一种基于CRISPR技术检测鲑肾杆菌的方法与流程

本发明属于核酸检测领域，具体地涉及一种基于crispr技术检测鲑肾杆菌的方法。

背景技术：

1、鲑肾杆菌（renibacterium salmoninarum）是一种革兰氏阳性、生长缓慢的苛养型细菌，为鲑科鱼类细菌性肾病（bacterial kidney disease，bkd）的病原，该病自二十世纪三十年代被报道以来已在全球多个国家和地区的鲑鳟养殖中流行。该菌最适生长温度为15℃至18℃，对营养条件要求苛刻，需在培养基中添加半胱氨酸等成分，且在37℃条件下不能生长，常寄生于鱼体巨噬细胞内，致使常规分离培养耗时长达8至12周，临床快速诊断困难。更为棘手的是，鲑肾杆菌既可通过水体接触发生水平传播，也可经亲鱼垂直传递至鱼卵，而目前业界尚无可用的疫苗或特效药物，一旦侵入养殖群体往往难以根除。bkd已被世界动物卫生组织列入监测名录，并在瑞典等多个国家被列为法定上报疫病，其暴发可造成养殖鲑鱼接近17%的死亡率，给鲑鳟养殖业带来显著经济损失。由于缺少有效治疗手段，该病的防控高度依赖对种鱼、鱼卵及活体贸易的持续检测与阳性群体淘汰净化，常用的检测技术包括基于主要表面抗原p57的酶联免疫吸附试验、针对p57基因或16s rrna的聚合酶链式反应及实时荧光定量pcr等。由此可见，开发快速、灵敏且支持活鱼非致死取样的鲑肾杆菌检测技术，对保障鲑鳟养殖生物安全、满足进出境检疫要求具有重要现实意义。

2、本发明提供了一种检测鲑肾杆菌的方法，该方法是基于rpa-crispr技术，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的检测方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种检测鲑肾杆菌的方法。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、一方面，本发明提供了一种用于检测鲑肾杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：

4、s1、扩增待测样品得到扩增产物；

5、扩增待测样本为利用rpa扩增引物组对待测样本进行扩增，所述rpa扩增引物组序列如seq id no.9和seq id no.10所示；

6、s2、将扩增产物与cas蛋白、sgrna和单链核酸检测器接触，检测由cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测鲑肾杆菌，所述sgrna包括与cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于鲑肾杆菌的核酸，所述sgrna中与靶核酸杂交的靶向区序列如seq id no.2所示。

7、在一个实施方式中，所述方法为rpa-crispr检测方法。

8、在一个实施方式中，所述靶核酸为鲑肾杆菌基因。

9、在一个实施方式中，所述靶核酸为nc_010168.1。

10、在一个实施方式中，所述rpa扩增引物组序列如seq id no.5-12任一所示。优选的，所述rpa扩增引物组序列如seq id no.9和seq id no.10所示。

11、本发明中，所述与crispr/cas效应蛋白（cas蛋白）结合的区域又称为骨架区，该区域与cas蛋白相互作用，从而结合cas蛋白。

12、在一个实施方式中，所述grna自5’端至3’端依次包括与cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的靶向区。

13、在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的靶向区序列包含seq id no.1-3任一所示的序列；优选的，所述与靶核酸杂交的靶向区序列如seq id no. 2所示。

14、在一个实施方式中，所述与cas蛋白结合的区域如seq id no.4所示。

15、在一个实施方式中，所述sgrna的序列如seq id no.24、seq id no.25或seq idno.26任一所示。在优选的实施方式中，所述sgrna的序列如seq id no.25所示。

16、在一个实施方式中，所述cas蛋白选自v型cas蛋白，例如，cas12、cas14家族蛋白或其突变体。

17、在一个实施方式中，所述cas蛋白为cas12b。优选的，所述cas蛋白为野生型cas12b。优选的，所述cas蛋白为突变的cas12b蛋白。

18、优选的，所述cas蛋白的氨基酸序列如seq id no.13所示。

19、优选的，所述cas蛋白的氨基酸序列与野生型cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于seq id no.13所示的氨基酸序列的第958位的e突变为k。

20、优选的，所述cas蛋白的氨基酸序列与seq id no.13相比，第958位的e突变为k。

21、进一步的，所述方法还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。

22、本发明所述扩增选自pcr、基于核酸测序的扩增(nasba)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、环介导的等温扩增(lamp)、链置换扩增(sda)、解旋酶依赖性扩增(hda)、或切口酶扩增反应(near)、多重置换扩增(mda)、滚环扩增(rca)、连接酶链反应(lcr)、或衍生物扩增方法(ram)中的一种或任意几种，优选的，所述扩增为lamp扩增。

23、本发明中，所述样品可以为来自水产品。

24、本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

25、在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量cas蛋白产生的可检测信号的步骤。所述cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发任意单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。

26、在一个实施方式中，所述可检测信号还可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，例如荧光基团和淬灭基团，荧光基团选自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种或任意几种；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种或任意几种。

27、在一个实施方式中，所述单链核酸检测器为5’-fam-ttttttt-bq1-3’。

28、在一个实施方式中，所述步骤s1为rpa扩增方法。

29、优选的，所述步骤s1包括：

30、（1）将样本与扩增缓冲液充分混匀；

31、（2）取（1）混匀液，并加入核酸模板；

32、（3）加入上游引物和下游引物；

33、（4）向反应管中加入醋酸镁。

34、优选的，所述步骤s1包括：

35、（1）将样本与48 µl扩增缓冲液充分混匀；

36、（2）取（1）混匀液12µl置于八连管，并加入1.6 µl核酸模板；

37、（3）分别加入0.2µl上游引物和0.2µl下游引物（引物浓度100µm）；

38、（4）向反应管中加入1.0µl醋酸镁。

39、在一个实施方式中，所述步骤s2为crispr检测方法；优选的，所述步骤s2中的检测体系包括10×crispr buffer、cas蛋白、sgrna和单链核酸检测器；更优选的所述步骤s2中的检测体系包括1µl 1×crispr buffer、(2.5 µm) 0.4µl cas蛋白、(100ng/µl) 0.2µlsgrna和(100µm) 0.1µl单链核酸检测器；crispr反应参数为43℃/30min。

40、在一个实施方式中，所述方法的特异性强、灵敏度高。所述方法的检出限为1e1copies/t。

41、另一方面，本发明还提供了一种用于检测鲑肾杆菌的系统或组合物，所述系统或组合物包括上述rpa扩增引物组、cas蛋白、上述sgrna。进一步的，所述系统或组合物还包括上述单链核酸检测器。

42、另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物在检测鲑肾杆菌中的应用。

43、另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物在制备检测鲑肾杆菌的试剂或试剂盒中的用途。

44、发明的有益效果：

45、本发明提供了一种检测鲑肾杆菌的方法，所述方法为rpa-crispr检测方法，并采用了检测效率较高的rpa扩增引物组和sgrna，具有特异性强、灵敏度高等优点。

46、序列信息

47、本发明涉及的部分序列信息提供如下：

48、表1

49、

50、

51、下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。