一种TAT-鸭cIAP1融合蛋白的制备方法及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种tat-鸭ciap1融合蛋白的制备方法及其在神经元细胞递送中的应用。

背景技术：

1、细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，在多种疾病（如微生物感染、肿瘤、神经退行性疾病及衰老）的发病机制和进程中发挥着重要作用。因此，调控细胞凋亡通路已成为疾病治疗的一个重要研究方向。鸭细胞凋亡抑制蛋白1（duck cellular inhibitor ofapoptosis protein1，dciap1）是鸭体内的一种内源性的抗凋亡因子，它能够通过抑制caspase酶的活性来阻断细胞凋亡信号通路。因此，在疾病发展过程中外源性补充ciap1蛋白，有望为相关疾病的治疗提供一种新的干预手段。

2、然而，讲外源性蛋白作为药物应用于疾病的治疗面临着一个关键的技术障碍：生物屏障。细胞膜以及机体内的多种生理屏障（如血脑屏障、血睾屏障、血胸屏障等）严格限制了循环系统中的大分子物质（如蛋白质）进入细胞内部和特定组织。这导致蛋白药物难以在靶点达到有效浓度，极大地限制了其治疗效果。

3、目前，为了解决蛋白递送难题，目前已有研究尝试利用病毒载体或纳米材料作为递送工具。然而，这些方法普遍存在一些局限性。一是制备工艺复杂，病毒载体或纳米材料的构建与生产通常步骤繁琐，成本较高；二是生物安全性风险，病毒载体可能引发免疫反应或存在基因整合风险，而部分纳米材料的长期生物相容性和毒性尚不明确。

4、穿膜肽是一类能够携带蛋白质、核酸等多种大分子物质跨越生物膜的小分子多肽，为解决上述递送难题提供了新的思路。其中，来源于人类免疫缺陷病毒1型（hiv-1）的tat穿膜肽是目前研究最为广泛的穿膜肽之一，已有研究证实其能够介导多种外源性蛋白进入细胞。尽管tat穿膜态的应用前景广阔，但截至目前，将tat穿膜肽与抗凋亡蛋白ciap1进行融合表达，并利用其特性将ciap1蛋白高效递送至细胞内的研究目前尚未见报道。因此，开发一种基于tat穿膜肽的ciap1蛋白递送技术，具有重要的研究价值和应用潜力。

技术实现思路

1、本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种tat-鸭ciap1融合蛋白的制备方法及其应用，以解决外源性抗凋亡蛋白难以穿透细胞膜和血脑屏障等生物屏障的技术难题，通过基因工程技术，将具有高效穿透能力的tat穿膜肽与鸭ciap1蛋白融合，构建出一种新型重组融合蛋白。

2、本发明的目的在于利用tat穿膜肽的跨膜转运特性，将鸭ciap1蛋白高效递送至细胞内部，从而为开发新型的胞内靶向抗凋亡蛋白药物提供一种可行的路径。

3、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

4、第一方面，本发明提供一种具有跨膜转导活性的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白为tat-鸭ciap1蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、优选的，所述tat-鸭ciap1蛋白中包含由seq id no.3所示的核苷酸序列编码的tat肽段。

6、优选的，编码所述重组融合蛋白的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

7、第二方面，本发明提供上述重组融合蛋白tat-鸭ciap1的制备方法，包括以下步骤：

8、（1）设计tat-鸭ciap1特异性引物序列，以鸭脑组织cdna为模板，pcr扩增获得重组融合蛋白tat-鸭ciap1的基因片段；

9、（2）将基因片段经双酶切后与表达载体pet-28a连接，形成重组表达载体pet-28a-

tat-dciap1；

10、（3）将步骤（2）获得的重组表达载体pet-28a-

tat-dciap1热激转化宿主细胞，构建、筛选高表达的阳性宿主菌；

11、（4）对阳性宿主菌进行鉴定，于宿主细胞中扩大培养并诱导表达重组蛋白，收集表达产物，经破碎、离心、变性、复性、纯化得到重组融合蛋白tat-鸭ciap1。

12、优选的，步骤（1）中，所述tat-鸭ciap1特异性引物的上游引物序列如seq id no.4所示，下游引物序列如seq id no.5所示；所述上游引物的5’端带有bamh ⅰ酶切位点，且含有tat序列，下游引物的3’端带有ecor ⅰ酶切位点。

