcagcagcctggacgtgtg；
[0088]
dok7
‑
y355a
‑
r:tgcccgcggcggacgagaggctgctggagtaagag；
[0089]
dok7
‑
y395a
‑
f:ccgggacagtcgaggcccaggtgcccacctccctg；
[0090]
dok7
‑
y395a
‑
r:ggaggtgggcacctgggcctcgactgtcccgggca；
[0091]
dok7
‑
y405a
‑
f:ccctgcgggcccacgccgacacaccacgcagcctt；
[0092]
dok7
‑
y405a
‑
r:ctgcgtggtgtgtcggcgtgggcccgcagggaggt；
[0093]
q
‑
pcr
‑
gapdh
‑
f:atggtgaaggtcggtgtgaac；qpcr
‑
gapdh
‑
r:agtggagtcatactggaacatg；qpcr
‑
musk
‑
f:tgaagctggaagtggaggtttt；qpcr
‑
musk
‑
r:gcagtagggttacaaaggaa；
[0094]
qpcr
‑
lrp4
‑
f:gctatggcagagcctagagaa；qpcr
‑
lrp4
‑
r:cgaccagcgtagtcgatgg；
[0095]
qpcr
‑
dok7
‑
f:atgaccgaggcggcgctggtg；qpcr
‑
dok7
‑
r:gaccagcatcagcaggcagtc；
[0096]
qpcr
‑
cdc20
‑
f:gaccactcctagcaaacctgg；qpcr
‑
cdc20
‑
r:gggcgtctggctgttttca；
[0097]
qpcr
‑
cdh1
‑
f:gaccgctgtatccgcttctg；qpcr
‑
cdh1
‑
r:ggtcagggaggggtacttcc；
[0098]
qpcr
‑
cdh1
‑
f:gagatgcggagaaccctgac；qpcr
‑
cdh1
‑
r:tggaagttcacgctccagttg；
[0099]
qpcr
‑
apc1
‑
f:aagggcaacgatgattgcag；qpcr
‑
apc1
‑
r:tgcaccatcagaagaccataac；
[0100]
qpcr
‑
apc2
‑
f:agcgcctctatggtcgtttc；qpcr
‑
apc2
‑
r:taccggctatctagctcaccc；
[0101]
qpcr
‑
apc3
‑
f:accagataacgtcccccttg；qpcr
‑
apc3
‑
r:ctccaggacttggggtttct；
[0102]
qpcr
‑
apc4
‑
f:ctgcgctttccgacctgtt；qpcr
‑
apc4
‑
r:aaaacctcgcctgtagtgttg；
[0103]
qpcr
‑
apc5
‑
f:cctgcgccacatgatcttg；qpcr
‑
apc5
‑
r:ttttctccccgttctggaagt；
[0104]
qpcr
‑
apc6
‑
f:gcacctctgcaaaactccac；qpcr
‑
apc6
‑
r:tgctgtggtctgacatagacg；
[0105]
qpcr
‑
apc7
‑
f:tgagctgttttccccgtcg；qpcr
‑
apc7
‑
r:ccgcactttggaagtcttact；
[0106]
qpcr
‑
apc8
‑
f:agacacccacctctgacacg；qpcr
‑
apc8
‑
r:actgaagacaggttgagtggag；
[0107]
qpcr
‑
apc10
‑
f:atgaccacaccgaacaagaca；qpcr
‑
apc10
‑
r:
tcccgtaattgatccactccaa；
[0108]
qpcr
‑
apc11
‑
f:gatggcgtttaatggctgctg；qpcr
‑
apc11
‑
r:tccactcctggcgacacat；
[0109]
qpcr
‑
apc12
‑
f:gaaggtgtaggaaccagcgat；qpcr
‑
apc12
‑
r:gcggttgttgctcttgagttg；
[0110]
qpcr
‑
apc13
‑
f:tgaggtacagcgagatggaag；qpcr
‑
apc13
‑
r:ggaagctcactcagtggaatg；
[0111]
qpcr
‑
apc15
‑
f:tgcaagacatggatgagatgaatg；
[0112]
qpcr
‑
apc15
‑
r:tcctgttcgttgccttccat；qpcr
‑
apc16
‑
f:gtcaccggatctggtttcagt；
[0113]
qpcr
‑
apc16
‑
r:caccgactcacagaggaatcg；
[0114]
本发明中shrna序列均构建在pu6
‑
rfp(lt88024；山东维真生物科技公司)载体bamhi和mlui酶切位点之间。靶向具体基因的shrna序列如下，human
‑
apc2
‑
shrna1
‑
f：
[0115]
5'
‑
gatcgcggcgttcatcggacatcatctcgagatgatgtccgatgaacgccgcttttt
‑
3'，
[0116]
human
‑
apc2
‑
shrna1
‑
r：
[0117]
5'
‑
cgcgaaaaagcggcgttcatcggacatcatctcgagatgatgtccgatgaacgccgc
‑
3'；
[0118]
human
‑
apc2
‑
shrna2
‑
f：
[0119]
5'
‑
gatccctctatatctctgccatcaactcgagttgatggcagagatatagaggttttt
‑
3'，
[0120]
human
‑
apc2
‑
shrna2
‑
r：
[0121]
5'
‑
cgcgaaaaacctctatatctctgccatcaactcgagttgatggcagagatatagagg
‑
3'；
[0122]
mouse
‑
apc2
‑
shrna1
‑
f：
[0123]
5'
‑
gatcccacgtacagagattcttctactcgagtagaagaatctctgtacgtggttttt
‑
3'，
[0124]
mouse
‑
apc2
‑
shrna1
‑
r：
[0125]
5'
‑
cgcgaaaaaccacgtacagagattcttctactcgagtagaagaatctctgtacgtgg
‑
3'；
[0126]
mouse
‑
apc2
‑
shrna2
‑
f：
[0127]
5'
‑
gatcacgaccttcaaggcaatattgctcgagcaatattgccttgaaggtcgtttttt
‑
3'，
[0128]
mouse
‑
apc2
‑
shrna2
‑
r：
[0129]
5'
‑
cgcgaaaaaacgaccttcaaggcaatattgctcgagcaatattgccttgaaggtcgt
‑
3'；
[0130]
human
‑
cdc20
‑
shrna1
‑
f：
[0131]
5'
‑
gatcagaccaacccatcacctcagtctcgagactgaggtgatgggttggtctttttt
‑
3'，
[0132]
human
‑
cdc20
‑
shrna1
‑
r：
[0133]
5'
‑
cgcgaaaaaagaccaacccatcacctcagtctcgagactgaggtgatgggttggtct
‑
3'；
[0134]
human
‑
cdc20
‑
shrna2
‑
f：
[0135]
5'
‑
gatctggtggtaatgataacttggtctcgagaccaagttatcattaccaccattttt
‑
3'，
[0136]
human
‑
cdc20
‑
shrna2
‑
r：
[0137]
5'
‑
cgcgaaaaatggtggtaatgataacttggtctcgagaccaagttatcattaccacca
‑
3'；
[0138]
human
‑
cdh1
‑
shrna1
‑
f：
[0139]
5'
‑
gatcgtgaacttccacaggattaacctcgaggttaatcctgtggaagttcacttttt
‑
3'，
[0140]
human
‑
cdh1
‑
shrna1
‑
r：
[0141]
5'
‑
cgcgaaaaagtgaacttccacaggattaacctcgaggttaatcctgtggaagttcac
‑
3'；
[0142]
human
‑
cdh1
‑
shrna2
‑
f：
[0143]
5'
‑
gatcagaagggtctgttcacgtattctcgagaatacgtgaacagacccttctttttt
‑
3'，
[0144]
human
‑
cdh1
‑
shrna2
‑
r：
[0145]
5'
‑
cgcgaaaaaagaagggtctgttcacgtattctcgagaatacgtgaacagacccttct
‑
3'。
[0146]
构建shrna质粒时，先将合成的序列用无菌ddh2o稀释成100μm的储存液备用，经过退火让互补的正反两条核苷酸链形成双链后再和酶切后的载体连接，退火反应体系如下：
[0147]
试剂名称及试剂用量(μl)分别为；ddh2o8μl，f序列5μl，r序列5μl，10
×
退火缓冲液2μl，
[0148]
加好上述反应体系后，98℃加热10min后自然降温至室温即可，降温过程需缓和，可以在降温时用纱布盖在金属恒温器上防止降温过快。
[0149]
pu6
‑
rfp载体因为bamhi和mlui无适用的双酶切体系，只能分两次单酶切，每次单酶切都需要割胶回收。最后割胶回收的产物可以用于和上述退火后的产物进行连接。连接反应体系如下：
[0150]
试剂名称及试剂用量(μl)分别为ddh2o 4μl；割胶回收载体1.5μl；退火产物3μl；10
×
连接缓冲液1μl；t4连接酶0.5μl；
[0151]
按照上述体系加好后，轻轻混匀并离心后可于16℃进行连接反应。一般连接三小时即可。
[0152]
pcdna3.1
‑
dok7
‑
flag质粒购自长沙优宝生物科技公司；将dok7序列插入gfp
‑
n1载体所用酶切位点为xhoi和kpni，将dok7序列插入pkh3
‑
ha载体所用酶切位点为hindiii和xbai。apc2
‑
flag,ube3a
‑
flag,nedd4
‑
flag,klhl8
‑
flag和rnf31
‑
flag购自长沙优宝生物科技公司；trim63
‑
flag和pdzrn3
‑
flag购自淼灵生物科技公司。构建gfp
‑
apc2质粒时所用酶切位点为xhoi和kpni。获取目的基因片段的pcr反应提下如下：
[0153]
试剂名称及试剂用量(μl)分别为：ddh2o 29μl；混合型dntp 2μl；f引物 2μl；r引物 2μl；10
×
hf缓冲液 4μl；模板质粒 0.5μl；phusion高保真dna聚合酶 0.5μl；
[0154]
按照上述体系加好后轻轻混匀并离心后即可进行pcr反应，pcr反应条件如下：
[0155]
