一种基于堇菜叶绿体三基因联合SNP标记的DNA身份证鉴定方法

本发明属于植物分子生物学和农业生物，尤其涉及一种基于堇菜叶绿体三基因联合snp标记的dna身份证鉴定方法。

背景技术：

1、堇菜属（

violal.）植物包含三色堇（

v. tricolor）、角堇（

v. cornuta）、紫花地丁（

v. philippica）等种类上百种，具有较高的观赏价值，近年来在园艺育种中受到广泛关注。育种工作者为获得花色、株型及叶片形态等优良性状，通常进行广泛的种间或品种间杂交。目前堇菜品种及杂交后代真实性鉴定主要依赖传统形态学观察，然而植株表型易受环境影响，且必须等待成株期才能鉴定；此外，对于亲缘关系较近的杂交后代，形态差异微小，肉眼难以准确判断其遗传真实性，严重制约了堇菜新品种的选育效率及知识产权保护。

2、随着分子生物学技术的发展，dna条形码和snp标记已被用于植物物种、品种及种质资源鉴定。与形态学鉴定相比，分子标记受生长阶段和环境条件影响较小，可为堇菜属植物及其杂交材料的早期鉴别提供技术基础。

3、美国专利us6465637b1（公开日：2002年10月15日，名称：species specific dnasequences and their utilization in identification of viola species andauthentication of “banafsha” by polymerase chain reaction）公开了利用5s rrna基因间隔区序列差异设计物种特异性引物，用于堇菜属物种鉴别及药材真伪鉴定，未涉及叶绿体

matk、

rbcl和

trnh-psba三个区域的联合snp编码。韩国专利申请kr20230040663a（公开日：2023年3月23日，名称：南瓜品种鉴别用标记组合物及其鉴别方法）公开了对南瓜属材料的

matk、

rbcl和

psba-trnh三个dna条形码区域进行序列分析和筛选物种特异性snp。该技术的研究对象为南瓜属，其参考序列、snp位点、引物及判读方式均不同于堇菜属材料。

4、cennamo p.等在论文“molecular markers in

violal. subsect.

viola:application and taxonomic implications for identification of dubiousherbarium specimens”（plant biosystems，2011，145（2）：306-323）中，利用核基因its序列和叶绿体trns-trng间隔区序列研究堇菜属植物的分类鉴定，并探讨了叶绿体序列在母系谱系追踪中的作用。该研究侧重种或亚种层面的分类及存疑标本鉴定，未形成针对育种材料的固定位点组合编码和标准化质量判定规则。anna scoppola等（2022）在

plants期刊上发表了题为“complex scenarios of reticulation, polyploidization, and speciesdiversity within annual pansies of subsect. bracteolatae (

violasect.

melanium,violaceae) in italy: insights from

5s-igshigh-throughput sequencing andplastid dna variation”的研究论文（plants 2022, 11, 1294），该研究使用了

trnh-

psba、

rps19-trnh和

trnd-trny三个叶绿体标记对堇菜属

v. arvensis、

v. hymettia、

v.

kitaibeliana和

v. tricolor进行遗传分析，揭示了该属植物复杂的网状进化关系和种间遗传多样性。

5、上述研究分别涉及物种特异性pcr鉴别、叶绿体区域snp检测以及堇菜属植物的谱系分析。尚未见针对本技术所述不同堇菜属种质材料杂交获得的后代，且采用这些技术时仍需明确用于分型的具体参考序列、snp位点组合及检测结果的判读条件。因此，亟需一种能够在不依赖成株期表型的情况下，为不同堇菜属种质材料采用与特定参考序列坐标对应的9个snp位点，限定各位点的有效读取条件、编码顺序和未匹配编码的复核步骤，以获得可比较的叶绿体单倍型分型结果，并为候选母本的单倍型相容性比较提供依据。

