一种提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及复合菌剂的技术领域，尤其涉及一种提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前，根据国家农业农村部的调查数据，我国的畜禽粪便年产量在逐年增加，预计到2022年将会超过40亿吨，粪污易滋生病原微生物，直接排放过多，会对环境造成严重污染，影响农作物的生长，并限制了畜禽养殖业的生存和发展。堆肥又叫好氧堆肥化处理，是在微生物的作用下，将堆积粪便中不容易分解的物质，分解为对环境和土壤植物有利的物质。堆肥处理是养殖场处置粪便最普遍的方式，具有处理成本低、能杀灭病原菌、有效降解有机污染物等优点，在我国河北、内蒙古等北方省区应用广泛，但北方地区秋冬季节气温偏低，导致堆肥发酵慢、效率低，在低温条件下将牛粪顺利堆肥是一个亟待解决的关键问题，同时牛粪中的纤维素、木质素等难降解物质主要在高温期进行分解，但是由于温度过高，大部分微生物无法生存。
3.随着养牛业的快速发展，牛粪对环境的污染日益严重，实现牛粪污资源化利用的堆肥方法受到广泛关注。环境温度较低时，牛粪堆肥出现堆体难以启动、堆体温度无法升高、粪便无法有效快速发酵等问题。通过牛粪堆肥试验，研制一种提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂，不仅可以迅速提高堆体温度，还可以在秋冬季节加快低温启动，从而达到使初期堆温快速上升，延长高温期，缩短发酵周期，提高有机肥品质和无害化处理的目的。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于为克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种能提高牛粪堆肥发酵效率、促进农作物生长的提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂及其制备方法和应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂的制备方法，包含如下步骤：
7.(1)将麸皮和锯末混合，得混合物a；
8.(2)将混合物a与葡萄糖、耐高温菌混合，得混合物b；
9.(3)将混合物a与葡萄糖、耐低温菌混合，得混合物c；
10.(4)将混合物b和混合物c混合，即得可提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂。
11.优选的，所述步骤(1)中，所述麸皮和锯末的质量比为1:0.5～1.5。
12.优选的，所述步骤(2)与步骤(3)中混合物a的质量比为3～5:11～13。
13.优选的，所述步骤(2)中，所述混合物a、葡萄糖、耐高温菌的用量比为350～450g:50～150g:350～450ml；
14.所述耐高温菌是由嗜热链球菌accc 10651和地衣芽孢杆菌accc 19372按照1:0.5～1.5的体积比组成。
15.优选的，所述步骤(3)中，所述混合物a、葡萄糖、耐低温菌的用量比为1100～1300g:250～350g:1100～1300ml；
16.所述耐低温菌是由地衣芽孢杆菌accc 01172、地衣芽孢杆菌accc 01958、巨大芽孢杆菌accc 02979、巨大芽孢杆菌accc 01997、蜡状芽孢杆菌accc 01547和苏云金芽孢杆菌accc 04323按照1:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5的体积比组成。
17.优选的，所述步骤(4)中，在混合前还包括对混合物b和混合物c进行烘干的步骤，所述混合物b的烘干温度为50～60℃，所述混合物c的烘干温度为20～30℃，所述烘干为烘干至恒重。
18.本发明还提供了一种提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂。
19.本发明还提供了提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂在牛粪堆肥发酵过程中的应用。
20.优选的，所述提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂的接种量为占牛粪堆肥总质量的0.90～0.95％，所述发酵的温度为45～55℃，发酵的时间为5～7天。
21.本发明的有益效果如下：
22.本试验通过将耐高温菌和耐低温菌混合制备的固体复合菌剂添加在牛粪中，缩短了堆肥发酵时间并提高了堆肥效率和有机肥品质，对于减少环境污染、促进农作物生长等具有重要意义。
附图说明
23.图1为堆肥过程中温度的变化；
24.图2为堆肥过程中ph的变化(*表示差异显著)；
25.图3为堆肥过程中含水率的变化(*表示差异显著)；
26.图4为堆肥过程中c/n的变化(*表示差异显著；**表示差异极显著)；
27.图5为堆肥过程中有机质的变化(*表示差异显著；**表示差异极显著)；
28.图6为堆肥过程中全磷的变化；
29.图7为堆肥过程中全钾的变化；
30.图8为堆肥过程中gi的变化(*表示差异显著；**表示差异极显著)；
