一种卵巢癌类器官培养试剂盒及其培养方法与流程

本发明涉及类器官培养，具体涉及一种卵巢癌类器官培养试剂盒及其培养方法。

背景技术：

1、近年来，类器官技术已在结直肠癌、胃癌等肿瘤模型中取得显著进展，形成了较为成熟的三维培养体系。然而，对于卵巢癌，尤其是高级别浆液性卵巢癌（hgsoc），由于其组织来源复杂、异质性强，原代分离及体外扩增仍存在较大难度。现有培养体系多基于dmem/f12基础培养基，添加多种生长因子，但在部分卵巢癌样本中仍存在类器官形成成功率低、形态不均一、传代后结构易崩解等问题。因此，亟需一种针对卵巢癌特性优化的培养试剂盒及其培养方法，以提高原代培养成功率及传代稳定性。

2、目前，卵巢癌类器官培养普遍面临以下问题：其一，原代培养成功率低且个体差异大，不同患者样本之间类器官形成率波动明显，部分样本难以形成形态均一的类器官结构；其二，长期传代稳定性不足，类器官在传代后容易出现结构崩解、增殖减缓甚至死亡，难以维持稳定的扩增能力；其三，现有培养体系对卵巢癌组织的解离效率不高，组织消化过程耗时较长且容易造成细胞损伤，影响后续培养的细胞活性和类器官形成效率；其四，细胞悬液中细胞分散度不佳，易发生团聚，导致类器官大小不均一。

3、目前针对卵巢癌类器官原代培养成功率低且个体差异大的问题，现有技术通常通过提高基础培养基营养水平，例如添加b27、n2等补充剂，或者增加egf、fgf等生长因子浓度，以期改善细胞存活率。此外，也有研究采用高浓度基质胶以增强三维支撑结构，或在早期培养阶段加入rock抑制剂以提高细胞抗凋亡能力。然而，这些方法仅在一定程度上提高了短期细胞存活率，并未从根本上解决卵巢癌不同样本之间对培养条件依赖差异的问题。

4、卵巢癌类器官标准化培养面临组织解离效率低且细胞损伤大、原代培养成功率差异大、长期传代结构稳定性不足三重技术瓶颈；而临床对患者来源肿瘤模型构建的迫切需求、类器官技术在基础研究和转化医学中的广泛应用前景使卵巢癌类器官培养试剂盒及相应培养方法的研究迫在眉睫。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种卵巢癌类器官培养试剂盒及其培养方法，通过使用该培养试剂盒，达到提高原代类器官形成效率、改善类器官形态均一性、增强长期传代稳定性、提高组织解离后的细胞得率以及减少细胞团聚的效果。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种卵巢癌类器官培养试剂盒，所述试剂盒包括：dmem/f12基础培养基、青霉素-链霉素双抗溶液 1×、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺溶液（glutamax） 1×、缓冲液、b27 1×、n2 1×、r-spondin-1、noggin、表皮生长因子（egf）、肝细胞生长因子（hgf）、神经调节蛋白-1（nrg1）、烟酰胺（nicotinamide）、n-乙酰半胱氨酸（n-acetylcysteine）以及sb203580。

4、本发明中，r-spondin-1与noggin协同促进细胞聚集与三维结构稳定；hgf与nrg1联合添加增强细胞活力与增殖能力；同步加入的烟酰胺与n-乙酰半胱氨酸以减轻氧化应激损伤，sb203580以维持传代过程中的细胞活性，显著提升类器官的起始形成率与结构完整性。

5、进一步地，所述r-spondin-1的终浓度为450-550ng/ml；所述noggin的终浓度为80-120ng/ml。

6、进一步地，所述r-spondin-1的终浓度优选为500ng/ml。

7、进一步地，所述noggin的终浓度优选为100ng/ml。

8、进一步地，所述r-spondin-1为经hek293e细胞稳定表达纯化的his标记r-spondin-1，比活性≥1.2×106u/mg。

9、进一步地，所述noggin为经大肠杆菌表达的无内毒素noggin，内毒素＜0.1eu/μg。

10、进一步地，所述hgf的终浓度为8-12ng/ml；所述nrg1的终浓度为40-60ng/ml。

11、进一步地，所述hgf的终浓度优选为10ng/ml。

12、进一步地，所述nrg1的终浓度优选为50ng/ml。

13、进一步地，所述hgf为人源糖基化hgf，纯度≥95%，sds-page呈单条带。

14、进一步地，所述nrg1为人源nrg1-β1，单体含量≥98%。

15、进一步地，所述nicotinamide与n-acetylcysteine的摩尔浓度比为4:1。

16、进一步地，所述nicotinamide纯度≥99.5%、晶体粒径≤50 μm，n-acetylcysteine为l-型无水结晶、纯度≥99.0%。

17、进一步地，所述sb203580的终浓度为0.8-1.2μm。

18、进一步地，所述sb203580的终浓度优选为1μm。

19、进一步地，所述sb203580是以dmso为溶剂配制成10mm母液，避光-80℃保存，单次冻融使用，添加时dmso的终浓度≤0.1%。

20、进一步地，所述缓冲液为hepes时，hepes的终浓度为8~12mm。

21、进一步地，所述hepes的终浓度优选为10mm。

22、进一步地，所述缓冲液为hepes与nahco3的双缓冲系统时，所述hepes的浓度为25mm，所述nahco3的浓度为5mm，所述双缓冲系统的ph为7.35-7.45。

23、第二方面，本发明提供一种卵巢癌类器官的培养方法，采用第一方面的卵巢癌类器官培养试剂盒实现，包括以下步骤：

24、s1，将新鲜卵巢癌组织机械剪碎为1-2mm3的组织块，加入含有1.5mg/ml ⅳ型胶原酶的组织酶解液，37℃震荡消化20~25min，加入组织清洗液终止消化，100μm筛网过滤，300×g离心5min收集细胞沉淀；

25、s2，以含10%（v/v）基质胶的卵巢癌类器官完全培养基重悬细胞，调整密度至1×106cells/ml，按20μl/滴接种于预冷24孔板，37℃静置30min使基质胶聚合，每孔加入1ml完全培养基，于37℃、5%co2培养箱中培养，隔日半量换液，每3-4天全量换液。

26、与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：

27、1）原代类器官形成效率显著提高：在多种卵巢癌样本中，采用本发明的培养基及培养方法，原代培养成功率可达70%以上，且不同样本间的形成率差异明显减小。

28、2）类器官形态均一性显著改善：本发明培养的类器官直径变异系数（cv）由现有技术的25%以上降至15%以下，类器官呈规则球形或类球形，边缘清晰，内部结构致密，便于后续观察、计数及标准化分析。

29、3）长期传代稳定性显著增强：本发明可支持卵巢癌类器官稳定传代，且传代过程中类器官结构完整，而现有技术通常在传代后出现明显结构崩解、增殖减缓甚至死亡。本发明有效解决了长期培养中细胞活力下降和结构破坏的问题。

30、4）组织解离后细胞得率高、细胞团聚少：本发明在组织解离及后续处理过程中配合使用抗氧化保护，细胞悬液中细胞团聚比例显著降低，铺板后类器官大小分布更加均匀，实验可重复性得到有效保障。

31、综上所述，本发明在卵巢癌类器官培养的成功率、均一性及稳定性等方面均显著优于现有技术，为卵巢癌基础研究和转化应用提供了可靠的体外模型培养工具。