一种检测脂滴和/或蛋白质聚集体的双功能荧光探针及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种检测脂滴和/或蛋白质聚集体的双功能荧光探针及其制备方法和用途。


背景技术：

2.世界范围内人口老龄化日益严重，老年人的健康问题引起了人们的极大关注。衰老是一个复杂的生理过程，常常导致组织和器官发生结构和功能的衰退，从而增加患各种疾病的风险，如癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和糖尿病等。在过去的几十年中，人们提出了多种导致衰老的机制。越来越多的证据表明，除了表观遗传因素外，细胞代谢异常引起的细胞损伤也是导致衰老的原因之一。然而，衰老的分子机制仍然未被完全了解。为了延缓衰老、延长寿命以及提高老年人的生活质量，了解衰老的确切分子机制至关重要。
3.脂滴(lds)是一种与脂质的储存和代谢有关动态的细胞器，它参与着生物体多种细胞过程。近年来的研究表明，lds的代谢、运动和积累与衰老密切相关。例如，lds在衰老过程中积累在室管膜细胞中，使室管膜细胞的代谢和屏障功能显著下降。在衰老过程中，小胶质细胞内的lds明显增多，导致其吞噬功能下降，细胞内活性氧(ros)增多，促炎细胞因子分泌增多。lds与其他细胞器的相互通讯也参与了衰老过程。尤其是lds自噬的降解可能是衰老代谢综合征的基础。另一方面，蛋白质聚集体(pas)已被公认为是衰老最普遍的标志之一。pas在老年人中的产生蛋白质稳态失调有关。研究发现，细胞蛋白质氧化修饰、蛋白质丰度增加、大细胞自噬受抑制、生殖能力下降和蛋白降解能力丧失是导致衰老过程中pas产生的主要原因。pas与衰老相关的多种神经退行性疾病有关，例如阿尔兹海默症、帕金森综合征等。
4.而且，lds和pas在衰老过程中的联系异常密切。例如，lds是ros的共同靶点，而pas是在衰老过程中ros水平升高情况下由蛋白质产生的。pas可被装载到lds中，然后通过脂肪吞噬作用被清除，有利于延缓衰老和增长寿命。脂褐素主要由pas和lds组成，其丰度与衰老呈正相关。在家族性淀粉样变性多发性神经病的淀粉样蛋白形成过程中，淀粉样β
‑
pas与lds的相互作用有着重要作用。seipin基因缺陷可导致lds水平下降和αsyn
‑
pas水平升高，导致与年龄相关的运动协调性障碍。
5.了解lds和pas在衰老过程中复杂的相互关系，有助于剖析衰老的确切分子机制，为控制衰老提供新的思路。因此，迫切需要一种在衰老过程中同时检测lds和pas的有效方法。然而，据我们所知，还没有一种分析方法能够同时检测生物体中的lds和pas。近年来，具有高时空分辨率的荧光探针已被广泛应用于无创追踪生物体内一些重要的生物分子。在过去的十年中，已经开发出许多lds荧光探针或pas荧光探针。然而，目前可用的荧光探针只能用于检测lds或pas。尽管lds和pas在衰老过程中起着重要的相互作用，但它们都不能同时检测lds和pas。尽管lds荧光探针和pas荧光探针可能一起使用以获得lds和pas的双重信号，但是由于两种探针在生物系统中具有不同的摄取、分布和代谢特性，因此两种探针的数
据采集会比较混乱。
6.因此，在工作中科学构建了一种能够同时、快速监测衰老过程中lds和pas的新型双功能荧光探针lw
‑
1。探针lw
‑
1独特的氢键调节单键旋转或分子内电荷转移效率的机制使其可以分别对红色荧光通道中的lds和近红外荧光通道中的pas进行特异性区分成像。


技术实现要素：

7.针对现有技术中的上述不足之处，本发明提供了一种检测脂滴和蛋白质聚集体的双功能荧光探针及其制备方法和用途。它不仅选择性好、灵敏度高，而且制备方法简单，并能够快速区分检测细胞或组织中脂滴和/或蛋白质聚集体。
8.本发明是通过如下技术方案实现的：
9.用于检测脂滴和/或蛋白质聚集体的双功能荧光探针，其结构如下：
[0010][0011]
用于检测脂滴和/或蛋白质聚集体的双功能荧光探针的制备方法，按照下述步骤进行：
[0012]
步骤1、称取间二乙氨基苯酚溶于浓盐酸和水的混合溶液中，再称取亚硝酸钠溶于水中；随后将间二乙氨基苯酚的盐酸溶液置于冰浴环境下，再逐滴加入亚硝酸钠溶液，滴加完毕后，继续在冰浴条件下搅拌反应，反应结束后，过滤收集生成的固体，然后用饱和的乙酸钠溶液洗涤固体，最后通过丙酮重结晶，对获得的固体物质进行提纯，得到5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚的红色晶体；
[0013]
