一种靶向MCM6外显子13的剪接调控寡核苷酸及其在制备抗肿瘤药物中的应用

本发明涉及生物医药，特别是涉及一种靶向mcm6外显子13的剪接调控寡核苷酸及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤细胞通常具有持续增殖能力，其增殖过程依赖稳定而高效的dna复制。微型染色体维持蛋白（minichromosome maintenance protein，mcm）家族是真核细胞dna复制许可和复制起始过程中的重要调控因子。其中，mcm2、mcm3、mcm4、mcm5、mcm6和mcm7共同形成mcm2-7异源六聚体复合物，该复合物是复制解旋酶复合物的重要组成部分，参与dna双链解开、复制叉推进和细胞周期进程维持。

2、mcm6是mcm2-7复合物的组成亚基之一，在dna复制起始、细胞周期进程以及细胞增殖维持中发挥重要作用。已有研究报道，mcm6在多种肿瘤组织中表达升高，并与肿瘤分级、增殖活性、疾病进展或患者预后存在相关性。例如，在子宫内膜癌、乳腺癌、神经母细胞瘤等肿瘤中，mcm6表达水平的升高被报道与较高的恶性生物学特征或不良临床结局相关。因此，mcm6可作为肿瘤增殖相关干预靶点之一。

3、现有针对mcm6的干预方式主要包括小干扰rna（sirna）、短发夹rna（shrna）或rnase h依赖型反义寡核苷酸等，其主要作用方式是降低mcm6 mrna水平或减少mcm6蛋白表达。该类策略能够在一定程度上抑制肿瘤细胞增殖，但仍存在若干局限：第一，mcm6作为dna复制相关基础因子，在部分正常增殖细胞中亦具有生理功能，完全或广泛降低mcm6表达可能带来潜在毒性；第二，单纯降低mcm6表达主要属于表达量调控，难以进一步利用mcm6蛋白复合物装配依赖性产生结构性干扰；第三，传统降解型核酸药物对靶基因表达量的持续抑制依赖较高递送效率和较稳定的细胞内暴露。

4、剪接调控寡核苷酸（splice-switching oligonucleotide，sso）是一类通过碱基互补方式结合pre-mrna特定区域，从而改变剪接位点识别或外显子选择的核酸药物。与降解型aso不同，sso通常不以降解靶rna为主要目的，而是通过空间位阻作用影响剪接体或剪接调控因子对pre-mrna的识别，进而诱导外显子跳跃、外显子包含、内含子保留或可变剪接位点使用。该类技术已在若干遗传性疾病中得到验证，例如通过外显子跳跃恢复或改善目标蛋白功能。然而，将sso用于肿瘤相关基因的结构性剪接干预，尤其是通过诱导关键外显子跳跃产生功能受损型异构体以抑制肿瘤细胞增殖，仍有进一步开发空间。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种靶向mcm6外显子13的剪接调控寡核苷酸及其在制备抗肿瘤药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的剪接调控寡核苷酸能够有效诱导mcm6第13号外显子跳跃，并降低mcm6全长转录本比例，为治疗子宫内膜癌提供了新的策略。

2、mcm6蛋白功能依赖其结构完整性以及其与mcm2-7复合物其他亚基之间的协同装配。若能够通过剪接调控方式诱导mcm6 pre-mrna中特定编码外显子跳跃，使其产生保留开放阅读框但缺失关键结构区域的剪接异构体，则有望在不完全清除mcm6转录本的情况下改变mcm6蛋白结构和功能，并进一步影响mcm6相关复制过程。

3、本发明基于mcm6 pre-mrna外显子结构和剪接调控区域，设计并筛选了靶向mcm6第13号外显子的剪接调控寡核苷酸。该寡核苷酸能够诱导mcm6第13号外显子跳跃，产生缺失该外显子编码区的mcm6剪接异构体，并抑制mcm6高表达肿瘤细胞的增殖。

4、基于此，本发明提供了如下方案：

5、本发明提供一种靶向mcm6外显子13的剪接调控寡核苷酸，其核苷酸序列如seq idno.21所示。

6、本发明还提供上述的剪接调控寡核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

7、进一步地，所述抗肿瘤药物针对的疾病为子宫内膜癌。

8、本发明还提供一种抗肿瘤药物，活性成分包括上述的剪接调控寡核苷酸。

9、进一步地，所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的辅料。

10、本发明还提供抑制eftud2基因表达的试剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

11、进一步地，所述抗肿瘤药物针对的疾病为子宫内膜癌。

12、进一步地，所述试剂为sirna或shrna。

13、进一步地，所述sirna的正义链的核苷酸序列如seq id no.27或seq id no.28所示。

14、进一步地，所述shrna的核苷酸序列如seq id no.24或seq id no.25所示。

15、本发明公开了以下技术效果：

16、本发明提供了一种不同于传统降解型mcm6干预策略的剪接调控方案。该方案不以全局降解mcm6 mrna为主要目的，而是通过调控mcm6 pre-mrna剪接，诱导特定外显子跳跃，从而改变mcm6转录本和蛋白结构。

17、本发明提供的剪接调控寡核苷酸靶向mcm6第13号外显子，该外显子的跳跃可产生保持开放阅读框的mcm6剪接异构体，使所得蛋白缺失第13号外显子编码的54个氨基酸残基。与引入提前终止密码子并导致nmd的策略不同，本发明可用于产生结构改变型mcm6异构体。

18、本发明提供的剪接调控寡核苷酸能够有效诱导mcm6第13号外显子跳跃，并降低mcm6全长转录本比例。实验结果显示，该剪接变化与肿瘤细胞增殖能力下降相关。

19、本发明提供的剪接调控寡核苷酸靶向mcm6第13号外显子内部靠近5'端的区域。与部分靶向外显子其他区域或剪接交界区域的候选寡核苷酸相比，该区域的寡核苷酸可获得较高的外显子跳跃效率。

20、本发明的剪接调控寡核苷酸可抑制mcm6高表达肿瘤细胞的体外增殖和克隆形成能力，并可伴随dna合成能力下降、细胞周期改变及凋亡水平升高。

21、本发明的剪接调控寡核苷酸在动物肿瘤模型中可降低肿瘤生长速度、终末肿瘤体积或终末肿瘤重量，提示其具有作为抗肿瘤核酸药物候选物的应用潜力。

22、本发明的剪接调控寡核苷酸可根据实际应用需要采用2'-ome、2'-moe、lna、cet、pmo、pna、ps骨架等多种核酸化学修饰形式，并可与脂质纳米颗粒、细胞穿透肽或其他递送系统组合使用，从而提高其稳定性、细胞摄取效率或体内应用适应性。

1.一种靶向mcm6外显子13的剪接调控寡核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.21所示。

2.一种如权利要求1所述的剪接调控寡核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物针对的疾病为子宫内膜癌。

4.一种抗肿瘤药物，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的剪接调控寡核苷酸。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的辅料。

6.抑制eftud2基因表达的试剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物针对的疾病为子宫内膜癌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂为sirna或shrna。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述sirna的正义链的核苷酸序列如seqid no.27或seq id no.28所示。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述shrna的核苷酸序列如seq id no.24或seq id no.25所示。