一种靶向MT1-MMP的双环肽、偶联物和核素探针及应用

本发明涉及临床核医学，尤其涉及一种靶向mt1-mmp的双环肽、偶联物和核素探针及应用。

背景技术：

1、核医学与分子生物学的深度融合推动医学影像技术进入分子影像学时代，正电子发射计算机断层显像（pet）通过功能学显像实现疾病分子水平的精准诊断，在肿瘤诊疗领域具备独特优势。临床常用的诊断性核素包括18f、68ga、64cu、89zr、44sc等，治疗性核素主要包括β发射体131i、90y、177lu、67cu、161tb和α发射体225ac、213bi等。核医学特异性诊疗分子探针依托肿瘤特异性标志物实现靶向，结合诊断核素可完成精准显像，结合治疗核素可实现靶向治疗，为肿瘤的早期诊断、精准分期、疗效评估、预后预测及靶向放射治疗提供了重要支撑。

2、基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidases，mmps）是一个锌依赖性蛋白酶家族，在降解细胞外基质和病理组织重塑过程中发挥重要作用。膜型mmp亚家族成员（mt-mmps）在细胞膜上表达并介导细胞周蛋白水解。其中，基质金属蛋白酶14（mmp14，又命名为膜1型基质金属蛋白酶，mt1-mmp）是调节局部细胞外基质分解的关键酶，定位在细胞膜上，在多种肿瘤中高表达，通过影响细胞外基质重塑、血管生成、脂质代谢、炎症反应等过程促进肿瘤转移。

3、分子功能显像可从分子、细胞、组织水平检测疾病的发生与发展，不仅可以早期发现癌症，也可以用于癌症治疗疗效的监测。本领域技术人员已尝试开发靶向mmp14的分子探针，如99mtc标记的抗mmp14单克隆抗体（99mtc-mt1-mab），但具有大分子量、药代动力学缓慢以及体内循环时间较长等缺陷。此外，靶向mmp14的多肽探针相继被开发，然而，探针的肿瘤摄取还有待进一步提高，以满足精准的诊断和核素靶向治疗。

4、双环肽技术是将两个短肽合成一个环肽，通过一个骨架分子结合两端，形成两个环状几何结构，一般由9～15个氨基酸组成，分子量约为1.2～2 kda，集抗体、小分子药物及肽类的特性于一身，具有良好的组织渗透率和肾脏清除率、高亲和力、高选择性等优点，且不具有免疫原性。目前，多种双环肽偶联的化疗药物（bicycle toxin conjugate，btc）已经进入期临床试验，如靶向mmp14（mt1-mmp）的btc药物bt1718等。因此，开发mmp14靶向的核医学双环肽pet分子探针具有重要实践应用意义。

5、已有现有技术报道了基于bt1718双环肽的放射性核素标记的mmp14靶向分子探针，但由于其体内代谢快，肿瘤摄取值欠佳，最佳显像时间点较早，本底尚未完全清除，肿瘤与背景的对比度不足，还需进一步优化提升。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种靶向mt1-mmp的双环肽、偶联物和核素探针及应用。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种靶向mt1-mmp的双环肽，所述双环肽包括多肽和1,3,5-三（溴甲基）苯；所述多肽的氨基酸序列如seq id no:1所示，即为ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2；其中第2位、第8位和第15位的半胱氨酸与所述1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成两个多肽环。

4、本发明还提供所述双环肽的制备方法，包括以下步骤：采用固相合成法合成氨基酸序列如seq id no:1所示的多肽，之后加入1,3,5-三（溴甲基）苯进行成环反应。

5、优选地，所述固相合成法为fmoc固相合成法。

6、第二方面，本发明还提供一种靶向mt1-mmp的双环肽偶联物，所述双环肽偶联物包括所述的双环肽和peg链，所述peg链设于如seq id no:1所示的氨基酸序列的n端，即为本发明中的ac。

7、为延长所述双环肽在体内循环的时间，根据本发明提供的一种靶向mt1-mmp的双环肽偶联物，优选地，所述peg链为peg4或peg12。当peg链为peg4时，所述双环肽偶联物即为本发明中的ac4，其氨基酸序列为：peg4-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽。当peg链为peg12时，所述双环肽偶联物即为本发明中的ac12，其氨基酸序列为：peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽。