步骤2、用无水乙醇将5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚溶解在烧瓶中，然后将水合肼滴加到烧瓶中，在惰性气体保护下，将钯碳催化剂加入到混合物中，最后将获得的溶液加热至回流，然后搅拌直至溶液的红色消失，得到2
‑
氨基
‑5‑
(二乙基氨基)苯酚溶液；为了避免2
‑
氨基
‑5‑
(二乙基氨基)苯酚被氧化降解，将所得的混合物不经过纯化直接用于下一步。
[0014]
步骤3、将丙酮酸乙酯逐滴滴加到步骤2所获得的溶液中，随后在回流温度下搅拌反应。反应结束后，将反应后混合物置于室温冷却，随后减压蒸馏除去溶剂，将残余物通过柱层析色谱法进行纯化，得到黄色固体a，即7
‑
二乙胺基
‑3‑
甲基
‑
氮杂香豆素。
[0015]
步骤4、将步骤3得到的黄色固体a溶解在乙醇中，然后将该溶液滴加在氢氧化钠水溶液中，将所得混合物在室温下搅拌反应，然后用盐酸溶液将混合物中和至中性，再用二氯甲烷和水对混合溶液进行萃取，将收集的有机相在减压蒸馏下去除溶剂，然后将残留物质通过柱色谱法进行纯化，得到的深红色固体a，即2
‑
氨基
‑7‑
(二乙胺基)
‑
3h
‑
苯并恶嗪
‑3‑
酮。
[0016]
步骤5、将步骤4得到的深红色固体a用n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解，然后将碘甲烷逐滴滴加到混合溶液中，并向混合物中加入碳酸钾，然后将混合物加热搅拌反应，反应结束后，将混合溶液置于室温下冷却，随后用水和二氯甲烷对混合物进行萃取，保留有机相，将收集
的有机相通过减压蒸馏除去溶剂，最后通过柱层析法进一步纯化得到固体，即得到了用于检测生物体中脂滴和/或蛋白质聚集体的双功能荧光探针。
[0017]
步骤1中，所述间二乙氨基苯酚、浓盐酸、和亚硝酸钠的用量比为3g～6g：6ml～12ml：1.5g～3g。
[0018]
步骤1中，所述冰浴条件下搅拌反应的温度为
‑
10～
‑
5℃，时间为2
‑
3h，所述重结晶用的温度为90℃。
[0019]
步骤2中，所述无水乙醇、5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚、水合肼和钯碳催化剂的用量比为6ml～12ml：1g～2g：4ml～8ml：0.1g～0.2g，其中水合肼的体积百分浓度为85％。
[0020]
步骤2中，所述加热回流搅拌反应的温度为80～90℃，时间为1～2h。
[0021]
步骤3中，所述丙酮酸乙酯的用量和步骤2中5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚的用量比为4ml～8ml：1g～2g。
[0022]
步骤3中，所述加热回流搅拌反应的温度为80～90℃，时间为3～4h。
[0023]
步骤4中，黄色固体a、乙醇、氢氧化钠水溶液的用量比为0.5g～1g：10ml～15ml：20ml～40ml，其中，氢氧化钠水溶液的浓度为10m。
[0024]
步骤4中，所述室温下搅拌反应的时间为0.5～1h。
[0025]
步骤5中，所述深红色固体a、n,n
‑
二甲基甲酰胺、碘甲烷、碳酸钾的用量比为0.1g～0.2g：10ml～20ml：25μl～50μl：90mg～180mg。
[0026]
步骤5中，所述加热搅拌温度为60℃，所述加热搅拌时间为12～16h。
[0027]
本发明制备得到的荧光探针，不仅可以单独检测脂滴或蛋白质聚集体，还可以同时区分脂滴和蛋白质聚集体。将其用于区分检测衰老小鼠肠组织中的脂滴和/或蛋白质聚集体；将其用于快速、免洗检测细胞中的脂滴。
[0028]
检测机理为：
[0029]
检测脂滴时的机理为氢键控制单键旋转，将其用检测脂滴时比尼罗红具有更好的专一性，其它蛋白质对其检测没有干扰。
[0030]
检测蛋白质聚集体时的机理为氢键控制分子内电荷转移效率；
[0031]
具体使用方法如下：
[0032]
1、本发明提供的荧光探针可用于检测水溶液中的脂滴，具体方法如下：在dmso中制备lw
‑
1(1
×
10
‑3m)母液。在50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)中，室温下测定lw
‑
1(5μm)对不同量三油酸甘油酯(0～1000μg/ml)的荧光响应。将25μl lw
‑
1母液和适量甘油三油酸酯添加到5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)将溶液稀释至5ml。在记录荧光光谱(λex＝540nm)之前，将所得溶液摇匀并在室温下培养10分钟。
[0033]
2、本发明提供的荧光探针可用于检测水溶液中的蛋白质聚集体，具体方法如下：pas的生成：根据文献报道的方法生成pas[127]。将1mg/ml的蛋白质溶解在0.1m盐酸水溶液(ph＝2)中。然后在65℃的热混合器培养箱中培养，蛋白质溶液逐渐产生pas。大约24小时后，pas制备完成。