温度及时间分别为：98℃ 10min；98℃ 30s；55℃30s；72℃dok7设置2min；apc2设置5min；72℃ 10min；
[0156]
设置循环数为35，pcr反应完成后获得的pcr产物需经琼脂糖凝胶电泳后进行割胶回收，再进行双酶切，双酶切后清洁回收即可用于连接反应。载体经过双酶切后割胶回收备用即可。xhoi和kpni的双酶切体系如下：
[0157]
试剂名称与试剂用量(μl)分别为：ddh2o12μl；10
×
m缓冲液4μl；割胶回收产物 20μl；xhoi 2μl；kpni 2μl；
[0158]
hindiii和xbai的双酶切体系如下：
[0159]
试剂名称及试剂用量(μl)分别为ddh2o 12μl；10
×
m缓冲液 4μl；割胶回收产物 20μl；hindiii 2μl；xbai 2μl；
[0160]
载体进行双酶切时，只需将反应体系中的割胶回收产物替换为载体即可，用量以不超过2μg为宜，反应用体积用ddh2o补齐至40μl。按照上述体系加好后轻轻混匀并离心，用封口膜封住ep管盖置于37℃水浴锅孵育两小时即可。孵育期间可进行一到两次离心将蒸发到管盖及管壁上的溶液离心到管底。连接反应和构建shrna质粒相同。
[0161]
构建dok7和musk点突变质粒时，pcr反应体系如下：
[0162]
试剂名称及试剂用量(μl)分别为：ddh2o7.5μl；f引物1μl；r引物1μl；2
×
primestar max mix 10μl；模板质粒0.5μl；
[0163]
按照上述体系加好后轻轻混匀并离心，盖紧pcr管盖即可进行pcr反应。pcr反应条件设置如下：
[0164]
温度与时间分别为：98℃ 10min；98℃ 20s；55℃20s；72℃5min；72℃ 10min；
[0165]
设置反应循环数为35，pcr反应完成后用dpni对pcr产物进行消化后即可转化dh5α感受态。pcr产物消化反应体系如下：
[0166]
试剂名称及试剂用量分别为ddh2o 6μl；10
×
cutsmart缓冲液2μl；pcr产物10μl；dpni 2μl；
[0167]
按照上述体系加好后轻轻混匀并离心，用封口膜封住ep管盖后于37℃水浴锅孵育两小时即可。孵育期间可进行一到两次离心将蒸发到管盖及管壁上的溶液离心到管底。
[0168]
构建dok7
‑
8kr，dok7
‑
3ra，dok7
‑
2ya和dok7
‑
3ya四种多位点突变的质粒时，按突变位点在氨基酸序列中的顺序依次进行突变，比如构建dok7
‑
8kr时，先对第12位lys进行突变得到dok7
‑
k12r突变体，在此突变的基础上再对lys17/18进行突变，获得dok7
‑
k12/17/18r的三突变体，再在这个突变质粒的基础上对lys20进行突变，获得dok7
‑
k12/17/18/20r的四突变体质粒，以此类推，直至获得dok7
‑
8kr突变体。每进行一次点突变所获得的质粒都必需经过测序确认序列正确后才可以用于下一步实验。
[0169]
1.4试剂配制与使用说明
[0170]
试剂名称、配制方法与使用说明分别为：
[0171]
0.3％gelatin：0.3g gelatin，ddh2o溶解并定容至100ml。搅拌至gelatin充分溶解后高温高压灭菌，室温可储存两个月。1m tris
‑
hcl(ph 6.8)：12.11g tris
‑
base，ddh2o溶解，浓盐酸调节ph至6.8后用ddh2o定容至100ml。室温可储存一个月。1.5m tris
‑
hcl(ph 8.8)：18.17g tris
‑
base，ddh2o溶解，浓盐酸调节。ph至8.8后用ddh2o定容至100ml。室温可储存一个月。蛋白电泳缓冲液：1g sds，3.03g tris
‑
base，14.4g甘氨酸，ddh2o溶解并定容至1l。现配现用。
[0172]
蛋白转膜缓冲液：3.03g tris
‑
base，14.4g甘氨酸，200ml无水甲醇，ddh2o定容至1l。现配现用；4℃预冷后使用。10
×
tbs buffer：30g tris
‑
base，80g氯化钠，2g氯化钾，ddh2o溶解，浓盐酸调节ph至7.4后用ddh2o定容至1l。室温储存。1
×
tbs buffer：量取10
×
tbs 100ml，ddh2o定容至1l。室温储存。1
×
tbst buffer：1l 1
×
tbs中加1ml tween 20混匀即可。室温储存。western blot封闭液：5g脱脂奶粉，1
×
tbs溶解并定容至100ml。现配现用；若用于稀释一抗并回收利用，可加入终浓度为0.1％nan3。免疫荧光染色封闭液：1g bsa，10ml 1.5m氯化钠溶液，0.5ml羊血清，0.1ml triton x
‑
100，1
×
pbs定容至100ml。4℃储存；若用于稀释一抗并回收利用，可加入终浓度为0.1％nan3。4％pfa：
[0173]
4g pfa，1
×
pbs溶解，浓盐酸调节ph至7.4后用1
×
pbs定容至100ml。搅拌至pfa粉末充分溶解后过滤；4℃储存。30％蔗糖溶液：30g蔗糖溶于1
×
pbs溶液，定容到100ml。4℃保存。10
×
退火缓冲液：1.17g氯化钠，1ml ph8.0 tris
‑
hcl(1m)，ddh2o定容至10ml。常温储存。netn buffer：
[0174]
50mm tris(ph 8.0)；150mm氯化钠，1％np
‑
40，1mm edta。4℃储存；使用时需加入1mm pmsf和蛋白酶抑制剂混合片。
[0175]
1.5抗体
[0176]
抗体名称、货号分别为：
[0177]
mouse anti
‑
gapdh 60004
‑1‑
ig；rabbit anti
‑
p
‑
musk(p
‑
tyr755)d151396；
[0178]
mouse anti
‑
p
‑
tyrosine4g10；rabbit anti
‑
dok7 d152405；mouse anti
‑
myc sc
‑
40；
[0179]
mouse anti
‑
flag66008
‑3‑
ig；rabbit anti
‑
flag 20543
‑1‑
ap；mouse anti
‑
ubiquitin sc
‑
8017；
[0180]
mouse anti
‑
gfp sc
‑
9996；mouse anti
‑
sv2 sv2；mouse anti
‑
nf 2837s；rabbit anti
‑
apc2 13559
‑1‑
ap；
[0181]
rabbit anti
‑
ha 51046
‑2‑
ap；rabbit anti
‑
lc3 14600
‑1‑
ap；mouse anti
‑
lrp4 n207/27；
[0182]
rabbit anti
‑
musk d221816；hrp labeled goat anti
‑
mouse igg 31430；
[0183]
hrp labeled goat anti
‑
rabbit igg 31460；goat anti
‑
mouse igg(h l)secondary antibody，alexa fluor 488 a11029；goat anti
‑
mouse igg(h l)secondary antibody，alexa fluor 633 a21052；goat anti
‑
rabbit igg(h l)secondary antibody，alexa fluor 488 a11008；
[0184]
1.6动物
[0185]
本研究使用的小鼠均为c57/b6野生型，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；动物饲养与使用均符合浙江大学实验动物伦理委员会相关规定。
[0186]
1.7免疫沉淀和免疫共沉淀(immunoprecipitation and co
‑
immunoprecipitation，ip and co
‑
ip)
[0187]
1)该实验需提前准备无菌细胞刮与无菌ep管并预冷离心机至4℃。将细胞从培养箱中取出后用真空泵吸去培养基，用5ml预冷的1x pbs轻轻洗去细胞表面残留的培养基后重新加入1ml预冷的1
×
pbs，用无菌细胞刮将细胞从培养皿刮离，将含有细胞的1ml细胞悬液吸取到无菌ep管中并置于冰上。
[0188]
2)所有细胞悬液收集完成后，12,000rpm 4℃离心1min，弃上清留沉淀(即细胞)。向收集的细胞中加入600μl netn溶液(含有1mm pmsf和蛋白酶抑制剂；检测dok7酪氨酸磷酸化时还需加入蛋白磷酸化酶抑制剂)，轻轻吹打重悬细胞后将其置于冰上裂解15min。
[0189]
3)14,000rpm 4℃离心20min；吸取50μl上清到无菌ep管中留作input，置于
‑
20℃保存；从剩余的上清中吸取500μl到无菌ep管中进行后续ip或co
‑
ip，向该部分上清中加入1μg抗体和30μl protein a/g plus
‑
agarose，盖紧管盖并用封口膜密封后4℃旋转孵育过夜。
[0190]
4)次日，1,200rpm 4℃离心3min，轻轻吸去上清，保留沉淀(即protein a/g plus
‑
agarose)；向管中加入1ml netn溶液(含有1mm pmsf和蛋白酶抑制剂；检测dok7酪氨酸磷酸化时还需加入蛋白磷酸化酶抑制剂)，4℃旋转对非特异性结合蛋白质进行清洗，每次10min共三次；清洗结束后，1,200rpm 4℃离心3min，吸去上清，保留protein a/g plus
‑
agarose沉淀，
‑
20℃保存。
[0191]
5)向input样品和co
‑
ip后收集的protein a/g plus
‑
agarose分别加入50μl 2
×
sds loading，金属浴98℃15min后自然降温至室温，input样品即可用于western blot检
anti
‑
p
‑
tyrosine 1:1,000；hrp labeled goat anti
‑
rabbit igg 1:5,000；hrp labeled goat anti
‑
mouse igg 1:5,000；
[0199]
6)次日，回收含有抗体的溶液，4℃保存；1
×
tbst洗膜，室温洗三次，每次10min；加入与一抗种属对应的封闭液稀释的hrp标记的二抗，室温孵育1h；弃去含有二抗的封闭液，1
×
tbst洗膜，室温洗三次，每次10min；1
×
tbs洗膜，室温洗一次，5min。
[0200]
7)显影：显影均采用ecl化学发光法；将膜平铺在干净的透明塑料膜上，在膜上轻轻滴加2ml ecl显影混合液，在膜上再覆盖一层干净的透明塑料膜即可进入暗室显影；根据检测的目标蛋白信号强弱对压片时间进行调节；压片后x
‑
ray film先于显影液浸泡1min，ddh2o漂洗30s后再于定影液浸泡1min后重新转移到ddh2o中即可。
[0201]
8)晾干x
‑
ray film并用扫描仪进行结果记录。也可用bio
‑
rad化学发光仪对pvdf进行信号采集。
[0202]
1.9小鼠胫前肌电转
[0203]
1)转染dok7质粒的小鼠均为两周龄；转染shrna质粒的小鼠均为一周龄；电转所用质粒均为中抽，浓度为1μg/μl；电转部位为胫前肌(tibialis anterior muscle，ta muscle)，转染质粒总量为5μg。
[0204]
