杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法与流程

1.本发明属于干细胞技术领域，具体涉及杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法。


背景技术：

2.近年来，随着对脂肪间充质干细胞研究的深入，其在膝骨关节炎治疗中的前景越发突显出来。促进脂肪间充质干细胞的增殖和提高其成软骨分化能力一直是研究的热点和难点。以往研究中多采用一些化学物质及细胞因子来促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化，但由于价格昂贵和安全性问题而无法广泛应用于临床实践中。


技术实现要素：

3.针对现有技术中心存在的上述问题，本发明提供了杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法，在促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化的同时又能够降低其成本，安全性好。
4.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的的技术方案是：
5.杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用，具体为在体外培养体系中加入杜仲苷以促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化。
6.进一步地，所述体外培养体系包括高糖dmem培养基 10％胎牛血清 1％双抗溶液。
7.进一步地，向体外培养体系中加入10ng/ml杜仲苷，然后对脂肪间充质干细胞进行培养。
8.进一步地，培养条件为5％co2的培养箱，培养温度为37℃。
9.本发明还公开了一种促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的体外培养体系，包括杜仲苷。
10.进一步地，上述体外培养体系中，杜仲苷的加入量为10ng/ml。
11.本发明还公开了一种促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的方法，包括以下步骤：
12.s1、原代脂肪间充质干细胞获取：
13.s1.1、经手术患者知情同意，无菌条件下获取人工膝关节置换手术后患者废弃的髌下脂肪垫，将其移入无菌操作台，用无菌眼科剪剪掉肉眼可见的红色血管以及白色结缔组织，然后将剩余脂肪组织剪成1.0
‑
2.0mm3碎块，dpbs清洗两次，每次5min；
14.s1.2、用0.25％胰蛋白酶在37℃消化1h，吸弃0.25％胰蛋白酶，加入用不含血清的高糖dmem培养基配制的0.2％i型胶原酶溶液，消化过夜；
15.s1.2、第2天转移至50ml离心管内，小心吸取下层液体然后经过40μm细胞过滤网过滤，再转移至15ml离心管，1500r/min离心，沉淀用2ml基础培养基溶解并且转入细胞培养瓶中，放入37℃、5％co2的细胞培养箱中培养，1
‑
2d后会见到细胞贴壁生长，即得原代脂肪间
充质干细胞；
16.s2、原代脂肪间充质干细胞体外培养：将得到的原代脂肪间充质干细胞培养24h后进行半量换液，48h后进行全量换液，之后每2天换液1次，培养5
‑
7d后，原代脂肪间充质干细胞可生长融合达到90％以上，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3传代接种到新的细胞培养瓶中持续体外培养，即得二代脂肪间充质干细胞；
17.s3、促进增殖：取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，待细胞生长，融合度达到80％时，在基础培养基上加入10ng/ml杜仲苷，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养24h；
18.s4、促进成软骨分化：取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，在基础培养基上加入10ng/ml杜仲苷、10ng/ml tgf
‑
β3、100nmol/l地塞米松、1％its
‑
g、50μg/ml维生素c以及40μg/ml脯氨酸，每2天换液1次，连续培养14天。
19.进一步地，所述基础培养基包括高糖dmem培养基 10％胎牛血清 1％双抗溶液。
20.相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
21.本发明的方法提高了脂肪间充质干细胞的增殖活性和细胞数量，并且提高了脂肪间充质干细胞acan、col2a1、sox
‑
9基因的表达，体现出了更强的成软骨分化的活性，并且，本发明通过在体外培养体系中加入杜仲苷来促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化，相较于现有技术采用化学物质及细胞因子而言，成本更低，安全性更好，进步显著。
附图说明
22.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
23.图1中的a为对照组中的脂肪间充质干细胞在96孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；b为实验组中的脂肪间充质干细胞在96孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；
24.图2中的a为对照组中的脂肪间充质干细胞在6孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；b为实验组中的脂肪间充质干细胞在6孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；
25.图3中的a为对照组中的脂肪间充质干细胞培养14天后的成软骨诱导分化的细胞形态及生长特征图；b为对照组中的脂肪间充质干细胞培养14天后的成软骨诱导分化的细胞形态及生长特征图。
具体实施方式
26.下面将结合实例和附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