[0034]
水溶液中pas的检测：在50μm磷酸钾缓冲液(ph7.4)中，测定lw
‑
1(5μm)对不同量pas(0～1000μg/ml)的荧光响应。将25μl lw
‑
1母液和适量pas溶液(1mg/ml)添加到5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)将溶液稀释至5ml。将所得溶液在室温下摇匀并培养10分钟，然后记录荧光光谱(λex＝600nm)。
[0035]
3、探针lw
‑
1与其他生物分子的反应：以肌氨酸、精氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、dna、rna、葡萄糖、维生素c和30％h2o2为原料制备各种生物相关物质的储备液。通过fenton反应生成羟基自由基(
·
oh)。将25μl lw
‑
1储备液和适当等分的每种生物相关物种储备液放入5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)稀释至5ml，制备得到测试溶液。在记录荧光光谱(λex＝540nm和600nm)之前，将所得溶液在室温下摇匀并培养10min。
[0036]
4、本发明提供的荧光探针也可用于细胞中脂滴和/或蛋白质聚集体的荧光成像，具体方法为：
[0037]
细胞培养：smmc
‑
7721细胞的培养：smmc
‑
7721细胞系获取于江苏大学医学院。smmc
‑
7721细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的dmem培养基。
[0038]
hepg2细胞的培养：hepg2细胞系获取于江苏大学医学院。hepg2细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的dmem培养基。
[0039]
hela细胞的培养：hela细胞系获取于江苏大学医学院。hela细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的dmem培养基。
[0040]
在低葡萄糖dmem中培养hela细胞：hela细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的低葡萄糖dmem培养基。
[0041]
lds共定位实验：将培养在35mm玻璃培养皿底部中的smmc
‑
7721活细胞用5μm探针bodipy 493/503染色20分钟。然后，将细胞进一步用5μm的探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。bodipy 493/503涉及的荧光在绿色通道490
‑
520nm处记录，在476nm处激发。探针lw
‑
1的荧光在红色通道565
‑
620nm处记录，在543nm处激发。
[0042]
活细胞中lds的成像实验：将培养在35毫米玻璃培养皿底部中的活hela细胞与油酸(0.1mm)孵育不同时期。然后，将细胞进一步用5μm探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。探针lw
‑
1的红色通道荧光在565
‑
620nm处记录，在543nm处激发。
[0043]
pas共定位实验：将活的hela细胞接种到35毫米玻璃培养皿底部中，该培养皿中加入添加了10％的胎牛血清的低葡萄糖的dmem培养基，并孵育48小时。然后，将hela细胞与bsa(5mg/ml)和mg
‑
132(10μm)共同孵育10小时。随后，将hela细胞用1.5μm探针染色30分钟。然后，将细胞进一步用5μm探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。涉及的荧光在红色通道565
‑
620nm处记录，在543nm处激发。探针lw
‑
1的荧光在近红外通道660
‑
740nm处记录，并在633nm处激发。
[0044]
活细胞中pas成像实验：将接种在35毫米玻璃培养皿底部中的hela细胞与bsa(5mg/ml)和mg
‑
132(10μm)共同孵育不同时间。随后，用5μm探针lw
‑
1对hela细胞进行染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。探针lw
‑
1的荧光在近红外660
‑
740nm处记录，并在633nm处激发。
[0045]