13、优选的，步骤（2）中所述的双酶切是使用bamh ⅰ和ecor ⅰ限制酶进行。

14、优选的，步骤（3）中所述的宿主细胞为大肠杆菌bl21（de3）。

15、本发明通过原核表达系统获得融合蛋白，并通过细胞试验验证其能够有效进入鸭胚成纤维细胞，为后续开发跨膜的抗凋亡蛋白药物提供了实验基础和新的技术思路。

16、第三方面，本发明提供上述重组融合蛋白tat-鸭ciap1在制备胞内靶向药物递送系统中的应用。具体而言，重组融合蛋白通过tat介导的跨膜转运将目标蛋白递送至细胞内，并经免疫荧光实验证实其转导活性。

17、本发明进一步提供上述重组融合蛋白tat-鸭ciap1在制备抗细胞凋亡药物中的应用。

18、本发明又进一步提供上述重组融合蛋白tat-鸭ciap1在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、（1）本发明利用hiv-1 tat蛋白的蛋白转导域与鸭ciap1蛋白融合，利用tat肽段非依赖性的跨膜转运机制，成功解决了鸭ciap1蛋白无法自主穿透细胞膜的难题，使其能够高效进入细胞内部；

21、（2）本发明构建了原核表达载体pet-28a-tat-dciap1，并在大肠杆菌bl21(de3)中实现了高效表达。通过优化的变性、复性及纯化工艺，能够获得高纯度的可溶性重组融合蛋白，适合大规模制备；

22、（3）本发明制备的tat-鸭ciap1融合蛋白保留了ciap1的抗凋亡活性，同时具备了胞内递送能力，为开发针对细胞凋亡相关疾病的新型生物制剂及胞内靶向药物递送系统提供了重要的物质基础。

23、总之，本发明通过基因工程手段，构建了能够表达tat穿膜肽与鸭细胞凋亡抑制蛋白1的融合蛋白的重组表达载体，利用tat穿膜肽的穿膜特性，克服血脑屏障对药物的阻碍作用，将具有抗凋亡活性的dciap1高效递送入脑内。本发明的制备工艺稳定，易于纯化，获得的融合蛋白纯度高、活性好，通过将纯化后的tat-ciap1融合蛋白与鸭胚成纤维细胞共孵育，经免疫荧光检测证实，该融合蛋白能够将鸭ciap1蛋白递送入鸭胚成纤维细胞内。本发明为利用穿膜肽向细胞内递送抗凋亡蛋白提供了一种可行的技术方案，为后续开抗凋亡蛋白药物奠定了基础。

1.一种具有跨膜转导活性的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白为tat-鸭ciap1蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述一种具有跨膜转导活性的重组融合蛋白，其特征在于，所述tat-鸭ciap1蛋白中包含由seq id no.3所示的核苷酸序列编码的tat肽段。

3.一种编码权利要求1所述重组融合蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.2所示。

4.一种重组融合蛋白tat-鸭ciap1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述一种重组融合蛋白tat-鸭ciap1的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述tat-鸭ciap1特异性引物的上游引物序列如seq id no.4所示，下游引物序列如seq id no.5所示；所述上游引物的5’端带有bamh ⅰ酶切位点，下游引物的3’端带有ecor ⅰ酶切位点。

6.根据权利要求4所述一种重组融合蛋白tat-鸭ciap1的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的双酶切是使用bamh ⅰ和ecor ⅰ限制酶进行。

7.根据权利要求4所述一种重组融合蛋白tat-鸭ciap1的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的宿主细胞为大肠杆菌bl21（de3）。

8.如权利要求1所述的重组融合蛋白tat-鸭ciap1在制备胞内靶向药物递送系统中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括制备抗细胞凋亡药物和/或制备治疗神经退行性疾病药物。