8、为延长所述双环肽在肿瘤部位的摄取和滞留时间，根据本发明提供的一种靶向mt1-mmp的双环肽偶联物，优选地，所述peg链还连接有血清白蛋白的结合基团，所述结合基团选自4-(4-碘代苯基)丁酸、4-(4-甲基苯基)丁酸、4-(4-碘代苯基)丙酸、4-(4-碘代苯基)乙酸、马来酰亚胺丙酸和伊文思蓝中的任意一种。

9、更优选地，所述结合基团经赖氨酸与peg链相连接。

10、更优选地，所述结合基团为4-(4-碘代苯基)丁酸。在本发明中，4-碘苯丁酸、4-碘苯基丁酸和4-(4-碘代苯基)丁酸均指4-(4-iodophenyl)butanoic acid，cas号为27913-58-2。

11、本发明创新性地引入可以与人血清白蛋白结合的基团（4-碘苯丁酸），并以可以延长血液半衰期的连接基团-聚乙二醇。经过以上两个步骤的修饰后，靶向mt1-mmp的核素探针的肿瘤摄取值和肿瘤滞留得到了显著提升。进一步优选地，所述结合基团为4-(4-碘代苯基)丁酸，经赖氨酸与连接与peg12链的侧链，即为本发明中的kiac，其氨基酸序列为：{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽。

12、根据本发明提供的一种靶向mt1-mmp的双环肽偶联物，优选地，所述peg链还连接有双功能偶联剂基团，所述双功能偶联剂基团选自nota（1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸）、dota（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）、noda（1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸）、resca（基于铑的内骨架螯合剂）、dfo（去铁胺）、hynic（肼基烟酰胺）、hbed-cc（n,n"-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-n,n"-二乙酸）、dtpa（二乙烯三胺五乙酸）、3pc-neta-ncs、thp（三羟甲基磷）、typa（n-（三（羟甲基）磷丙酰胺））、macropa和苯丙硼氨酸中的任意一种。

13、更优选地，所述双功能偶联剂基团为nota或dota。

14、进一步优选地，所述双环肽偶联物选自以下(1)～(4)中的任意一种：

15、(1) nota-kiac，其氨基酸序列为：(nota)-{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽，其结构式如式（ⅰ）所示；

16、

17、式（ⅰ）；

18、(2) dota-kiac，其氨基酸序列为：(dota)-{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽，其结构式如式（ⅱ）所示：

19、

20、式（ⅱ）；

21、(3) dota-ac4，其氨基酸序列为：(dota)-peg4-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽，其结构式如式（ⅲ）所示：

22、

23、式（ⅲ）；

24、(4) dota-ac12，其氨基酸序列为：(dota)-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽，其结构式如式（ⅳ）所示：

25、

26、式（ⅳ）。

27、本发明还提供所述双环肽偶联物的制备方法，包括以下步骤：采用固相合成法合成氨基酸序列如seq id no:1所示的多肽，之后再依次加入nh-peg-cooh、lys(4-碘苯基丁酸)-oh和双功能偶联剂基团进行连接反应，再加入1,3,5-三（溴甲基）苯进行成环反应。

28、优选地，所述固相合成法为fmoc固相合成法。

29、优选地，所述nh-peg-cooh为nh-peg4-cooh或nh-peg12-cooh。

30、第三方面，本发明还提供一种核素探针，所述核素探针包括放射性核素标记的任一所述的双环肽偶联物。

31、根据本发明提供的一种核素探针，优选地，所述放射性核素标记为诊断性放射性核素或治疗性放射性核素；所述诊断性放射性核素选自18f、68ga、64cu、89zr、44sc、99mtc、89sr和67ga中的任意一种或多种；所述治疗性放射性核素选自131i、90y、177lu、67cu、161tb、225ac、213bi、89sr、188re、211at和212pb中的任意一种或多种。

32、根据本发明提供的一种核素探针，优选地，所述放射性核素与所述双功能偶联剂基团络合或螯合。

33、更优选地，所述核素探针选自以下(1)～(7)中的任意一种：

34、(1) al18f-kiac，其氨基酸序列为：al18f-(nota)-{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽；

35、(2)68ga-nkiac，其氨基酸序列为：68ga-(nota)-{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽；

36、(3)68ga-dkiac，其氨基酸序列为：68ga-(dota)-{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽；

37、(4)177lu-kiac，其氨基酸序列为：177lu-(dota)-{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽；

38、(5)225ac-kiac，其氨基酸序列为：225ac-(dota)-{lys(4-碘苯基丁酸)}-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽；

39、(6)68ga-ac4，其氨基酸序列为：68ga-(dota)-peg4-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽；