活细胞中同时成像lds和pas实验：将接种在35毫米玻璃底部培养皿中的hepg2细胞与bsa(5mg/ml)和mg
‑
132(10μm)共同孵育不同时间。然后，将细胞进一步用5μm探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。
红色通道荧光在565
‑
620nm处记录，并在543nm处激发。近红外通道荧光在660
‑
740nm处记录，在633nm激发下。
[0046]
本发明的有益效果如下：
[0047]
(1)本发明提供了一种全新的可用于同时区分脂滴(lds)和蛋白质聚集体(pas)的双功能荧光探针，该荧光探针合成方法简单，对脂滴和蛋白质聚集体有很好的选择性：在激发为540nm时，肌氨酸、精氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、dna、rna、葡萄糖、维生素c、30％h2o2和
·
oh对检测脂滴没有影响：在激发为633nm时，肌氨酸、精氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、dna、rna、葡萄糖、维生素c、30％h2o2和
·
oh对检测蛋白质聚集体没有影响。探针lw
‑
1能够在ph＝7.4的水溶液中对不同荧光窗口的脂滴和蛋白质聚集体进行检测，并且具有良好的选择性，因此可以在细胞及动物组织中对脂滴和蛋白质聚集体进行区分检测。
[0048]
(2)经过本发明的合成方法改进后，可以有效阻止副反应的发生，极大地减少反应过程中出现难以分离的杂质，从而可以得到高纯度的目标产物。
[0049]
(3)本发明开发出了一种新型高性能用于检测细胞及小鼠肠组织内脂滴和蛋白质聚集体的双功能荧光探针。并且首次应用激光共焦扫描显微镜进行荧光成像来区分检测细胞中的脂滴和蛋白质聚集体以及衰老小鼠肠组织中的脂滴和蛋白质聚集体。为今后科研工作者对研究脂滴和蛋白质聚集体相互协同作用的生理过程提供了技术指引。
附图说明
[0050]
图1为本发明实施例1中同时区分检测脂滴(lds)和蛋白质聚集体(pas)的荧光探针的合成路线图；
[0051]
图2为实施例1提供的荧光探针对脂滴(lds)的选择性柱状图；横坐标为不同生物分子添加情况，纵坐标为荧光强度；
[0052]
图3为实施例1提供的荧光探针对聚集体(pas)的选择性柱状图；横坐标为不同生物分子添加情况，纵坐标为荧光强度；
[0053]
图4为实施例1提供的荧光探针和尼罗红检测与bsa响应情况曲线图；
[0054]
图5为实施例1提供的荧光探针和尼罗红检测与鸡蛋清响应情况曲线图；
[0055]
图6为实施例1提供的荧光探针检测水溶液中不同量脂滴的荧光滴定图；
[0056]
图7为实施例1提供的荧光探针检测水溶液中不同浓度蛋白质聚集体的荧光滴定图；
[0057]
图8为实施例1获得的荧光探针在细胞中脂滴共定位的荧光成像图(a)和成像油酸诱导hela细胞形成的脂滴的荧光图(b)；
[0058]
图9为实施例1获得的荧光探针快速染色细胞中的脂滴荧光图；
[0059]
图10为实施例1获得的荧光探针染色细胞中的脂滴免洗实验荧光图；
[0060]
图11为实施例1获得的荧光探针成像逐渐增加的蛋白质聚集体的荧光图(a)和在细胞中蛋白质聚集体共定位的荧光成像图(b)；
[0061]
图12为实施例1获得的荧光探针同时区分检测细胞中的脂滴(lds)和蛋白质聚集体(pas)的荧光成像图。
[0062]
图13为实施例1获得的荧光探针检测衰老小鼠肠组织中的脂滴(lds)和蛋白质聚集体(pas)。
具体实施方式
[0063]
以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
[0064]
实施例1：
[0065]
荧光探针的合成，制备步骤概括为：
[0066]
步骤1、称取间二乙氨基苯酚溶于浓盐酸和水的混合溶液中，再称取亚硝酸钠溶于水中。随后将间二乙氨基苯酚的盐酸溶液置于冰浴环境下，再逐滴加入亚硝酸钠溶液。滴加完毕后，继续在冰浴条件下搅拌反应。反应结束后，用布氏漏斗过滤并收集生成的固体，然后用饱和的乙酸钠溶液洗涤固体。最后通过丙酮重结晶，对获得的固体物质进行提纯，得到5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚的红色晶体。
[0067]
步骤2、用无水乙醇将5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚溶解在烧瓶中，然后将85％水合肼滴加到烧瓶中。在惰性气体保护下，将钯碳催化剂加入到混合物中，最后将获得的溶液加热至回流，然后搅拌直至溶液的红色消失。为了避免2
‑
氨基
‑5‑