2)小鼠麻醉后，手术暴露胫前肌，用微量注射器吸取5μl质粒并注射到胫前肌，推针速度要慢，中一般30s推完；针头停留20s后再拔出防止质粒溶液渗出肌肉组织。注射不同质粒时需用ddh2o清洗注射器防止污染。
[0205]
3)电转参数设置为70v，5pulses，50ms per pulse，1s interval。
[0206]
4)电转完成后将小鼠放回笼中继续饲养；一周后取样检测。
[0207]
1.10小鼠成肌细胞的传代与分化及agrin诱导achr聚集
[0208]
1)小鼠成肌细胞c2c12细胞传代代数不宜过多(一般不超过十代)，需及时冻存，用于冻存的细胞密度不宜过密，最好保证细胞间无接触。传代培养基为高糖dmem(含有20％fbs和1％的p/s)；分化培养基为高糖dmem(含有2％hs和1％p/s)；诱导细胞分化前，需用0.3％gelatin对培养器材进行包被，以12孔板为例，每孔加入1ml 0.3％gelatin后置于细胞培养箱16h即可，种植细胞前用真空泵吸去0.3％gelatin，用1
×
pbs清洗并吸去pbs后即可用于实验。
[0209]
2)诱导细胞分化时，可以让细胞先在生长培养基中达到约40％的汇合度时进行胰酶消化并种植到0.3％gelatin包被的12孔板中，种植细胞数量以保证每孔细胞贴壁后汇合度约80％为宜，24h后细胞汇合度可达到90％，此时可将生长培养基弃去，重新加入分化培养基诱导细胞分化。
[0210]
3)分化培养基每24h更换一次，一般3
‑
4d即可看到分化形成的肌管，6d达到高峰；可用agrin处理肌管诱导achr聚集。
[0211]
4)用agrin刺激肌管时，每孔加入1.5ml新鲜的分化培养基和0.5ml的agrin溶液，轻轻混匀后置于细胞培养箱即可，根据实验目的在不同时间点收取细胞样品即可；若需染色观察achr聚集，则agrin需刺激肌管至少16h。
[0212]
5)若对c2c12细胞进行质粒转染，转染时间点需选择在铺板后的5h以内，细胞贴壁即可进行。若细胞形态已完全伸展，伪足明显，这种情况下转染效率极低。
[0213]
6)脂质体转染试剂对c2c12的分化有一定的抑制作用，中转染c2c12脂质体用量标
准为12孔板每孔不超过3μl，6cm培养皿不超过8μl；并且转染后换液要及时，中换液时间均控制在6h左右。
[0214]
1.11 agrin的表达与收集
[0215]
1)采用在hek 293t细胞中过表达agrin的方法获得实验所需的agrin。当hek 293t细胞汇合度达到70％时进行转染，以10cm培养皿为例，转染8μg flag
‑
agrin质粒。
[0216]
2)转染24h后，将培养基更换为诱导agrin分泌到胞外的分泌培养基，即高糖dmem(含有0.5％fbs和1％p/s)，因此时细胞汇合度较高，需及时监测分泌培养基状态保证及时更换新鲜的分泌培养基，避免分泌培养基变黄。
[0217]
3)每次更换新鲜的分泌培养基前，收集培养皿中的分泌培养基至无菌管中，3,000rpm室温离心10min去除细胞碎片，吸取上清至新的无菌管中，置于
‑
20℃保存，可保存三个月。
[0218]
4)收集的agrin用于刺激肌管前，取少量进行western blot检测，确定其中含有agrin后再用于后续实验。
[0219]
1.12细胞转染与处理
[0220]
1)细胞转染均采用脂质体转染法，转染过表达质粒时质粒用量与脂质体比例为1：2(即1μg质粒需用2μl脂质体)；转染shrna质粒时质粒用量与脂质体比例为1：3(即1μg质粒需用3μl脂质体)。转染前先预热opti
‑
mem培养基至37℃；将装有质粒的ep管和装有预热opti
‑
mem培养基的离心管以及脂质体核酸转染试剂表面用酒精棉擦拭干净后放置于无菌操作台；取两个1.5ml无菌ep管，每管加入100μl预热的opti
‑
mem培养基，再向其中一管加入计算好的预期转染质粒用量，另一管则加入对应量的脂质体核酸转染试剂，轻轻混匀后盖好管盖室温静置5min后将混有质粒的opti
‑
mem培养基溶液全加入到混有脂质体核酸转染试剂的opti
‑
mem培养基中，轻轻混匀后盖好管盖，室温孵育15min。孵育期间对即将转染的细胞进行换液，吸去旧培养基后加入适量预热的opti
‑
mem培养基并放回培养箱即可，本实验中12孔板为每个培养孔加2ml，6孔板每个培养孔加3ml，6cm培养皿加6ml。孵育结束后，将ep管中的质粒和脂质体核酸转染试剂混合物轻轻滴加到上述刚换过opti
‑
mem培养基的细胞中，轻轻倾斜培养皿让培养基来回旋转流动几次加以混匀后放回培养箱即可。
[0221]
2)转染shrna质粒的hek 293t细胞在转染36h后，用终浓度5μm的嘌呤霉素对细胞进行处理，每隔12小时换液时都重新加入嘌呤霉素；连续处理36h后收集细胞样品进行相关检测。
[0222]
3)chx处理细胞时，若进行多时间点处理，则均在转染16h后进行；若进行单一时间点处理，则在转染24h后进行。chx处理细胞所用的终浓度为10μm。
[0223]
4)pyr
‑
41处理细胞时，均在转染8h后进行。pyr
‑
41处理细胞所用的终浓度为60μm。
[0224]
5)mg132和cq处理细胞时，均在转染24h后进行。mg132和cq处理细胞所用的终浓度为10μm。
[0225]
6)转染后细胞用于ip或co
‑
ip实验时，除转染shrna的细胞外，均为转染24h后收样。
[0226]
1.13细胞免疫荧光染色
[0227]
1)涉及的细胞免疫荧光染色为c2c12细胞分化融合的肌管染色；以对在12孔板中培养的肌管染色为例，首先弃去培养基，再向每个培养孔加入1ml预冷的1
×
pbs轻轻洗去培
养孔中残留的培养基，室温水平摇床低速处理5min即可；弃去1
×
pbs，再向每个培养孔加入1ml预冷的4％多聚甲醛对细胞进行固定，室温水平摇床低速处理15min即可；弃去多聚甲醛，用1
×
pbs室温洗5min后弃去1
×
pbs，加入1ml 0.3％triton x
‑
100对细胞进行通透，室温水平摇床低速处理10min即可。
[0228]
2)弃去0.3％triton x
‑
100，向每个培养孔加入1ml免疫荧光染色封闭液进行封闭，室温水平摇床低速处理1h即可；弃去封闭液，向每个培养孔加入适量的用免疫荧光染色封闭液稀释的一抗抗体，盖好盖子后4℃水平摇床低速孵育过夜。涉及的用于细胞免疫荧光染色的鼠源flag抗体稀释倍数为1:1,000，btx为1:5,000。
[0229]
3)回收含有抗体的封闭液，4℃保存；向每个培养孔加1ml 1
×
pbst洗去未结合抗原的残余抗体，室温水平摇床低速洗10min，重复洗三次。
[0230]
4)加入对应的荧光二抗和荧光标记的btx，避光室温水平摇床低速孵育2h；回收荧光二抗和荧光标记的btx，4℃避光保存。
[0231]
5)向每个培养孔加1ml 1
×
pbs，再加1μl dapi母液，室温避光低速水平摇床孵育10min。
[0232]
6)弃去dapi染色液；向每个培养孔加1ml 1
×
pbst，室温水平摇床低速洗10min，重复洗三次。
[0233]
7)向每个培养孔加1ml 1
×
pbs后在蔡司倒置荧光显微镜下采集图像；样品可4℃避光保存。采集图像时需将培养皿盖子取下。
[0234]
1.14组织切片免疫荧光染色
[0235]
1)设计的组织切片均为胫前肌切片；两月龄小鼠麻醉后进行心脏灌流；灌流完成后，取胫前肌置于4％pfa固定24h；将胫前肌取出并置于30％蔗糖溶液进行脱水，待组织由悬浮状态转变为沉底即可，一般需24h。
[0236]
2)将肌肉组织水平横放于包埋盒中，并滴加oct组织包埋剂，此时可调整肌肉组织的位置，中均将肌肉组织调整与包埋盒边缘平行。静置于
‑
80℃冷冻。
[0237]
3)待oct组织包埋剂凝固后，肉眼可见其颜色由放入冰箱前的透明变为白色，即可进行切片，组织切片厚度均为25μm。
[0238]
4)标记好样品名称，将贴于载玻片的组织切片室温晾干，一般20min即可，晾干后可于
‑
80℃储存。
[0239]
5)对肌肉切片进行染色时，首先将贴附有组织切片的载破片放置在合适容器中，轻轻的向容器中加入漫过载玻片的1
×
pbs溶液室温清洗10min，这一步骤是为了洗去组织切片所携带的oct凝胶，可以帮助避免由于oct凝胶对抗体的非特异性吸附导致的非特异性染色结果。清洗完成后，弃去1
×
pbs,加入适量的预冷的4％多聚甲醛溶液，室温固定20min；固定完成后弃去多聚甲醛溶液，加入适量的0.5％的triton x
‑
100溶液对组织切片进行通透处理，室温处理20min；通透处理完成后弃去0.5％的triton x
‑
100溶液，加入适量的免疫荧光染色封闭液，室温封闭1h；封闭完成后，弃去免疫荧光染色封闭液，并用吸水纸将载玻片边缘液体吸干，在载玻片中央滴加约200μl的用免疫荧光染色封闭液稀释的一抗抗体溶液，然后剪裁一张长度和宽度均小于载玻片的封口膜，将封口膜轻轻的贴在上述200μl一抗溶液即可。置于4℃孵育过夜，要保证载玻片水平放置，防止漏液导致抗体孵育不均以及切片干燥导致的非特异性染色。组织切片免疫荧光染色所用的apc2抗体稀释倍数为1:500。
[0240]
6)封片：在载玻片贴附组织切片面轻轻滴加适量封片剂，放置一片盖玻片于封片剂上，用圆头镊子轻轻按压盖玻片四周让封片剂充满载玻片与盖玻片的结合面即可，在盖玻片周围滴加适量透明指甲油进行密封固定，室温放置6h待指甲油凝固即可。染色完成后的样品可于4℃避光储存。
[0241]
7)在尼康a1r倒置激光共聚焦显微镜下用z
‑
stack程序采集图像。
[0242]
1.15肌肉组织whole
‑
mount免疫荧光染色
[0243]
1)小鼠麻醉并处死后，解剖取出胫前肌后将胫前肌置于预冷的4％多聚甲醛中。
[0244]
2)将完整胫前肌置于4％多聚甲醛中在4℃水平摇床上固定24h。
[0245]
3)用眼科镊将胫前肌分离成直径不超过1mm的肌纤维束后继续在4℃水平摇床上固定24h。
[0246]
4)弃去pfa，将肌纤维转移到无菌15ml离心管中，加入10ml 1
×
pbs洗去残留的pfa。
[0247]
5)弃去pbs，向15ml离心管中加入5ml 0.5％triton x
‑
100对肌纤维进行通透处理，放在室温水平摇床上处理3h即可。
[0248]
6)弃去triton x
‑
100，将肌纤维转移到无菌ep管中；加入1ml免疫荧光染色封闭液，放在室温旋转摇床处理1h即可。肌肉组织whole
‑
mount免疫荧光染色所用的apc2，nf和sv2抗体稀释倍数为1:500。
[0249]
7)封片前，需进一步将肌纤维分离，尽量分离成单根；操作过程中需用1
×
pbs保持肌纤维湿润并进行避光处理。
[0250]
8)将进一步分离的肌纤维均匀平铺在载玻片上，在载玻片上均匀滴加适量封片剂，在封片剂上加一片盖玻片，用圆头镊子轻轻按压盖玻片四周让封片剂均匀填充在载玻片和盖玻片之间，在盖玻片四周滴加适量透明指甲油进行固定。
[0251]
9)滴加指甲油后室温放置16h待指甲油凝固后即可进行图像采集。采集电转shrna的肌管图像时，先在镜下用594nm红色荧光通道找到电转阳性的肌管，然后对该视野的荧光信号进行采集；采集电转dok7质粒的肌管图像时，先在镜下用488nm绿色荧光通道找到电转阳性的肌管，然后对该视野的荧光信号进行采集；采集denervation手术肌管的图像时，先在镜下594nm红色荧光通道找到btx染色阳性区域，然后对该区域的荧光信号进行采集，以633nm紫色荧光通道的nf/sv2荧光信号确定肌管是否denervation成功，对照组btx染色阳性区域nf/sv2也有荧光信号；而denervation组btx染色阳性区域则无nf/sv2荧光信号。