40、(7)68ga-ac12，其氨基酸序列为：68ga-(dota)-peg12-ala-cys-{d-ala}-asn-glu-{1-nal}{d-ala}-cys-glu-asp-phe-tyr-asp-{tbugly}-cys-nh2，其中三个cys以1,3,5-三（溴甲基）苯连接形成双环肽。

41、本发明的细胞及动物实验结果明确了68ga-dkiac、al18f-kiac和177lu-kiac在肿瘤细胞和肿瘤组织中的摄取量较高，滞留时间较长，所以进一步优选地，所述核素探针为68ga-dkiac、al18f-kiac或177lu-kiac。

42、本发明还提供所述核素探针的制备方法，包括以下步骤：使放射性核素与所述双环肽偶联物在适宜条件下反应，使放射性核素通过化学方式与双功能偶联剂基团络合或螯合。

43、本发明提供的上述靶向mt1-mmp的双环肽、双环肽偶联物及核素探针还可通过本领域其他已知的多肽合成或修饰方法制得。

44、第四方面，本发明还提供所述双环肽或其药学上可接受的盐、任一所述的双环肽偶联物或任一所述的核素探针在以下(1)～(3)的任意一种中的应用：(1)制备肿瘤疾病的诊断试剂；(2)制备肿瘤疾病的治疗药物；(3)与其他抗肿瘤药物联合用于制备肿瘤疾病的治疗药物；所述肿瘤疾病为mt1-mmp高表达的肿瘤疾病。

45、根据本发明提供的所述双环肽或其药学上可接受的盐、任一所述的双环肽偶联物或任一所述的核素探针的应用，优选地，所述肿瘤疾病为肉瘤、脑瘤、前列腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、尤文肉瘤、胰腺导管腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胆道癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、子宫浆液性癌和唾液腺癌中的至少一种。

46、更优选地，所述肿瘤疾病为脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胶质瘤、平滑肌肉瘤和乳腺癌中的至少一种。

47、根据本发明提供的所述双环肽或其药学上可接受的盐、任一所述的双环肽偶联物或任一所述的核素探针的应用，优选地，所述诊断试剂包括显像制剂。

48、更优选地，所述显像制剂为pet显像剂或spect显像剂。

49、根据本发明提供的所述双环肽或其药学上可接受的盐、任一所述的双环肽偶联物或任一所述的核素探针的应用，优选地，所述其他抗肿瘤药物选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、靶向肿瘤细胞抗体和免疫检查点抑制剂中的至少一种。

50、本发明提供的所述双环肽或其药学上可接受的盐、任一所述的双环肽偶联物或任一所述的核素探针在与手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、rna疗法、纳米疗法等抗肿瘤疗法中的至少一种或多种联合使用在治疗肿瘤疾病方面的应用也应在本发明的保护范围之内。

51、第五方面，本发明还提供一种显像制剂，所述显像制剂包括任一所述的核素探针。

52、根据本发明提供的一种显像制剂，优选地，所述显像制剂为pet显像剂或spect显像剂。

53、第六方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述双环肽或其药学上可接受的盐、任一所述的双环肽偶联物或任一所述的核素探针，以及药学上可接受的载体。

54、所述药物组合物可按剂量单位形式配制，每个剂量单位含预定量的活性成分，与药学可接受的载体联合可产生预期治疗效果；还可单独施用，或与其他抗肿瘤剂、抗肿瘤疗法联合施用。

55、本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述双环肽或其药学上可接受的盐、任一所述的双环肽偶联物或任一所述的核素探针，任选包含使用说明书。

56、所述药物组合物和试剂盒的施用方式包括口服、口腔、舌下、局部、肠胃外、直肠、鼻腔等，优选胃肠外给药，如静脉注射、推注、瘤内注射、皮下注射、腹膜内注射、肌内注射，最优选静脉注射或瘤内注射。

57、本发明具有如下有益效果：

58、本发明提供的靶向mt1-mmp双环肽，基于其开发的偶联物和核素探针在肿瘤部位的滞留时间显著延长，病灶摄取明显提高，在保持高mt1-mmp亲和力的同时改善了体内药代动力学行为，能够清晰显示mt1-mmp阳性病灶，可用于延时显像，有效提高微小肿瘤病灶的检出能力，并有利于血供丰富脏器中病灶的探测，并且稳定性好，安全性佳，在体内不引起急性或慢性毒性反应。本发明为mt1-mmp高表达的脑瘤、肉瘤等多种实体肿瘤的核素靶向治疗提供了新的技术选择，对推动肿瘤精准诊疗一体化发展具有重要的临床应用价值。