(二乙基氨基)苯酚被氧化降解，将所得的混合物不经过纯化直接用于下一步。
[0068]
步骤3、将丙酮酸乙酯逐滴滴加到步骤2所获得的溶液中，随后在回流温度下搅拌反应。反应结束后，将反应后混合物置于室温冷却，随后减压蒸馏除去溶剂。将残余物通过柱层析色谱法进行纯化，得到黄色固体a。
[0069]
步骤4、将步骤3得到的黄色固体产物溶解在乙醇中，然后将该溶液滴加在氢氧化钠水溶液中，将所得混合物在室温下搅拌反应。然后用盐酸溶液将混合物中和至中性，再用二氯甲烷和水对混合溶液进行萃取。将收集的有机相在减压蒸馏下去除溶剂。然后将残留物质通过柱色谱法进行纯化，得到的深红色固体a。
[0070]
步骤5、将步骤4得到的深红色固体物质a用n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解。然后将碘甲烷逐滴滴加到混合溶液中，并向混合物中加入碳酸钾。然后将混合物加热搅拌反应。反应结束后，将混合溶液置于室温下冷却，随后用水和二氯甲烷对混合物进行萃取，保留有机相。将收集的有机相通过减压蒸馏除去溶剂。最后通过柱层析法进一步纯化得到固体，即得到了用于检测细胞中脂滴和蛋白质聚集体的双功能荧光探针
[0071]
如图1合成路线图所示，具体步骤如下：
[0072]
(1)用6ml～12ml浓盐酸和2ml～4ml水将3g～6g间二乙氨基苯酚溶于100ml烧瓶中，将亚硝酸钠1.5g～3g溶于6ml～12ml的水中。随后将间二乙氨基苯酚的盐酸溶液置于
‑
10～
‑
5℃冰浴环境下，再逐滴加入亚硝酸钠溶液。滴加完毕后，继续在冰浴条件下搅拌2
‑
3h。反应结束后，用布氏漏斗过滤并收集生成的固体，然后用20ml饱和的乙酸钠溶液洗涤固体。最后通过丙酮重结晶，对获得的固体物质进行提纯，得到5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚的红色晶体3.54g，产率为87.5％。
[0073]
(2)用6ml～12ml无水乙醇将1g～2g的5
‑
(二乙氨基)
‑2‑
亚硝基苯酚(1g，5.15mmol)溶解在50ml的烧瓶中，然后将4ml～8ml的85％水合肼滴加到烧瓶中。再在惰性气体保护下将0.1g～0.2g钯碳催化剂加入到混合物中，最后将获得的溶液在80～90℃加热至回流，然后搅拌反应1～2h直到溶液的红色消失。为了避免2
‑
氨基
‑5‑
(二乙基氨基)苯酚被氧化降解，将所得的混合物不经过纯化直接用于下一步。
[0074]
(3)将4ml～8ml丙酮酸乙酯逐滴滴加到上一步所获得的溶液中，随后在80～90℃的回流温度下搅拌反应3～4h。反应结束后，将混合物置于室温冷却，随后用旋转蒸发仪减
压蒸馏除去溶剂。将残余物通过柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝3∶1，v/v)进行纯化，得到黄色固体a0.840g，产率为70.3％。
[0075]
(4)将0.5g～1g的黄色固体a溶解在10ml～15ml乙醇中，然后将该溶液滴加在20ml～40ml 2m氢氧化钠水溶液中，将所得混合物在室温下搅拌反应0.5～1h。然后用盐酸溶液将混合物中和至中性，再用二氯甲烷和水对混合溶液进行萃取。将收集的有机相通过旋转蒸发仪减压蒸馏去除溶剂。然后将残留物质通过柱色谱法(丙酮：石油醚＝1：1，v/v)进行纯化，得到的化合物为深红色固体a。
[0076]
(5)将0.1g～0.2g深红色固体a用10ml～20ml n,n
‑
二甲基甲酰胺溶解。然后将25μl～50μl的碘甲烷逐滴滴加到混合溶液中，并向混合物中加入90mg～180mg碳酸钾。然后将混合物在60℃下搅拌反应12～16h。反应结束后，将混合溶液置于室温下冷却，随后用水和二氯甲烷对混合物进行萃取，保留有机相。将收集的有机相通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂。最后通过柱色谱法(硅胶；乙酸乙酯：石油醚＝1：1，v/v)对残留物进一步纯化处理，即得到了用于检测细胞中脂滴和蛋白质聚集体的双功能荧光探针。
[0077]
除去溶剂的方法均为旋转蒸发。
[0078]
实施例2：
[0079]
实施例1获得的荧光探针对多种生物分子的荧光响应。
[0080]
以甘油三油酸酯、肌氨酸、精氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、dna、rna、葡萄糖、维生素c、30％h2o2和
·
oh为原料制备各种生物相关物质的储备液。将25μl lw
‑