[0252]
1.16突触区与非突触区分离及denervation手术
[0253]
1)涉及的突触区与非突触区分离实验所使用的组织为一月龄小鼠的膈肌；以膈肌在解剖镜下可见的白色神经束所在区域为突触区；附近其他区域为非突触区。
[0254]
2)涉及的denervation手术均采用截断坐骨神经的方式进行；具体操作步骤为两月龄小鼠麻醉后，背部向上，用医用胶带固定小鼠四肢，医用酒精对小鼠后肢部位进行消毒，在股直肌附近切开皮肤，用手术刀轻轻划开股直肌下缘即可看到白色的坐骨神经。用弯头镊挑出坐骨神经，用剪刀剪去被弯头镊挑出的一截坐骨神经即完成denervation处理。另一条腿做对照手术暴露坐骨神经即可。将手术伤口缝合并放回原饲养笼；一周后即可取材用于后续实验。
[0255]
1.17 rna提取与荧光定量pcr
[0256]
1)以涉及的提取细胞rna和肌肉组织rna为例；提取培养在6孔板的细胞rna时，每孔加入1ml trizol，用无菌细胞刮将细胞刮离培养皿，将细胞悬液吸取至无菌ep管并置于冰中；提取肌肉组织rna时，需提前把组织研磨器灭菌烘干，因研磨过程会产热，需将研磨器底部插到冰中进行研磨，先将0.1g肌肉组织放到研磨器上缘再向研磨器中加入1ml预冷的trizol，用研磨棒顶端贴着研磨器玻璃壁将组织向研磨器底部一边推一边转动研磨。研磨组织切忌直接将组织放置在研磨器底部，这样容易导致肌肉组织接触trizol后变硬，最终导致研磨不充分无法获得满足实验需求的rna
[0257]
2)所有细胞都刮取完成后，将盛有细胞悬液的ep管涡旋30s充分打散细胞帮助其裂解。
[0258]
3)置于冰中裂解10min，加入200μl氯仿，手动震荡混匀后置于冰中，待看到ep管中溶液产生明显分层后，12,000rpm 4℃离心10min。
[0259]
4)吸取500μl上层溶液；不要吸到中间层和下层溶液。
[0260]
5)向上述500μl溶液中加入等体积的氯仿，手动震荡混匀后室温静置两分钟可见溶液分层，12,000rpm 4℃离心10min。
[0261]
6)吸取300μl上层溶液；不要吸到中间层和下层溶液。
[0262]
7)向上述300μl溶液中加入等体积的异丙醇，手动震荡混匀后
‑
20℃静置30min。
[0263]
8)12,000rpm 4℃离心30min，轻轻吸去管中上清，留取底部白色rna沉淀。
[0264]
9)加入750μl预冷的75％乙醇，手动轻轻颠倒混匀，7,000rpm 4℃离心10min。
[0265]
10)轻轻吸去管中上清后，7,000rpm 4℃离心1min，吸去管中残留的溶液。
[0266]
11)打开管盖，将ep管置于无菌操作台中干燥10min，可见白色rna沉淀边缘透明化。
[0267]
12)加入40μl ddh2o溶解rna；nanodrop2000测定rna浓度后可将rna调节至统一浓度方便后续取用。rna于
‑
80℃储存。
[0268]
13)每个反转录体系使用的rna总量为2μg；具体反转录反应体系如下：试剂名称与试剂用量分别为：ddh2o，补齐至20μl；5
×
reaction mix，4μl；rna，2μg；maxima enzyme mix，2μl。
[0269]
按照上述体系加好后轻轻混匀并盖紧管盖后即可放到pcr仪中启动反转录反应，
[0270]
反转录反应参数设置如下：
[0271]
温度与时间分别为：25℃，10min；50℃，30min；85℃，5min。
[0272]
反转录反应结束后所得产物即为cdna，可以稀释后用于后续荧光定量pcr。
[0273]
14)荧光定量pcr反应体系为10μl；cdna用量为反转录后所得cdna的百分之一，即将上述反转录实验所得cdna稀释到100μl，每个荧光定量pcr反应体系加1μl稀释后的cdna，选用的扩增程序为两步法。具体的pcr反应体系如下：
[0274]
试剂名称与试剂用量分别为：ddh2o 3μl；2
×
sybr green5μl；f引物0.5μl；r引物0.5μl；稀释后cdna
[0275]
1μl；
[0276]
可以根据需要实际操作需求将反应体系中的某些试剂先进行预混，然后再加到荧光定量pcr专用板反应孔中；在每个反应孔加好样品好，双手持荧光定量pcr专用封口膜的边缘，将封口膜的保护纸从一侧边缘整齐的撕开，然后将撕开的封口膜边缘对齐荧光定量
pcr专用板的侧边并贴到荧光定量pcr专用板上，一定不要用手触摸专用封口膜的中央区域，一边贴齐后，缓慢的撕下整张保护纸，让封口膜全部贴附于荧光定量pcr专用板上，然后用专用塑料板紧贴荧光定量pcr专用板的四周将封口膜压紧使其紧紧贴附于荧光定量pcr反应专用板，然后将加好样品的荧光定量pcr反应专用板进行短离心后即可进行荧光定量pcr反应。具体荧光定量pcr反应条件设置如下：
[0277]
温度与时间分别为：95℃2min；95℃15s；60℃30s；
[0278]
设置循环数为40。荧光定量pcr结束后对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测引物的特异性以确定结果是否可用，条带单一的引物的荧光定量pcr结果可信，可用于后续数据分析。
[0279]
本发明中缩写、英文名称与中文名称分别为:achr，acetylcholine receptor乙酰胆碱受体；als，amyotrophic lateral sclerosis肌萎缩侧索硬化症；amp，ampicillin氨苄青霉素；ampa，α
‑
amino
‑3‑
hydroxy
‑5‑
methyl
‑4‑
isoxazole
‑
propionicacid，α
‑
氨基
‑3‑
羟基
‑5‑
甲基
‑4‑
异恶唑丙酸；apc/c，anaphase promoting complex/cyclosome，后期促进复合物；aps，ammonium persulphate过硫酸铵；bpb，bromophenol blue溴酚蓝；bsa，bovine serum albumin牛血清白蛋白；btx，bungarotoxin银环蛇毒素；chx，cycloheximide放线菌酮；cms，congenital myasthenic syndrome先天性肌无力综合症；co
‑
ip，co
‑
immunoprecipitation免疫共沉淀；cq，chloroquine氯喹；dmso，dimethyl sulfoxide二甲基亚砜；dok7，downstream of kinase 7激酶下游蛋白7；fbs，fetal bovine serum胎牛血清；glur，glutamate receptor谷氨酸受体；hrp，horseradish peroxidase辣根过氧化物酶；hs，horse serum马血清；ip，immunoprecipitation免疫沉淀；kan，kanamycin卡那霉素；lrp4，low
‑
density lipoprotein receptor
‑
related protein 4低密度脂蛋白受体相关蛋白4；mn，motor neuron运动神经元；musk，muscle specific kinase肌肉特异性激酶；nf，neurofilament神经丝蛋白；nmj，neuromuscular junction神经肌肉接头；nsc，neural stem cell神经干细胞；nsr，non
‑
synaptic region非突触区；p/s，penicillin/streptomycin青霉素/链霉素；pcr，polymerase chain reaction聚合酶链式反应；pfa，paraformaldehyde多聚甲醛；pmsf，phenylmethylsulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟；ptb，phosphorylated tyrosine binding磷酸化酪氨酸结合；puro，puromycin嘌呤霉素；pvdf，poly vinylidene fluoride聚偏氟乙烯；q
‑
pcr，quantitative pcr荧光定量pcr；rtk，receptor tyrosine kinase受体酪氨酸激酶；sc，schwann cell施旺氏细胞；sds，sodium dodecylsulfate十二烷基磺酸钠；sr，synaptic region突触区；sv，synaptic vesicle突触小泡；ta，tibialis anterior胫前肌；ups，ubiquitin proteasome system泛素蛋白酶体系统；wb，western blot蛋白免疫印记检测；wt，wild type野生型；β
‑
me，β
‑
mercaptoethanolβ
‑
巯基乙醇；
[0280]
1.18图片分析与数据统计：
[0281]
采用image j对western blot和免疫荧光染色图片进行分析；采用graphpad prism 7.0对数据进行统计；数据采用平均值
±
标准误(mean
±
sem)的方式进行表示；数据分析采用two
‑
tailed paired or unpaired student’s t
‑
test方法；p<0.05时代表有统计学显著性差异。
[0282]
1实验结果与分析
[0283]
图1显示了agrin促进dok7发生泛素化修饰并通过蛋白酶体系统降解；其中，(a)是agrin刺激肌管导致dok7蛋白水平降低的示意图，agrin刺激c2c12分化的肌管，在不同刺激时间点收样进行western blot检测，结果显示p
‑
musk水平和dok7蛋白水平降低而musk和lrp4蛋白水平无明显改变；(b)是agrin刺激肌管4h不会降低lrp4，musk和dok7的mrna水平的示意图；图示为三次独立重复实验结果的统计结果，数值为mean
±
sem，*p<0.05。(c)agrin刺激促进dok7通过蛋白酶体系统降解。agrin刺激c2c12分化的肌管前1h预先用mg132或cq处理肌管，再用agrin刺激4h后收样western blot检测。(d)是图(c)的统计结果。图示为三次独立重复实验的统计结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001,**p<0.01。(e)是agrin刺激诱导dok7泛素化的示意图。agrin刺激c2c12分化的肌管前1h预先用mg132处理肌管，再用agrin刺激1h后收样，用dok7抗体做ip，再用ubiquitin抗体做western blot检测ip样品中dok7的泛素化水平。
[0284]
图2显示了musk促进dok7泛素化与降解。其中(a)是musk促进dok7泛素化的示意图。hek 293t细胞转染相应的质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；泛素活化酶e1抑制剂pyr
‑