31.图9为alpha指数稀疏曲线；
32.图10为门水平物种组成；
33.图11为属水平物种组成。
具体实施方式
34.本发明提供了一种提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂的制备方法，包含如下步骤：
35.(1)将麸皮和锯末混合，得混合物a；
36.(2)将混合物a与葡萄糖、耐高温菌混合进行发酵，得混合物b；
37.(3)将混合物a与葡萄糖、耐低温菌混合进行发酵，得混合物c；
38.(4)将混合物b和混合物c混合，即得可提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂。
39.在本发明中，所述步骤(1)中，所述麸皮和锯末的质量比优选为1:0.5～1.5，进一
步优选为1:1。
40.在本发明中，所述步骤(2)与步骤(3)中混合物a的质量比优选为3～5:11～13，进一步优选为1:3。
41.在本发明中，所述步骤(2)中，所述混合物a、葡萄糖、耐高温菌的用量比优选为350～450g:50～150g:350～450ml，进一步优选为400g:100g:400ml；
42.所述耐高温菌是优选由嗜热链球菌accc 10651和地衣芽孢杆菌accc 19372按照1:0.5～1.5的体积比组成，进一步优选按照1:1的体积比组成。
43.在本发明中，所述步骤(3)中，所述混合物a、葡萄糖、耐低温菌的用量比优选为1100～1300g:250～350g:1100～1300ml，进一步优选为1200g:300g:1200ml；
44.所述耐低温菌是优选由地衣芽孢杆菌accc 01172、地衣芽孢杆菌accc 01958、巨大芽孢杆菌accc 02979、巨大芽孢杆菌accc 01997、蜡状芽孢杆菌accc 01547和苏云金芽孢杆菌accc 04323按照1:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5的体积比组成，进一步优选按照1:1:1:1:1:1的体积比组成。
45.在本发明中，所述步骤(4)中，在混合前还优选包括对混合物b和混合物c进行烘干的步骤，所述混合物b的烘干温度优选为50～60℃，进一步优选为55℃，所述混合物c的烘干温度优选为20～30℃，进一步优选为25℃，所述烘干优选烘干至恒重。
46.本发明还提供了一种提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂。
47.本发明还提供了提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂在牛粪堆肥发酵过程中的应用。
48.在本发明中，所述提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂的接种量优选为占牛粪堆肥总质量的0.90～0.95％，进一步优选为占牛粪堆肥总质量的0.94％，所述发酵的温度优选为45～55℃，进一步优选为50℃，发酵的时间优选为5～7天，进一步优选为6天。
49.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
50.以下实施例中的耐高温菌(嗜热链球菌accc 10651、地衣芽孢杆菌accc 19372)和耐低温菌(地衣芽孢杆菌accc 01172、地衣芽孢杆菌accc 01958、巨大芽孢杆菌accc 02979、巨大芽孢杆菌accc 01997、蜡状芽孢杆菌accc 01547、苏云金芽孢杆菌accc 04323)均购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
51.实施例1
52.将麸皮和锯末混合，得混合物a；
53.将350g混合物a与50g葡萄糖、350ml耐高温菌混合，得混合物b；
54.将1100g混合物a与250g葡萄糖、1100ml耐低温菌混合，得混合物c；
55.将混合物b于50℃的条件下烘干，将混合物c于20℃的条件下烘干至恒重，再将烘干后的混合物b与混合物c混合，即得可提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂。
56.实施例2
57.将麸皮和锯末混合，得混合物a；
58.将400g混合物a与100g葡萄糖、400ml耐高温菌混合，得混合物b；
59.将1200g混合物a与300g葡萄糖、1200ml耐低温菌混合，得混合物c；
60.将混合物b于55℃的条件下烘干，将混合物c于25℃的条件下烘干至恒重，再将烘
干后的混合物b与混合物c混合，即得可提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂。
61.实施例3
62.将麸皮和锯末混合，得混合物a；
63.将450g混合物a与150g葡萄糖、450ml耐高温菌混合，得混合物b；
64.将1300g混合物a与350g葡萄糖、1300ml耐低温菌混合，得混合物c；
65.将混合物b于60℃的条件下烘干，将混合物c于30℃的条件下烘干至恒重，再将烘干后的混合物b与混合物c混合，即得可提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂。