1储备液和适当等分的每种生物相关物种储备液放入5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph7.4)稀释至5ml，制备得到测试溶液。在记录荧光光谱(λex＝540nm和600nm)之前，将所得溶液在室温下摇匀并培养10min。检测结果如图2所示。
[0081]
从图2的结果中可以发现，只有甘油三油酸酯可使荧光探针的红色荧光显著增强，而加入其它生物分子诸如肌氨酸、精氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、dna、rna、葡萄糖、维生素c、30％h2o2和
·
oh，则没有响应。
[0082]
以蛋白质聚集体(pas)、肌氨酸、精氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、dna、rna、葡萄糖、维生素c、30％h2o2和
·
oh为原料制备各种生物相关物质的储备液。将25μl lw
‑
1储备液和适当等分的每种生物相关物种储备液放入5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)稀释至5ml，制备得到测试溶液。在记录荧光光谱(λex＝633nm和687nm)之前，将所得溶液在室温下摇匀并培养10min。检测结果如图2所示。
[0083]
从图3的结果中可以发现，只有蛋白质聚集体可使荧光探针的在近红外荧光显著增强，而加入其它生物分子诸如肌氨酸、精氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、dna、rna、葡萄糖、维生素c、30％h2o2和
·
oh，则没有响应。
[0084]
实施例3：
[0085]
实施例1获得的荧光探针和商业化脂滴探针尼罗红(nile red，nr)选择性对比试验。
[0086]
以牛血清白蛋白(bsa)和鸡蛋清为原料制备各种生物相关物质的储备液。将25μl lw
‑
1储备液和适当等分的每种生物相关物种储备液放入5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)稀释至5ml，制备得到测试溶液。在记录荧光光谱(λex＝540nm和600nm)之前，将所得溶液在室温下摇匀并培养10min。检测结果如图4、图5所示。
[0087]
从图4、图5的结果中可以发现，探针lw
‑
1不会对bsa和鸡蛋清产生响应，而尼罗红则会发生荧光增强现象。因此，相比于商业化脂滴探针尼罗红，探针lw
‑
1对脂滴的专一性更好。
[0088]
实施例4：
[0089]
实施例1获得的荧光探针检测溶液中脂滴(lds)和蛋白质聚集体(pas)。
[0090]
(1)溶液中脂滴的检测：在dmso中制备lw
‑
1(1
×
10
‑3m)母液。在50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)中，室温下测定lw
‑
1(5μm)对不同量三油酸甘油酯(0～1000μg/ml)的荧光响应。将25μl lw
‑
1母液和适量甘油三油酸酯添加到5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)将溶液稀释至5ml。在记录荧光光谱(λex＝540nm)之前，将所得溶液摇匀并在室温下培养10分钟。测试结果如图6所示。
[0091]
从图6的结果显示，随着甘油三油酸酯的量增大，探针lw
‑
1在红色通道的荧光逐渐增强，因此lw
‑
1可以检测水溶液中的脂滴。
[0092]
(2)在50μm磷酸钾缓冲液(ph7.4)中，测定lw
‑
1(5μm)对不同量pas(0～1000μg/ml)的荧光响应。将25μl lw
‑
1母液和适量pas溶液(1mg/ml)添加到5ml容量瓶中，然后用50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.4)将溶液稀释至5ml。将所得溶液在室温下摇匀并培养10分钟，然后记录荧光光谱(λex＝600nm)。测试结果如图7所示。
[0093]
从图7的结果显示，随着蛋白质聚集体浓度的增大，探针lw
‑
1在近红外通道的荧光逐渐增强，因此lw
‑
1可以检测水溶液中的蛋白质聚集体。
[0094]
实施例5：
[0095]
实施例1获得的荧光探针用于细胞中脂滴和蛋白质聚集体的荧光成像。
[0096]
具体方法为：
[0097]
细胞培养：
[0098]
smmc
‑
7721细胞的培养：smmc
‑
7721细胞系获取于江苏大学医学院。smmc
‑
7721细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的dmem培养基。
[0099]