41处理组为转染后8h加入。转染24h后收集样品用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。(b)是musk促进dok7降解的结果示意图。hek 293t细胞转染相应的质粒，dok7和musk质粒用量均为1μg，单转dok7组用pcdna3.1
‑
flag补齐质粒总量；转染后16h开始用chx处理，在不同的chx处理时间点收样后进行western blot检测。(c)图(b)的统计结果，图示结果为三次独立重复的实验结果统计，黑色为单转dok7，红色为dok7与musk共转。数值为mean
±
sem，*p<0.05，**p<0.01。(d)是musk促进dok7通过蛋白酶体系统降解的示意图；hek 293t细胞转染相应的质粒，质粒用量均为1μg；转染24h后先用mg132或cq处理细胞1h，再用chx处理细胞4h后收样进行western blot检测。(e)泛素k48连接方式是dok7泛素化的主要形式。hek 293t细胞转染相应质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；转染后24h收样，用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。
[0285]
图3显示了musk调控dok7泛素化依赖自身激酶活性及与dok7的结合，其中(a)musk激酶活性是其调控dok7泛素化必需的。hek 293t细胞转染相应质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag质粒补齐；24h后收样用flag抗体ip，用ha抗体检测ip样品中dok7泛素化水平，用p
‑
musk抗体检测确认musk
‑
k608r激酶失活。(b)说明了musk与dok7的结合是其调控dok7泛素化必需的。hek 293t细胞转染相应质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；24h后收样用flag抗体co
‑
ip，用ha抗体检测co
‑
ip样品中dok7泛素化水平，用myc抗体检测co
‑
ip样品中musk的蛋白水平确认musk
‑
y553f突变体削弱musk与dok7的结合。(c)显示了dok7与musk的结合是musk调控其泛素化必需的。hek 293t细胞转染相应质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；24h后收样用flag抗体co
‑
ip，用ha抗体检测co
‑
ip样品中dok7泛素化水平，用myc抗体检测co
‑
ip样品中musk的蛋白水平确认dok7
‑
3ra突变体削弱dok7与musk的结合。
[0286]
(d)说明了musk与dok7的结合是musk促进dok7降解必需的。hek 293t细胞转染相应质粒，各质粒用量为1μg；转染后16h开始用chx处理，在不同的chx处理时间点收样后进行western blot检测。(e)图(d)的统计结果。图示结果为三次独立重复的实验结果统计，数值
为mean
±
sem，*p<0.05，**p<0.01。
[0287]
图4显示出了dok7的泛素化位点是第243位赖氨酸，其中，(a)cms中最常见的dok7突变不影响dok7泛素化。在hek 293t细胞中转染相应的质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。(b)ph结构域的8个赖氨酸共同突变不影响dok7的泛素化。在hek 293t细胞中转染相应的质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。(c)dok7 lys243是dok7的泛素化位点。在hek 293t细胞中转染相应的质粒，各质粒用量均为2μg，每组质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。(d)dok7
‑
k243r半衰期延长。hek 293t细胞转染相应质粒，各质粒用量为1μg；转染后16h开始用chx处理，在不同的chx处理时间点收样后进行western blot检测。
[0288]
图5显示出了dok7 lys243的泛素化负调控achr的聚集，其中(a)不同种属dok7 k243及其周围氨基酸序列比对结果。序列比对结果表明dok7 k243在多物种间高度保守。红色标记为保守赖氨酸。(b)dok7
‑
k243r在体外具有更强的诱导achr聚集的能力。在c2c12细胞分化前转染相应的质粒，诱导分化6d后收集样品进行染色观察。绿色荧光标记质粒转染阳性的肌管，红色荧光标记聚集的achr。(c)图(b)的统计结果。图示为至少三次独立重复实验的统计结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。(d)电转示意图。质粒注射部位为小鼠胫前肌，该实验选用两周龄小鼠，电转一周后取胫前肌染色进行whole
‑
mount染色。(e)dok7
‑
k243r在体内具有更强的诱导achr聚集的能力。两周龄小鼠胫前肌电转5μg相应的质粒，一周后取胫前肌进行染色观察。绿色荧光标记电转质粒阳性的肌管，红色荧光标记achr聚集。黄色箭头指示斑点状achr聚集。(f)图(e)的统计结果。图示为至少三次独立重复实验的统计结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。
[0289]
图6显示出了apc2促进dok7泛素化与降解，其中，(a)过表达apc2引起dok7蛋白水平降低。在hek 293t细胞转染相应的质粒，各质粒用量均为1μg；转染24h后收样进行western blot检测。gfp抗体检测dok7蛋白水平，flag抗体检测e3表达，红色箭头指示全长的的e3蛋白条带。(b)图(a)的统计结果。图示为三次独立重复实验的统计结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。(c)过表达apc2引起dok7泛素化水平升高。在hek 293t细胞转染相应的质粒，dok7和ubi质粒用量为1μg，musk和apc2质粒用量为2μg，每组的质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；转染24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体对ip样品中dok7的泛素化水平进行检测。(d)apc2在c2c12分化前后的表达情况。在c2c12分化的不同时间点收样进行western blot检测。(e)过表达apc2导致肌管内源dok7蛋白水平降低。12孔板培养c2c12细胞，分化前每孔转染2μg相应的质粒，分化3d后收集样品进行western blot检测。
[0290]
图7显示出了敲低apc2抑制dok7泛素化，其中(a)敲低apc2抑制musk调控的dok7泛素化。在hek 293t细胞转染相应的质粒组合，其中shrna质粒为用量4μg，dok7，ubi和musk均为1μg，质粒总量为7μg，不足7μg的组用pcdna3.1
‑
flag质粒补齐；转染72h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip产物中dok7的泛素化水平。(b)敲低apc2抑制agrin诱导的dok7泛素化。在c2c12分化前转染相应的质粒，质粒用量为6μg，转染后18h开始诱导c2c12分化，分化4d后进行agrin刺激，在agrin刺激前1h先用mg132处理肌管，再用agrin刺激1h后收样用
dok7抗体ip，用ubiquitin抗体检测ip产物中dok7的泛素化水平，图中，#1、#2是针对apc2的两种shrna，具体靶向的序列有所不同，但针对的是同一个基因apc2。
[0291]
图8显示出了cdh1是介导dok7泛素化的底物识别亚基，其中，(a)敲低cdh1抑制dok7泛素化。在hek 293t细胞中转染相应的质粒组合，其中shrna质粒为用量4μg，dok7，ubi和musk均为1μg，质粒总量为7μg，不足7μg的组用pcdna3.1
‑
flag补齐；转染72h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip产物中dok7的泛素化水平。(b)q
‑
pcr检测cdc20 shrna敲低效率。图示为三次独立重复实验的统计结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。rna样品为图(a)的细胞用1ml预冷pbs重悬清洗时，吸取300μl细胞悬液离心后得到的细胞抽取的rna。(c)q
‑
pcr检测cdh1 shrna敲低效率。图示为三次独立重复实验的统计结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。rna样品为图(a)的细胞用1ml预冷pbs重悬清洗时，吸取300μl细胞悬液离心后得到的细胞抽取的rna。
[0292]
图9显示出了apc2定位于nmj并在突触后的肌管中富集，其中，(a)apc2定位于nmj。红色btx荧光信号标记nmj，绿色荧光信号标记apc2，箭头指示两者共定位。(b)小鼠膈肌分离突触区与非突触区示意图。绿色为运动神经元，红色为achr聚集，黑色虚线区域为突触区(synaptic region，sr)，黄色虚线区域为非突触区(non
‑
synaptic region，nsr)，浅蓝色部分小鼠膈肌。(c)荧光定量pcr检测apc2 mrna在突触区和非突触区富集程度。一月龄小鼠按照图(b)分离突触区和非突触区后提取rna进行荧光定量pcr检测；图示为三次独立重复实验的统计结果，数值显示为mean
±
sem。dok7和musk的mrna水平在突触区比非突触区高，说明突触区和非突触区分离成功。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。(d)apc2在突触区富集。一月龄小鼠膈肌分离突触区与非突触区后提取蛋白并进行western blot检测，musk和dok7在突触区富集表示突触区和非突触区分离成功。(e)apc2定位于突触后肌纤维。紫色nf/sv2荧光信号标记突触前运动神经元，红色btx标记nmj，绿色荧光信号标记apc2，可以发现在突触前运动神经元消失的突触区，apc2仍有定位，说明apc2定位于突触后肌纤维而不是突触前的运动神经元。
[0293]