技术实现思路

1、本发明提供一种基于堇菜叶绿体三基因联合snp标记的dna身份证鉴定方法，使三个分别扩增区域的特定位点按照同一坐标和读取条件参与分型，并对无效读数和未匹配编码分别作出复检处理。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本方法的待测对象为不同堇菜属种质材料杂交获得的后代。本文所称三个区域为

matk区域、

rbcl区域和

trnh-psba基因间隔区。

4、本技术所述dna身份证，是以seq id no:1～3所示序列为参考，依次提取9个特定snp位点的碱基并串联形成的叶绿体单倍型编码。本文所称单倍型由这9个位点定义；编码相同表示所述9个位点的碱基组合相同，不表示三个区域的全部序列或整个叶绿体基因组均相同，也不能据此区分具有相同编码的不同材料。

5、本方法包括以下步骤：

6、（1）提取待测材料的总dna，分别扩增叶绿体matk区域、rbcl区域和trnh-psba基因间隔区，并对三个区域的扩增产物分别进行双向测序；

7、（2）将测得的

matk、

rbcl和

trnh-psba序列分别与seq id no:1、seq id no:2和seqid no:3所示参考序列进行比对；各参考序列均以5′端第一个核苷酸为第1位，按照5′→3′方向连续编号，待测序列中的插入或缺失不改变参考序列坐标；

8、（3）对各snp位点进行有效性判定：正向测序结果与反向测序结果经方向统一后碱基一致，且对应位点及其上下游各10～15 bp连续序列中不存在影响判读的插入、缺失或不确定碱基；任一位点不满足上述条件时，对相应区域重新扩增并进行双向测序，在该位点取得有效结果前不生成完整9位编码，不以其他位点推定该位点的碱基；

9、所述的以11份堇菜杂交后代的三个区域测序结果为依据，采用

viola

betonicifolia叶绿体基因组相应同源区段作为比对参考，确定用于编码的9个snp位点。参考序列用于定位和读取碱基，不据此推定待测材料的物种归属或亲本来源。

10、（4）在9个snp位点均满足有效读取条件后，依次读取

matk区域第112、237、319、647、829位、

rbcl区域第612、813位和

trnh-psba基因间隔区第619、904位的碱基，并按照上述顺序串联形成完整的9位叶绿体单倍型dna身份证编码；编码为cataaactg时归入hap-a参照单倍型，编码为agcgggaca时归入hap-b参照单倍型；

11、（5）对于不同于cataaactg和agcgggaca的完整9位编码，重新提取同一待测材料的dna，并对三个区域分别进行独立扩增和双向测序；两次完整9位编码一致，且各位点均满足步骤（3）的有效读取条件时，将其记录为区别于上述两种参照编码的叶绿体单倍型编码。

12、优选的，扩增matk区域所用引物如seq id no:4和seq id no:5所示，扩增rbcl区域所用引物如seq id no:6和seq id no:7所示，扩增trnh-psba基因间隔区所用引物如seqid no:8和seq id no:9所示。

13、复核结果中存在无效位点或者两次完整9位编码不一致时，重新检测，在取得满足上述条件的结果前不作单倍型分型。

14、优选的，还包括将杂交后代的完整9位编码与候选母本材料按本方法取得的参照编码进行比较；编码不一致时判定二者的叶绿体单倍型不相容，编码一致时仅判定相容，不据此认定所述候选母本材料为唯一母本。

15、本方法的技术作用如下：

16、1.以seq id no:1～3的5′端为起点分别定位9个位点，使snp坐标不随待测序列的插入、缺失或比对列号变化。按照

matk的5个位点、

rbcl的2个位点和

trnh-psba的2个位点依次串联，得到有明确位点对应关系的完整编码。

17、2.将9个位点均取得有效读数作为生成完整编码的条件。无效位点返回相应区域重新扩增和测序，避免以部分位点的结果代替完整检测结果；完整但未匹配参照的编码则通过重新提取dna和独立扩增、测序复核后记录。上述两类结果采用不同的复检步骤。

18、3.将后代编码与候选母本按同一方法取得的实测编码逐位比较，区分所述标记单倍型的相容与不相容。该比较可用于谱系核查，不依赖照片中表型参照材料的编码，也不以编码相同认定唯一母本。

19、在本实施例的11份材料中，该位点组合得到8份hap-a和3份hap-b。各区域的碱基组合与完整编码的对应关系见表6。