hepg2细胞的培养：hepg2细胞系获取于江苏大学医学院。hepg2细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的dmem培养基。
[0100]
hela细胞的培养：hela细胞系获取于江苏大学医学院。hela细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的dmem培养基。
[0101]
在低葡萄糖dmem中培养hela细胞：hela细胞培养在35mm玻璃培养皿中孵育24小时，培养皿中加入有10％胎牛血清的低葡萄糖dmem培养基。
[0102]
lds共定位实验：将培养在35mm玻璃培养皿底部中的smmc
‑
7721活细胞用5μm探针bodipy 493/503染色20分钟。然后，将细胞进一步用5μm的探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。bodipy 493/503涉及的荧光在绿色通道490
‑
520nm处记录，在476nm处激发。探针lw
‑
1的荧光在红色通道565
‑
620nm处记录，在543nm处激发。
[0103]
活细胞中lds的成像实验：将培养在35毫米玻璃培养皿底部中的活hela细胞与油酸(0.1mm)孵育不同时期。然后，将细胞进一步用5μm探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。探针lw
‑
1的红色通道荧光在565
‑
620nm处记录，在543nm处激发。
[0104]
如图8(a)是经过lw
‑
1与bodipy 493/503共染色的smmc
‑
7721细胞的共聚焦荧光图像。(a)是绿色通道的图像(bodipy 493/503染料的荧光)；(b)是红色通道的图像(lw
‑
1的荧光图)，(c)是由(a)和(b)叠加后的图像，可以看出a和b的图像是基本重叠的；(d)是共染色的smmc
‑
7721细胞中图(c)中的线段所示处的rois强度分布。结果表明，探针lw
‑
1可以定位在细胞的脂滴中。
[0105]
如图8(b)是lw
‑
1染色的hela细胞与oa在不同时期(a
‑
d)或不同时期不使用oa孵育的共聚焦荧光图像(λex＝543nm，λem＝565
‑
620nm)(e
‑
h)。结果表明，探针lw
‑
1可以检测细胞中刺激产生的脂滴，a
‑
d中显示，随着时间的增加，荧光强度和脂滴的大小明显增强；e
‑
h中基本无变化。
[0106]
活细胞中lds的超快、免洗染色实验：将培养在35毫米玻璃培养皿底部中的smmc
‑
7721活细胞用5μm探针分别染色5s、1min、10min和1h。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。探针lw
‑
1的红色通道荧光在565
‑
620nm处记录，在543nm处激发。
[0107]
图9中所示的(a)是染色5s后的共聚焦荧光图像，(b)染色1min后的共聚焦荧光图像,(c)染色10min后的共聚焦荧光图像，(d)染色1h后的共聚焦荧光图像。结果表明，探针lw
‑
1可以在5s内完成对细胞中脂滴的染色且染色情况与1h的染色情况没有太大的变化。
[0108]
图10中所示的是lw
‑
1染色细胞5min后用pbs洗涤的明场(a)、红色通道(b)和不洗的明场(c)、红色通道(d)。结果显示，不洗涤与洗涤的染色情况几乎是一致的，因此探针lw
‑
1可以对细胞中的脂滴进行快速、免洗染色。
[0109]
pas共定位实验：将活的hela细胞接种到35毫米玻璃培养皿底部中，该培养皿中加入添加了10％的胎牛血清的低葡萄糖的dmem培养基，并孵育48小时。然后，将hela细胞与bsa(5mg/ml)和mg
‑
132(10μm)共同孵育10小时。随后，将hela细胞用1.5μm探针染色30分钟。然后，将细胞进一步用5μm探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。涉及的荧光在红色通道565
‑
620nm处记录，在543nm处激发。探针lw
‑
1的荧光在近红外通道660
‑
740nm处记录，并在633nm处激发。
[0110]
活细胞中pas成像实验：将接种在35毫米玻璃培养皿底部中的hela细胞与bsa(5mg/ml)和mg
‑
132(10μm)共同孵育不同时间。随后，用5μm探针lw
‑
1对hela细胞进行染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。探针lw
‑
1的荧光在近红外660
‑