图10显示出了apc2负调控achr聚集与nmj发育，其中，(a)过表达apc2抑制achr聚集。在c2c12分化前转染相应的质粒，分化4d后agrin刺激肌管诱导achr聚集并染色观察。绿色荧光信号标记质粒转染阳性肌管，红色荧光信号标记achr聚集。(b)图(a)的统计结果。图示为至少三次独立重复实验的结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。(c)敲低apc2促进achr聚集。在c2c12分化前转染相应的质粒，分化4d后agrin刺激肌管诱导achr聚集并染色观察。红色荧光信号标记转染阳性的肌管，绿色荧光信号标记achr聚集。(d)图(c)的统计结果。图示为至少三次独立重复实验的结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。(e)小鼠体内敲低apc2促进achr聚集。一周龄小鼠胫前肌电转相应的质粒，电转一周后处死小鼠取胫前肌染色观察。红色荧光信号标记电转阳性的肌管，绿色荧光信号标记achr聚集。白色箭头指示电转阴性的肌管(即apc2蛋白水平正常)中的achr聚集，黄色箭头指示电转靶向apc2的shrna阳性的肌管(即apc2蛋白水平降低)中的achr聚集。(f)是图(e)的统计结果。先对各处理组的achr聚集的面积大小统计，然后对指定大小的achr聚集在各处理组中的比例进行统计。其中small表示achr聚集小于100μm2，medium表示achr聚集大于等于100μm2但小于160μm2，large表示achr聚集大于等于160μm2。(g)图(e)的统计结果。对各组achr聚集的平均面积大小进行统计，每组三只小鼠，数值为mean
±
sem，**p<0.01。
[0294]
图11显示出了dok7 tyr106的磷酸化调控dok7泛素化。其中，(a)dok7 tyr395和tyr405的磷酸化不是dok7泛素化必需的。在hek 293t细胞转染相应的质粒，该实验各质粒用量均为2μg，每组的质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；转染24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip产物中dok7的泛素化水平。结果显示dok7 tyr395和tyr405突变不影响dok7泛素化。(b)dok7 tyr106磷酸化促进dok7泛素化。在hek 293t细胞转染相应的质粒，该实验各质粒用量均为2μg，每组的质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；转染24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip产物中dok7的泛素化水平。结果显示dok7 tyr106突变会抑制dok7泛素化。(c)dok7 tyr106磷酸化促进dok7降解。在hek 293t细胞转染相应的质粒，该实验中各质粒用量均为1μg；转染16h后用chx处理细胞，在不同时间点收集样品进行western blot检测，结果显示dok7 tyr106突变抑制dok7降解。(d)dok7 tyr106可以被musk磷酸化。在hek 293t细胞转染相应的质粒，该实验中dok7质粒用量为4μg，musk质粒用量为2μg，每组的质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；；转染24h后收样用flag抗体ip，再用p
‑
tyrosine抗体检测ip产物中dok7的酪氨酸磷酸化水平，结果显示dok7 tyr106可以发生可检测水平的磷酸化。
[0295]
图12显示出了dok7 tyr106磷酸化促进dok7二聚体化，其中(a)dok7 tyr106磷酸化促进dok7二聚体化。hek 293t细胞转染相应质粒，该实验各质粒用量均为2μg，每组的质粒总量为6μg，不足6μg的用pcdna3.1
‑
flag补齐；转染24h后收样用flag抗体co
‑
ip，再用ha抗体检测co
‑
ip产物中与flag
‑
dok7结合的ha
‑
dok7蛋白水平。(b)dok7 tyr106磷酸化促进achr聚集。c2c12分化前转染相应质粒，待其分化6d后收样进行免疫荧光染色。绿色荧光指示质粒转染阳性的肌管，红色荧光标记achr聚集。(c)图(b)的统计结果。图示为至少三次独立重复实验的结果，数值为mean
±
sem，***p<0.001。
[0296]
图13显示出了dok7 tyr106磷酸化促进dok7与apc2结合，其中，(a)dok7氨基酸序列比对结果。不同物种的dok7氨基酸序列中都存在一段保守的d
‑
box氨基酸序列。红色标记为d
‑
box序列中保守的r和l两个氨基酸。(b)dok7 tyr106磷酸化促进dok7与apc2结合。hek 293t细胞转染相应质粒，该实验各质粒用量均为2μg，每组处理的质粒总量为6μg，不足6μg的用gfp
‑
n1载体补齐；转染24h后收样用gfp抗体co
‑
ip，再用flag抗体检测co
‑
ip产物中与dok7结合的apc2蛋白水平。(c)apc2特异性结合dok7。hek 293t细胞转染相应质粒，dok7和musk质粒用量为4μg，apc2质粒用量为2μg；转染24h后收样用flag抗体co
‑
ip，再用gfp抗体检测co
‑
ip产物中与dok7或musk结合的apc2蛋白水平。(d)agrin刺激促进dok7与apc2结合。在c2c12分化5d后用agrin刺激肌管，刺激1h后收样用dok7抗体co
‑
ip，再用apc2抗体检测co
‑
ip产物中与dok7结合的apc2蛋白水平。
[0297]
2.1 agrin促进dok7泛素化并通过蛋白酶体系统降解
[0298]
目前的研究已经较为清楚的揭示了agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活机制，但该通路的负调控机制还不清楚。为了研究agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路是否存在避免通路被过度激活的负调控机制，首先，在体外模拟了体内的agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路激活过程。用agrin刺激c2c12分化的肌管，在不同的刺激时间点收集样品进行western blot检测。检测结果显示agrin短时间(15至30min)刺激肌管即可诱导musk磷酸化(p
‑
musk)(图1a)，并且随着agrin刺激时间的延长，p
‑
musk水平呈现下降趋势而musk蛋白水平基本无变化(图1a)，这说明agrin刺激肌管可以激活musk但不会导致其持续或过度激活。
293t细胞中共转染dok7和musk质粒，转染24h后先用mg132或cq处理细胞1h，再用chx处理细胞4h后收样进行western blot检测。结果显示chx处理4h后未做任何预处理的和预先用自噬
‑
溶酶体抑制剂cq处理的细胞蛋白样品中dok7蛋白水平明显下降，预先用蛋白酶体抑制mg132处理的细胞蛋白样品中dok7蛋白水平轻微下降(图2d)，这个结果表示musk促进的dok7降解可以被蛋白酶体抑制剂mg132抑制，说明musk促进dok7通过蛋白酶体系统降解。
[0308]
接着进一步的检测了dok7泛素化的泛素链连接方式，泛素具有7个赖氨酸(lysine，lys，k)，也就是说后一个泛素通过自身赖氨酸连接到前一个泛素形成泛素链时存在七种可能性。目前研究表明k48连接方式的多聚泛素化会促进蛋白质的降解，而k63连接方式主要负责辅助传递信号；通过转染泛素野生型质粒(ha
‑
ubi
‑
wt)、只保留第48位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒(ha
‑
ubi
‑
k48)和只保留第63位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒(ha
‑
ubi
‑
k63)来检测dok7泛素化的泛素连接方式。通过在hek 293t细胞转染相应的质粒，转染24h用flag抗体进行ip，再用ha抗体对ip产物中dok7的泛素化水平进行检测。发现ha
‑
ubi
‑
wt和ha
‑
ubi
‑
k48均可以促进dok7发生泛素化而ha
‑
ubi
‑
k63则基本不能促进dok7发生泛素化(图2e)，这个结果说明dok7的泛素化以k48连接方式为主。以上结果共同说明musk促进dok7发生以k48连接方式为主的泛素化，该泛素化方式促进dok7通过蛋白酶体系统降解从而导致dok7蛋白半衰期缩短。
[0309]
2.2.2 musk调控dok7泛素化依赖自身激酶活性以及与dok7的结合
[0310]
上文已经确定musk可以调控dok7泛素化，接下来想确定musk调控dok7泛素化是否依赖自身的激酶活性以及与dok7的结合。首先，根据文献报道，通过将musk第608位的赖氨酸突变为精氨酸构建了musk激酶失活突变体musk
‑
k608r
‑
myc；在hek 293t细胞中共转dok7
‑
flag与musk
‑
myc
‑
wt或dok7
‑
flag与musk
‑
k608r
‑
myc，转染24h后收集细胞用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。结果显示与musk野生型相比，激酶活性失活的musk
‑
k608r只能微弱的促进dok7泛素化。musk
‑
k608r激酶活性失活也通过检测p
‑
musk水平得到验证，可以发现musk
‑
k608r的磷酸化水平远低于musk
‑
wt(图3a)，这个结果说明musk的激酶活性对于musk调控dok7泛素化是必需的。
[0311]
接着，又根据文献报道通过将musk第553位酪氨酸(tyrosine，tyr，y)突变为苯丙氨酸(phenylalanine，phe，f)以及将dok7第158、159和174位的精氨酸(arginine，arg，r)突变为丙氨酸(alanine，ala，a)构建了削弱musk与dok7结合的musk突变体和dok7突变体，即musk
‑
y553f
‑
myc和dok7
‑
3ra
‑
flag。在hek 293t细胞中转染相应的质粒组合，转染24h后用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。从结果中可以发现，和musk
‑
wt
‑
myc相比，musk
‑
y553f
‑
myc只能微弱的促进dok7泛素化(图3b)。同时，用myc抗体对ip样品中dok7结合的musk蛋白水平进行western blot检测确认了musk
‑
y553f
‑
myc与dok7的结合变弱(图3b)。另外，也发现dok7
‑
3ra突变体与dok7
‑
wt相比，其泛素化水平大幅减弱(图3c)，这两个检测结果说明musk与dok7的结合是musk调控dok7泛素化必需的。
[0312]
根据之前的结论，dok7泛素化促进dok7降解，缩短dok7半衰期；那么dok7泛素化水平降低应该会延长dok7半衰期。为了验证的推测，对dok7
‑
3ra突变体的半衰期进行了检测，结果显示该突变体半衰期相比dok7
‑
wt半衰期大幅延长(图3d，e)，该结果验证了dok7泛素化促进dok7降解，缩短dok7半衰期的推论。以上结果共同说明musk的激酶活性及其与dok7的结合是musk调控dok7泛素化必需的。
[0313]
2.3 dok7的泛素化位点是第243位赖氨酸
[0314]
在确定musk调控dok7泛素化以后，继续对dok7泛素化位点进行了研究。目前的研究表明蛋白质泛素化通常发生在赖氨酸位点。dok7
‑
duptgcc是先天性肌无力综合症(congenital myasthenic syndrome，cms)病人中最为常见的dok7突变，因为该突变是由于dok7第1124
‑
1127位的tgcc四个碱基重复所致，所以将该突变命名dok7