27.1.实验器材：
28.cellometer mini自动细胞计数仪(美国nexcelom公司)；
29.varioskan flash全波长多功能酶标仪(美国thermo公司)；
30.3k30冷冻高速离心机(德国sigma公司)；
31.class ii type b2生物安全柜(新加坡esco公司)；
32.3111co2细胞培养箱(美国thermo公司)；
33.dmi8倒置荧光显微镜(德国leica公司)；
34.steponeplus实时荧光定量pcr仪(美国thermo公司)；
35.40μm细胞过滤网(美国biologix公司)。
36.2.实验步骤：
37.s1、原代脂肪间充质干细胞获取：
38.s1.1、经单位伦理委员会批准及手术患者知情同意，无菌条件下获取人工膝关节置换手术后患者废弃的髌下脂肪垫，将其移入无菌操作台，用无菌眼科剪剪掉肉眼可见的红色血管以及白色结缔组织，然后将剩余脂肪组织剪成1.0
‑
2.0mm3碎块，dpbs清洗两次，每次5min；
39.s1.2、用0.25％胰蛋白酶在37℃消化1h，吸弃0.25％胰蛋白酶，加入用不含血清的高糖dmem培养基配制的0.2％i型胶原酶溶液，消化过夜；
40.s1.2、第2天转移至50ml离心管内，小心吸取下层液体然后经过40μm细胞过滤网过滤，再转移至15ml离心管，1500r/min离心，沉淀用2ml基础培养基溶解并且转入细胞培养瓶中，具体地，所述基础培养基包括高糖dmem培养基 10％胎牛血清 1％双抗溶液；放入37℃、5％co2的细胞培养箱中培养，1
‑
2d后会见到细胞贴壁生长，即得原代脂肪间充质干细胞；
41.s2、原代脂肪间充质干细胞体外培养：将得到的原代脂肪间充质干细胞培养24h后进行半量换液，48h后进行全量换液，之后每2天换液1次，培养5
‑
7d后，原代脂肪间充质干细胞可生长融合达到90％以上，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3传代接种到新的细胞培养瓶中持续体外培养，即得二代脂肪间充质干细胞；
42.s3、促进增殖：
43.传统方法与本发明方法的细胞od值比较：
44.取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，1500r/min离心10min后，用基础培养基重悬并调整细胞密度约为5
×
104个/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，待细胞生长，融合度达到80％时，将96孔板里的细胞分为两组：
45.对照组：继续用基础培养基进行培养；
46.实验组：在基础培养基上加入10ng/ml杜仲苷，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养；
47.对照组和实验组培养24h后，每孔加入cck8试剂10μl，继续培养1h后，用多功能酶标仪检测两组细胞od值，结果见表1：
48.表1传统方法与本发明方法的细胞od值比较
49.分组第一次细胞od值第二次细胞od值第三次细胞od值细胞平均od值对照组1.04
±
0.071.02
±
0.101.04
±
0.091.03
±
0.08实验组1.56
±
0.12**1.59
±
0.10**1.57
±
0.12**1.57
±
0.11**
50.注：与传统方法比较，
**
p<0.01
51.传统方法与本方明方法的细胞数量比较：
52.取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，1500r/min离心10min后，用基础培养基重悬并调整细胞密度约为1
×
105个/ml，以每孔1ml接种于6孔板中，待细胞生长，融合度达到80％时，将6孔板里的细胞分为两组：
53.对照组：继续用基础培养基进行培养；
54.实验组：在基础培养基上加入10ng/ml杜仲苷，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养；
55.对照组和实验组培养24h后，用0.25％胰蛋白酶消化每孔细胞，1500r/min离心10min后，用1ml基础培养基重悬细胞，然后用自动细胞计数仪检测两组细胞数量，结果见表2：
56.表2传统方法与本发明方法的细胞数量比较
[0057][0058]
s4、促进成软骨分化：
[0059]
传统方法与本发明方法的细胞成软骨分化相关基因表达比较：
[0060]
取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，1500r/min离心10min后，用基础培养基重悬并调整细胞密度约为1
×
105个/ml，以每孔1ml接种于6孔板中，并将6孔板里的细胞分为两组：
[0061]
对照组：在基础培养基上加入10ng/ml tgf
‑
β3、100nmol/l地塞米松、1％its
‑
g、50μg/ml维生素c以及40μg/ml脯氨酸；
[0062]
实验组：在基础培养基上加入10ng/ml杜仲苷、10ng/ml tgf
‑
β3、100nmol/l地塞米松、1％its
‑
g、50μg/ml维生素c以及40μg/ml脯氨酸；
[0063]
对照组和实验组细胞均为每2天换液1次，在连续培养的第14天用trigol收集两组细胞，采用rt
‑
qpcr检测两组细胞acan、col2a1和sox
‑
9基因表达，结果见表3：
[0064]
表3传统方法与本发明方法的细胞成软骨分化相关基因表达比较
[0065]
分组acancol2a1sox
‑
9对照组1.00
±
0.151.00
±
0.191.00
±
0.26实验组2.76
±
0.35
**
5.54
±
0.75
**
3.85
±
0.32
**
[0066]
注：与传统方法比较，
**
p<0.01
[0067]
综上所述，本发明的方法提高了脂肪间充质干细胞的增殖活性和细胞数量，并且提高了脂肪间充质干细胞acan、col2a1、sox
‑
9基因的表达，体现出了更强的成软骨分化的活性。
[0068]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。