740nm处记录，并在633nm处激发。
[0111]
如图11(a)在不同时间与bsa(5mg/ml)和mg
‑
132(10μm)孵育的lw
‑
1染色的hela细胞的共聚焦荧光成像。a
‑
d：明场图像；e
‑
h：nir通道的荧光图像(λem＝660
‑
740nm，λex＝633nm)；i：来自图像e，f，g和h的平均强度。结果表明，探针lw
‑
1可以检测细胞中逐渐增多的蛋白质聚集体。
[0112]
如图11(b)是经过lw
‑
1与共染色的hela细胞的共聚焦荧光图像。(a)是明场的图像；(b)是红色通道的图像(染料的荧光)，(c)是近红外通道(lw
‑
1的荧光)，(d)是由(b)和(c)叠加后的图像，可以看出b和c的图像是基本重叠的；(e)是共染色的hela细胞中图(d)中的线段所示处的rois强度分布。结果表明，探针lw
‑
1可以定位在细胞的
蛋白质聚集体中。
[0113]
活细胞中同时成像lds和pas实验：将接种在35毫米玻璃底部培养皿中的hepg2细胞与bsa(5mg/ml)和mg
‑
132(10μm)共同孵育不同时间。然后，将细胞进一步用5μm探针lw
‑
1染色5分钟。使用物镜(
×
40)在leica tcs sp5 ii激光共聚焦扫描显微镜上获取荧光图像。红色通道荧光在565
‑
620nm处记录，并在543nm处激发。近红外通道荧光在660
‑
740nm处记录，在633nm激发下。
[0114]
图12是lw
‑
1染色的hepg2细胞与bsa(10μm)和mg
‑
132(10μm)在不同孵育时间下的共聚焦荧光成像。(a)
‑
(d)：明场图像；(e)
‑
(h)：在红色通道处显示的是脂滴的的荧光图像(λem＝565
‑
620nm，λex＝543nm)；(i)
‑
(l)：在nir通道显示的是蛋白质聚集体(λem＝660
‑
740nm，λex＝633nm)的荧光图像；(m)
‑
(p)：相应的红色通道和nir通道的叠加图像。结果表明，探针lw
‑
1可以区分检测细胞中的脂滴和蛋白质聚集体。
[0115]
实施例6：
[0116]
实施例1获得的荧光探针用于衰老模型中成像小鼠结肠组织中的lds和pas
[0117]
构建小鼠衰老模型：所有实验均经江苏大学动物伦理委员会批准，并按照既定的动物研究指导原则进行。幼小(3个月)icr雌性大鼠购自江苏大学实验动物中心。在研究期间，随意给小鼠喂普通的啮齿动物食物。经过2周的适应期后，将小鼠分为三个亚组：对照小鼠(a)继续饮用正常饮用水；小鼠(b)在饮用水中加入烟酰胺单核苷酸(nmn)(剂量为300mg kg
‑1day
‑1)，持续8个月；小鼠(c)在饮用水中接受烟酰胺单核苷酸(nmn)(剂量为600mg kg
‑1day
‑1)，持续8个月。将所有小鼠以12小时：12小时的明暗循环圈饲养在动物保育设施中。
[0118]
结肠组织中lds和pas的荧光成像：麻醉小鼠a，小鼠b和小鼠c后，取出肠组织。将三组肠组织浸入在hoechst 33258(1μm)溶液中染色5分钟，以对细胞核进行染色。然后用pbs缓冲液洗涤三次，再将三组肠组织浸入在10μm探针lw
‑
1溶液中染色5分钟，接着用pbs缓冲溶液洗涤3次。清洗后的肠组织用10％多聚甲醛溶液固定20小时，然后用不同浓度梯度(100％，95％，70％)的乙醇溶液脱水，再将肠组织包埋在石蜡中，最后用切片机切成4μm的石蜡切片。小鼠d是在同一批中三个月大的icr雌性小鼠，处理过程与上述相同，获得相应的石蜡切片。然后对石蜡切片进行荧光成像。以408nm作为激发波长，在420
‑
480nm处记录蓝色荧光。以543nm作为激发波长，在565
‑
620nm处记录红色荧光。以633nm作为激发波长，在660
‑
740nm处记录近红外荧光。
[0119]
图13是衰老过程中小鼠小肠组织中lds和pas的共聚焦荧光图像。lw
‑
1(5μm)和hoechst 33258(1μm)将三个月大的小鼠的小肠组织共同染色，以(a)0mg kg
‑1day
‑1，(b)300mg kg
‑1day
‑1，以及(c)600mg kg
‑1day
‑1第1天nmn，再持续8个月。a
‑
d：分别在明场，蓝色通道(hoechst 33258的荧光)，红色通道(脂滴)和nir通道(蛋白质聚集体)中的荧光图像。e：b，c和d的叠加图像。f
‑
i：a中放大区域的明场，蓝色通道，红色通道和nir通道图像。j：g，h和i的叠加图像。(d)a：来自图像a(c)，b(c)和c(c)的平均强度。b：来自图像a(d)，b(d)和c(d)的平均强度。误差棒代表标准偏差。实验结果表明，随着小鼠衰老程度的加深，肠组织中的蛋白质聚集体也随之增加，同时还伴随着脂滴的积聚。