66.以实施例2中所得的提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂为例，进行如下实验：
67.以下实验中的牛粪均为经过干湿分离含水率为60％的新鲜牛粪，由河北农业大学试验牛场提供；
68.实验分组：
69.t组：将实施例2中所得复合菌剂与牛粪混合均匀，复合菌剂接种量为0.94％；
70.c组：将等量的麸皮、锯末和葡萄糖与牛粪混合均匀。
71.2020年12月建立经过22d，堆肥当天记录为第1d，定时取样，理化指标采样时间为第0、5、10、15和20d，试验组设为t组，对照组设为c组。高通量测序采样时间为堆肥初期(t1、c1)、升温期(t2、c2)、高温期(t3、c3)、降温期(t4、c4)和腐熟期(t5、c5)五个时期，从堆体四个角和中心部位(15cm、30cm、45cm)处分别取样，将同时期不同部位的样品均匀混合，一部分
‑
20℃保存用于理化指标检测，另一部分
‑
80℃保存，用于高通量测序分析物种组成和各阶段优势微生物。
72.实验例1
73.研究实施例2中所得复合菌剂对堆肥温度的影响：每天在9:00和17:00各测量一次，测量所有取样点求平均值作为当天的堆温并测量室温。结果如图1所示。
74.堆肥过程需要22d，由图1可知，试验组(t组)和对照组(c组)的堆肥温度变化趋势基本一致，先升高后降低。然而，t组和c组第1d堆温分别为28.3和21.0℃；t组温度快速上升，比c组提前两天到达高温阶段，第5d进入高温期温度为55.3℃，第8d达到堆肥最高温59.7℃，高温阶段持续7d；c组第7d温度为55.3℃，第9d达到最高温56.3℃，高温阶段持续5d，基本符合我国《粪便无害化卫生标准(gb7959
‑
87)》。可见，与对照组相比，添加实施例2的复合菌剂可以迅速启动堆肥初始温度，提高堆肥最高温并延长高温时间。
75.实验例2
76.研究实施例2中所得复合菌剂对堆肥ph的影响：采用ph计测量。结果如图2所示。
77.由图2可知，堆肥中ph值先升高再降低。初始ph值在8.0左右，随着堆肥过程的进行，第5d时，试验组ph值与对照组相比显著升高(p＜0.05)，其他时间段试验组与对照组均无显著差异。ph值第10d达到最大值，随后ph值一直下降，在结束时降到最低值，维持在8.0
‑
8.5之间。可见，与对照组相比，添加实施例2的复合菌剂可以加快ph值变化。
78.实验例3
79.研究实施例2中所得复合菌剂对堆肥含水率的影响：采用105℃烘干法进行测定。结果如图3所示。
80.由图3可知，试验组(t组)和对照组(c组)的堆肥初始含水率均为60.0％，两组堆肥含水率变化趋势基本一致。堆肥结束时，c组含水率下降了18.4％，t组最终下降了24％，15d
时两组差异显著。可见，与对照组相比，将实施例2的复合菌剂添加在牛粪堆肥过程中可以促进水分含量下降。
81.实验例4
82.研究实施例2中所得复合菌剂对堆肥过程中c/n的影响：总有机碳测定：参考国家标准gb13193
‑
91；全氮测定：参考农业行业标准nyt 297
‑
1995。结果如图4所示。
83.由图4可知，堆肥过程中c/n变化规律是一直下降，初始牛粪c/n无显著性差异，第5d时，试验组相比对照组极显著降低(p＜0.01)，其余时间段试验组相比对照组显著降低(p＜0.05)。本实验初始c/n值c组和t组分别为32.0和32.4，堆肥结束时c组和t组c/n值分别为16.4和15.1。可见，与对照组相比，添加实施例2的复合菌剂能使堆肥过程中的c/n下降更快。
84.实验例5
85.研究实施例2中所得复合菌剂对堆肥过程中有机质的影响：有机质测定：有机碳
×
1.724。结果如图5所示。
86.由图5可知，堆肥过程有机质含量呈缓慢减少趋势。0d和20d时，t组相比c组无显著性差异，5d和10d时t组相比c组极显著降低(p＜0.01)，15d时t组相比c组显著降低(p＜0.05)。c组和t组有机质的初始含量分别为682.3和682.5g.kg
‑1，最终含量分别为567.7和559g.kg
‑1，分别下降了114.6和123.5g.kg
‑1，早期堆肥牛粪中所含的大量易分解的有机物迅速分解下降快。可见，与对照组相比，添加实施例2的复合菌剂可以促进堆肥中有机质的分解。
87.实验例6
88.研究实施例2中所得复合菌剂对堆肥过程中全磷的影响：全磷测定：参考农业行业标准nyt 298
‑
1995。结果如图6所示。
89.由图6可知，堆肥过程中，全磷含量呈上升趋势。0d时t组相比c组无显著性差异，5d时t组相比c组显著升高(p＜0.05)，10d、15d和20d时t组相比c组极显著升高(p＜0.01)。c组和t组初始含量分别为54.4和55.3g.kg
‑1，最终含量分别为63.1和72.4g.kg
‑1。可见，与对照组相比，添加实施例2的复合菌剂能提高堆肥过程中总磷的含量。
90.实验例7
91.研究实施例2中所得复合菌剂对堆肥过程中全钾的影响：全钾测定：参考农业行业标准nyt 299
‑
1995。结果如图7所示。
92.由图7可知，堆肥过程中，全钾含量呈上升趋势。c组和t组初始含量都为7.4g.kg
‑1，最终含量分别为11.0和11.6g.kg