‑
duptgcc。该突变导致dok7的开放阅读框(open reading frame，orf)发生移码并提前终止，翻译产生的dok7蛋白分子量比dok7
‑
wt小，而且因为移码，dok7
‑
duptgcc缺失了dok7
‑
wt中的第499位赖氨酸。为了检测dok7泛素化是否与该突变的致病性有关以及检测lys499是否是dok7泛素化的位点，在hek 293t细胞中转染了dok7
‑
duptgcc
‑
flag和其他对应质粒，转染24h后，用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中dok7的泛素化水平。结果显示dok7
‑
duptgcc的泛素化水平与dok7
‑
wt相当，基本无差别(图4a)，说明dok7 lys499不是泛素化位点。
[0315]
dok7的第1
‑
100位氨基酸构成pleckstrin homology结构域(ph domain)，有文献报道该结构域对dok7与细胞膜的结合很重要(buyan et al.,2016)，而且该结构域内富含赖氨酸，第12、17、18、20、28、42、44和49位氨基酸均为赖氨酸，接着测试了这八个赖氨酸是否是dok7的泛素化位点，通过将赖氨酸突变为精氨酸(k to r)，构建了这八个赖氨酸共同突变的dok7突变体，即dok7
‑
8kr
‑
flag。将该突变质粒与相应的质粒转染hek 293t细胞，转染24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip样品中的dok7泛素化水平。结果表明dok7
‑
8kr的泛素化水平与dok7
‑
wt相当，基本无差别(图4b)，说明dok7 ph结构域的这八个赖氨酸不是dok7泛素化的位点。为了鉴定dok7的泛素化位点，继续对dok7中的第123、153、207和243位赖氨酸进行点突变构建了dok7
‑
k123r、dok7
‑
k153r、dok7
‑
k207r和dok7
‑
k243r突变体，将这些突变体质粒与对应的质粒转染hek 293t细胞，转染24h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体对ip样品中的dok7泛素化水平进行检测。结果显示和dok7
‑
wt相比，dok7
‑
k243r突变体的泛素化水平剧烈下降而其他三个位点突变的dok7突变体泛素化水平基本无变化(图4c)，说明dok7第243位赖氨酸是dok7的泛素化位点。
[0316]
前文提到dok7泛素化促进其降解，缩短其半衰期，那么泛素化水平降低的dok7
‑
k243r是否会降解变慢呢？通过在hek 293t细胞中转染相应的质粒，转染后16h用chx处理细胞，在不同的chx处理时间点收样并western blot检测dok7的蛋白水平。发现dok7
‑
k243r的降解速度的确比dok7
‑
wt及其他三个泛素化水平无变化的dok7突变体的降解速度慢(图4d)，这说明dok7第243位的赖氨酸的泛素化是促进dok7降解的。以上结果共同说明dok7第243位赖氨酸的泛素化缩短dok7半衰期，促进dok7的降解。
[0317]
2.4 dok7 lys243的泛素化负调控achr聚集
[0318]
通过氨基酸序列比对，发现dok7 lys243在不同种属间高度保守(图5a)，这暗示该位点的泛素化可能具有重要的功能。在c2c12分化的肌管中过表达dok7可以诱导乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，achr)聚集，这是检测dok7功能的一个重要方法。采用该方法对dok7 lys243泛素化是否影响dok7的功能进行了检测，首先在c2c12分化前进行质粒转染，转染6h后换液，让细胞继续在生长培养基中生长12h后再换为分化培养基诱导肌管产生，分化6d后收样进行细胞免疫荧光染色。用flag抗体标记质粒转染阳性的肌管，btx
‑
594(red)标记聚集的achr，结果可以看到转染空载体的肌管中极少出现聚集的achr，转染dok7
‑
wt的肌管出现少量小斑点状的achr聚集，而转染dok7
‑
k143r的肌管则出现大量呈片
状的achr聚集(图5b)，对特异性标记achr聚集的btx
‑
594的荧光信号强度进行统计分析结果也与上述结果相吻合(图5c，wt组achr荧光强度标准化为1，k243r组的achr荧光强度为4.93
±
0.39，p<0.001)，该结果说明dok7
‑
k243r突变在体外具有更强的诱导achr聚集的能力。
[0319]
在体外实验检测验证了dok7泛素化对dok7诱导achr聚集的影响后，借助电转的方式在小鼠体内检测了dok7泛素化对dok7诱导achr聚集的影响，在两周龄小鼠的胫前肌(tibialis anterior muscle，ta muscle)电转5μg相应的质粒，电转一周后，麻醉并处死小鼠后取胫前肌染色(图5d)。结果显示电转gfp载体的肌管achr呈现完整的正常聚集形态，电转gfp
‑
dok7
‑
wt的肌管中在完整的正常聚集的achr周围出现少量斑点状achr聚集，而电转gfp
‑
dok7
‑
k243r的肌管中在完整的正常聚集的achr周围出现大量斑点状achr聚集(图5e)，针对特异性标记achr的btx
‑
594荧光强度统计的结果也与上述结果相符(图5f，gfp组achr荧光强度标准化为1，wt组为1.62
±
0.12，k243r组为2.64
±
0.15)，该结果说明dok7
‑
k243r突变在体内也具有更强的诱导achr聚集的能力。以上结果共同说明了dok7 lys243的泛素化负调控achr的聚集。
[0320]
2.5 dok7泛素化依赖apc2和cdh1
[0321]
2.5.1过表达apc2促进dok7泛素化与降解
[0322]
为了寻找介导dok7泛素化的泛素连接酶,根据文献报道，找到了七种在神经肌肉接头定位或可能对神经肌肉接头发育有调控作用的泛素连接酶。为了对这七种泛素连接酶进行初步筛选，首先在hek 293t细胞中共转dok7和这七种泛素连接酶，转染24h后收样对dok7的蛋白水平进行western blot检测。结果显示，和转染空载体及转染其他泛素连接酶的处理组相比，过表达apc2可以引起dok7蛋白水平剧烈下降(图6a，b)，这提示apc2很可能是介导dok7泛素化的e3。
[0323]
为了进一步检测apc2是否是介导dok7泛素化的e3，在hek 293t细胞中过表达apc2和相应的质粒组合，转染24h后收样用flag抗体进行ip，再用ha抗体对ip产物中dok7的泛素化水平进行检测。结果显示，过表达apc2促使dok7泛素化水平剧烈上升(图6c)。
[0324]
接下来，想测试过表达apc2是否会引起c2c12分化的肌管中内源性dok7蛋白水平下降。首先，检测了apc2在c2c12分化前后的表达情况，结果显示apc2在c2c12分化前后均有表达(图6d)。确认apc2在肌管中表达以后，在c2c12分化前转染apc2质粒，待其分化成肌管后收样通过western blot检测内源性dok7蛋白水平。结果显示过表达apc2促使肌管内源的dok7蛋白水平降低(图6e)，上述结果共同说明了过表达apc2可以促进dok7泛素化与降解。
[0325]
2.5.2敲低apc2抑制dok7泛素化
[0326]
在上述实验中，借助过表达的方式对apc2是否是介导dok7泛素化的e3进行了检测，结果表明过表达apc2可以促进dok7的泛素化。那么敲低apc2是否会抑制dok7泛素化呢？利用shrna对apc2进行敲低，检测了敲低apc2对dok7泛素化的影响。首先，在hek 293t细胞转染相应的质粒，转染72h后用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip产物中dok7的泛素化水平。结果显示和转染对照shrna组相比，转染apc2
‑
shrna的样品中dok7泛素化水平剧烈下降(图7a)。接着，又进一步在肌管中对该结果进行了验证，在c2c12细胞分化前转染相应的shrna，待其分化4d后用agrin刺激肌管1h后收集肌管，用dok7抗体ip再用ubiquitin抗体对ip产物中的dok7泛素化水平进行检测。结果显示在肌管中敲低apc2可以抑制agrin诱导的dok7泛
素化(图7b)。以上结果共同说明了敲低apc2可以抑制dok7的泛素化。
[0327]
2.5.3 cdh1是介导dok7泛素化的底物识别亚基
[0328]
apc2是泛素连接酶apc/c(anaphase promoting complex/cyclosome)的催化活性亚基。该e3为多亚基复合物，其中有两个亚基负责底物的特异性识别，分别为cdc20和cdh1。
[0329]
在上述结果中已经发现了apc2是介导dok7泛素化必需的，接下来确定负责识别dok7导致其发生泛素化的底物识别亚基。通过在hek 293t细胞中转染相应的质粒，并利用shrna对cdc20和cdh1进行敲低，转染72h后收样用flag抗体ip，再用ha抗体检测ip产物中dok7的泛素化水平。检测结果显示和对照组以及cdc20敲低组相比，cdh1敲低导致dok7泛素化水平剧烈下降(图8a)。靶向cdc20和cdh1的shrna的敲低效果经过q
‑
pcr检测也得到了确认(图8b，c)。以上结果说明了apc/c的底物识别亚基cdh1是介导dok7泛素化必需的。
[0330]
2.6 apc2在肌肉中的表达与定位
[0331]
在上述结果中发现apc2在体外培养的肌管中有表达并且参与调控dok7的泛素化，但apc2在小鼠肌肉中的表达和定位情况还不是很清楚。
[0332]
dok7的主要功能是调控神经肌肉接头发育，并且dok7定位在神经肌肉接头处。如果apc2调控dok7的泛素化，推断apc2应该也会定位在神经肌肉接头处，这样才能保证apc2在空间上有调控dok7泛素化的可能性。为了检测的推断是否正确，对小鼠胫前肌切片进行免疫荧光染色，结果显示apc2荧光信号和标记神经肌肉接头的btx荧光信号具有很强的共定位(图9a)，说明apc2定位于神经肌肉接头处。
[0333]
神经肌肉接头主要分布于突触区(synaptic region，sr)，其临近的不含有神经肌肉接头的其他区域为非突触区(non
‑
synaptic region，nsr)(图9b)。如果apc2定位于神经肌肉接头处，那么其mrna水平和蛋白水平在突触区应该比非突触区高。对小鼠膈肌进行突触区与非突触区分离(图9b)，一部分样品提取rna进行荧光定量pcr检测，结果显示dok7和musk的mrna水平在突触区高于非突触区，说明分离突触区和非突触区成功，在此基础上，发现apc2的mrna水平也是突触区高于非突触区(图9c)。另一部分样品提取蛋白后进行western blot检测，检测结果显示musk和dok7这两种典型的突触区富集的蛋白在的检测结果中确实在突触区富集，表示成功的分离了突触区和非突触区(图9d)。同时检测结果也显示apc2蛋白水平在突触区比非突触区更高(图9d)，以上结果共同说明apc2在突触区富集。
[0334]
突触区在结构上主要可以区分为突触前的运动神经元和突触后的肌纤维，上述结果中发现apc2在突触区富集，但是不清楚apc2是定位于突触前的运动神经元还是突触后的肌纤维；为了区分apc2是定位与突触前的运动神经元还是突触后的肌纤维，对两月龄小鼠实施坐骨神经截断手术，手术会导致突触前的运动神经元末端与突触后的肌纤维分离并收回，即手术后一周突触区只存在突触后的肌纤维。手术后一周取对照组和手术组小鼠的胫前肌进行染色，结果显示在对照组中，标记突触前运动神经的nf/sv2，标记神经肌肉接头的btx和apc2有很强的定位(图9e，sham)，这与前文apc2在突触区定位的结果相一致；在手术组中，可以发现标记突触前运动神经元的nf/sv2信号消失，表示此时的突触区只有突触后的肌纤维而没有突触前的运动神经元，此时仍可以检测到apc2荧光信号，并且该荧光信号和标记神经肌肉接头的btx荧光信号有很强的共定位(图9e，denervation)，这说明apc2是定位于突触后的肌纤维中的。以上结果共同说明apc2定位于nmj且主要分布在突触后的肌管中。
motif)的氨基酸序列，d
‑
box的最短保守氨基酸序列为r
‑
x
‑
x
‑
l。通过序列比对发现不同物种的dok7都存在一段该类型的d
‑
box序列，而且该d
‑
box序列围绕在dok7 tyr106周围(图13a)。这引导对dok7 tyr106磷酸化是否调控apc2
cdh1
对dok7的底物识别进行了检测，在hek 293t细胞转染相应的质粒，转染24h后收样用gfp抗体对gfp
‑
dok7进行co
‑
ip，再用flag抗体检测co
‑
ip产物中与dok7结合的apc2蛋白水平。结果显示dok7单独存在时，即dok7不发生磷酸化时，dok7
‑
wt和dok7
‑
y106a具有几乎相同的本底结合apc2的能力(图13b)。在musk存在时，即dok7发生磷酸化时，dok7
‑
wt与apc2的结合能力比不发生磷酸化时显著增强，而dok7
‑
y106a则无变化(图13b)，说明dok7 tyr106的磷酸化可以增强dok7与apc2的结合。
[0349]
同时，为了排除apc2结合musk的可能性，在hek 293t细胞中共转gfp
‑
apc2和dok7
‑
flag或者gfp
‑
apc2和musk
‑
flag，转染后24h用flag抗体co
‑
ip，再用gfp抗体检测co
‑
ip产物中与dok7或musk结合的apc2蛋白水平。结果显示apc2特异性的与dok7结合而不与musk结合(图13c)。接着对agrin是否调控肌管内源性dok7与apc2的结合进行了检测，用dok7的抗体co
‑
ip，再用apc2抗体检测co
‑
ip产物中与dok7结合的apc2蛋白水平。结果显示agrin刺激在不改变apc2蛋白水平的情况下增强了dok7与apc2的结合(图13d)。结果也显示agrin刺激增强了dok7泛素化(图13d)，这与本发明之前的结果一致，也说明了本次实验agrin刺激有效。以上结果共同说明了dok7 tyr106的磷酸化促进dok7与apc2的结合。
[0350]
神经肌肉接头的正常发育依赖机体对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路激活水平的精准调控，目前的研究已经比较清晰的揭示了agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活机制，但该通路是否存在负调控机制以防止通路过度激活还不清楚。本发明中报道了一种agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控机制。agrin刺激肌管后，musk被激活从而磷酸化dok7 tyr106，突触后富集的泛素连接酶apc/c的催化亚基apc2在底物识别亚基cdh1的帮助下识别并结合tyr106磷酸化的dok7，介导其lys243发生以k48连接方式为主的多聚泛素化，从而促进dok7通过蛋白酶体系统被降解，最终导致dok7蛋白水平降低，从而实现对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负调控。
[0351]
本发明中，发现agrin刺激可以快速(15至30min)激活musk导致musk磷酸化但不会持续的导致musk发生高水平状态磷酸化，agrin刺激60min后musk的磷酸化水平就开始衰减(图1)，这与已有的文献报道相一致，这暗示了agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路存在一种负调控机制以防止该通路过度激活。目前为止，对这种负调控机制并不了解。
[0352]
在研究中发现agrin刺激肌管会促进dok7泛素化并导致dok7蛋白水平的降低(图1)，而dok7作为agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的胞内接头蛋白，其蛋白水平的高低对调控musk磷酸化水平，即agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活水平非常重要。有研究说明dok7蛋白水平过低或过高对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活和功能都有非常重要的影响。因此在发现agrin促进dok7发生泛素化并通过蛋白酶体系统降解后，推测这可能是负调控agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的一种机制。
[0353]
musk在agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路中作为受体酪氨酸激酶发挥功能，dok7则作为其胞内接头蛋白。本发明通过在hek 293t细胞中表达musk和dok7并进行检测，发现musk的激酶活性及其与dok7的结合都是调控dok7泛素化必需的(图3)。同时也发现dok7 lys243是泛素化的主要位点(图4)，该位点突变导致dok7泛素化水平减弱，功能实验中发现该突变体(dok7
‑
k243r)表现出比野生型dok7(dok7
‑
wt)更强的诱导achr的聚集(图5)。
[0354]
apc/c是否调控脊椎动物的神经肌肉接头发育还不清楚。在本发明中发现apc/c的催化活性亚基apc2在小鼠神经肌肉接头处的突触后区域富集(图9)。agrin刺激肌管可以增强apc2与dok7的特异性结合(图13)，并且在底物识别亚基cdh1的帮助下催化dok7发生k48连接方式的泛素化(图2和图8)，导致dok7通过蛋白体系统被降解(图1和图2)，最终引起dok7蛋白水平在agrin刺激肌管后发生下调(图1)。同时也对apc2是否调控achr聚集和小鼠神经肌肉接头发育进行了检测，结果发现过表达apc2抑制achr聚集而敲低apc2则可以促进achr聚集并导致小鼠神经肌肉接头变大(图10)。本发明中，研究结果说明apc2通过促进dok7泛素化与降解从而下调dok7蛋白水平，最终实现负调控achr聚集从而参与调控脊椎动物神经肌肉接头发育。
[0355]
musk作为受体酪氨酸激酶，其激酶活性对其调控胞内接头蛋白dok7的泛素化是必需的(图2)，这表示dok7蛋白中的某个酪氨酸位点被musk磷酸化后才会引发dok7泛素化。dok7 tyr395和tyr405是目前文献报道的musk磷酸化dok7的位点。但在检测中发现，这两个位点的磷酸化并不参与调控dok7的泛素化(图11)。将这两个位点突变以后发现，dok7仍表现出可检测水平的酪氨酸磷酸化，推测dok7有其他酪氨酸位点被musk磷酸化，该位点的磷酸化调控dok7的泛素化，通过将dok7中的所有酪氨酸位点进行点突变，最终发现dok7 tyr106可以被musk磷酸化，并且调控dok7的泛素化(图11)。以前的研究通过质谱检测发现dok7 tyr395和tyr405是dok7中主要的酪氨酸磷酸化位点，检测发现将这两个位点突变以后，dok7的酪氨酸磷酸化水平的确剧烈下降，只保留了微弱的tyr106的磷酸化。可能由于tyr106的磷酸化水平比较低，超出质谱检测的灵敏程度范围。dok7 tyr395和tyr405的磷酸化促进dok7与crk/crk
‑
l的结合，帮助agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的信号向下传递。那么dok7 tyr106磷酸化的功能是什么呢？发现该位点突变后(dok7
‑
y106a)导致dok7丧失了促进achr聚集的能力(图12)，这说明dok7
‑
y106a丧失了激活agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的能力。通过检测发现dok7
‑
y106a形成二聚体的能力大幅减弱(图12)，这可能是dok7
‑
y106a不能激活agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路从而诱导achr聚集的原因。既然dok7 tyr106的磷酸化调控dok7泛素化，是否调节dok7与泛素连接酶的结合呢？apc/c介导底物泛素化时需要cdc20或者cdh1负责底物识别，帮助底物和apc/c结合，已经鉴定了cdh1是dok7泛素化的底物识别亚基(图8)，cdh1识别底物依赖底物中的一段为名为d
‑
box的基序，d
‑
box基序的保守形式为r
‑
x
‑
x
‑
l，通过序列比对发现，不同种属的dok7蛋白都存在一个保守的d
‑
box基序，而且dok7 tyr106恰巧位于该保守d
‑
box基序。通过检测发现dok7 tyr106的磷酸化可以促进dok7与apc2的结合(图13)。
[0356]
本发明可以为开发这类疾病的治疗方法提供新的思路，过表达的方式会导致肌管中的dok7或musk蛋白水平远远高于内源表达的蛋白水平，从而导致agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路异常的持续高水平激活。如果通过敲低apc2的方式抑制dok7泛素化及其降解，从而维持内源dok7蛋白水平，进而维持agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的激活水平也许可以促进神经肌肉接头的发育和维持。
[0357]
总体而言，在本发明中揭示了agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的一种负调控机制，agrin刺激肌管后，musk促进dok7 tyr106发生磷酸化，在cdh1的帮助下，apc2与tyr106发生磷酸化的dok7结合并介导dok7 lys243发生以k48连接方式为主的泛素化，促进dok7通过蛋白酶体系统降解，最终导致dok7蛋白水平下调，从而实现对agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的负
调控。该机制对维持agrin
‑
musk
‑
dok7信号通路的正常激活水平非常重要，同时对维持正常的achr聚集和神经肌肉接头发育也有关键的调控作用。本发明有助于更全面的了解调控神经肌肉接头发育的分子机制，也有助于拓宽在开发相关疾病治疗方法时的思路。
[0358]
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。