‑1。可见，与对照组相比，在堆肥过程中添加实施例2的复合菌剂能使总钾含量略有提高。
93.实验例8
94.研究实施例2中所得复合菌剂对种子发芽指数gi的影响：gi测定参照王雪“畜禽粪便新型生物有机肥料的开发及应用研究”一文中的方法进行。结果如图8所示。
95.由图8可知，堆肥过程中gi呈上升趋势。0d时t组相比c组无显著性差异，5d、10d、15d和20d时t组相比c组极显著升高(p＜0.01)。c组和t组初始gi分别26％和26.3％，最终gi分别为88.2％和92.7％，第0
‑
10d两组上升幅度最大，说明高温期对gi起关键作用，堆肥结束时两组的gi均已超过80％，可以看作该牛粪已无植物毒性或者牛粪已经腐熟。可见，与对
照组相比，添加实施例2的复合菌剂可以加快种子发芽指数。
96.实验例9
97.对实施例2中所得复合菌剂进行高通量分析：
98.数据预处理：采用单因素(anova)和lsd法进行方差分析，方差分析采用spss软件，柱状图和折线图采用graphpad软件，稀释曲线、物种组成及优势微生物分析采用软件qiime2；
99.物种组成及优势微生物：采用派森诺生物有限公司(上海)illumina平台miseq进行16s rrna测序。通过上机检测得到各样本有效数据分析物种组成和优势菌群。
100.稀释曲线的平缓程度反映了测序深度对于观测样本多样性的影响大小，曲线越平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新otu；反之，则表明alpha多样性尚未接近饱和。结果如图9所示。由图9可知，c1和t1曲线最低，依次逐渐升高，最高的是c5和t5。可见，本次试验的测序量达到符合反映本次试验中牛粪菌群的多样性组成水平。
101.c组和t组门水平牛粪堆肥样品中物种组成及优势微生物如图10所示。共检出31个门，图10仅显示丰度最高前10个。物种组成主要包括：变形菌门(proteobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、厚壁菌门(firmicutes)、放线菌(actinobacteria)、绿湾菌门(chloroflexi)、thermi、柔膜菌门(tenericutes)和疣微菌门(verrucomicrobia)。各种菌群多样性在c组和t组的变化规律基本一致，但是丰度占比有很大差异。proteobacteria是两组各阶段的优势微生物，占比均为58.0％相差不大；bacteroidetes存在各阶段，但是高温期的丰度占比最高，c3和t3丰度分别为32.5％和35.5％；firmicutes在堆肥结束几乎不存在，为堆肥初期(c1、t1)和升温期(c2、t2)优势微生物，c1、t1、c2、t2丰度分别为17.9％、24.4％、13.0％、14.4％；actinobacteria是初期、降温期(c4、t4)和腐熟期(c5、t5)优势微生物，丰度占比均为8.0％左右相差很小；chloroflexi是降温期和腐熟期优势微生物，c4、t4、c5、t5丰度分别为11.2％、12％、13.3％、20.3％。可见，与对照组相比，添加实施例2的复合菌剂会改变细菌生长繁殖情况，改变各菌种在不同堆肥阶段丰度占比，使优势微生物数量增加。
102.c组和t组属水平牛粪堆肥样品中物种组成及优势微生物如图11所示。共检出41个属，图11仅显示丰度最高前10个。物种组成主要包括：其他菌(others)、假单胞菌属(pseudomonas)、放线菌属(acinetobacter)、嗜冷杆菌属(psychrobacter)、鲁氏丝状杆菌(ruminofilibacter)、纤维弧菌属(cellvibrio)、栖海面菌属(aequorivita)、藤黄色单胞菌属(luteimonas)、b
‑
42和棒状杆菌属(corynebacterium)。除了others占比最高外，pseudomonas升温期的优势微生物，c2和t2丰度分别为22.0％和23.0％；acinetobacter、psychrobacter和corynebacterium是初期的优势微生物，c1和t1丰度分别为10.1％、23.4％、17.0％、15.0％、4.9％和5.2％；cellvibrio是高温期的优势微生物丰度为t36.0％和c35.0％；ruminofilibacter降温期和腐熟期的优势微生物，丰度由1.0％上升至c5中3.7％，由7.0％上升至t5中10.0％；藤黄色单胞菌属(luteimonas)和b
‑
42在各组各阶段占比很小，但依然可以看出是高温期及降温期的优势微生物。可见，与对照组相比，在堆肥前添加实施例2的复合菌剂会改变各种微生物在堆肥不同时期的丰度占比，使优势微生物数量增加。
103.综上可知，在牛粪堆肥中添加本发明制备的提高牛粪发酵效果的固体复合菌剂，可有效缩短堆肥时间并提高堆肥效率和有机肥品质。高通量测序发现，堆肥温度和微生物数量是堆肥成功的关键。本发明的复合菌剂可以迅速启动堆肥初始温度，提高堆肥最高温并延长高温时间，且会改变细菌生长繁殖情况，改变各菌种在不同堆肥阶段的丰度占比，使优势微生物数量增加。
104.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。