一种特异性靶向LINE-1的纳米抗体及其应用

本发明涉及生物，特别是涉及一种特异性靶向line-1的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、line-1（long interspersed nuclear element-1）是人类基因组中最活跃的自主逆转录转座子，占据了约17%的基因组序列，并在遗传多样性、疾病发生及基因调控中扮演着多重角色。line-1反转录转座子是哺乳动物基因组中含量最丰富、最具活性的可移动遗传元件，其活性受到严格而多层次的调控，其异常调控与发育、衰老及多种疾病密切相关。全长约6kb，编码orf1p（rna结合蛋白）和orf2p（兼具核酸内切酶en、逆转录酶rt活性）两大核心蛋白。正常细胞中line-1被dna甲基化、异染色质沉默抑制；肿瘤、衰老、自身免疫病、神经退行性疾病中line-1异常激活，持续发生基因组插入突变，破坏基因组稳定性，是肿瘤早筛、衰老机制、自身免疫病诊疗的核心生物标志物与药物靶点。

2、目前检测及阻断line-1蛋白的主流工具为传统鼠源单克隆抗体（igg），存在显著短板：

3、（1）分子尺寸大、组织穿透性差：igg分子质量大（约150kda），难以穿透致密肿瘤组织及血脑屏障，且在细胞中与line-1的结合效率低。

4、（2）稳定性不足：温度、酸碱耐受差，反复冻融易失活，不适合体内递送。

5、（3）制备成本高、产量低：杂交瘤细胞株培养周期长，大规模工业化生产成本昂贵。

6、（4）特异性与亲和力缺陷：现有多克隆/单克隆抗体易结合基因组其他转座子同源序列，背景信号高，无法精准识别line-1 orf1p/orf2p特异性表位。

7、（5）难以构建多功能偶联分子：完整igg难以与小分子药物、荧光基团、car载体高效融合，限制诊断、靶向治疗场景拓展。

8、现有的研究仅使用普通单克隆抗体进行免疫印迹、免疫荧光。

9、纳米抗体（nanobody，又称vhh抗体）是从骆驼科动物（如骆驼、羊驼）重链抗体中分离出的单域抗体，其分子量仅为传统抗体的十分之一左右（约15kda），具有体积小、稳定性高、易于表达、免疫原性低、可穿透组织屏障等显著优势，已成为生物医药领域的研究热点。但现在无特异性靶向line-1的纳米抗体序列公开，缺少低成本、高特异性识别line-1的单域抗体工具。在现有技术中仍缺乏一种能够高亲和力、特异性结合line-1并适用于追踪和降解line-1的纳米抗体。

10、因此，开发一种新型、高亲和力抗line-1的纳米抗体，实现的line-1在细胞中的精准定位和line-1相关蛋白的可逆性降解，对研究line-1的结构、细胞定位及功能至关重要。且能通过chip、coip、rip等实验研究与line-1相关蛋白、dna及rna的作用及功能。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种特异性靶向line-1的纳米抗体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该纳米抗体能够特异性地结合line-1蛋白，具有高亲和力和良好的稳定性。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种特异性靶向line-1的纳米抗体，所述纳米抗体为vhh505或vhh526；其中，所述vhh526的氨基酸序列如seq id no:8所示，所述vhh505的氨基酸序列如seq id no:15所示。

4、优选的是，所述vhh526和所述vhh505均包含框架区fr1、fr2、fr3、fr4和互补决定区cdr1、cdr2、cdr3；

5、其中，所述vhh526和所述vhh505的框架区均为fr1、fr2、fr3、fr4，所述fr1、fr2、fr3、fr4的氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5和seq id no:7所示；

6、所述vhh526的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:2、seqid no:4和seq id no:6所示；

7、所述vhh505的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:12、seq id no:13和seq id no:14所示。

8、本发明还提供编码所述的纳米抗体的核酸分子。

9、优选的是，编码所述vhh526的核酸分子的序列如seq id no:9或seq id no:10所示；

10、编码所述vhh505的核酸分子的序列如seq id no:16或seq id no.17所示。

11、本发明还提供包含所述的核酸分子的重组载体。

12、本发明还提供包含所述的重组载体的宿主菌。

13、本发明还提供一种所述的纳米抗体在制备用于检测line-1蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

14、本发明还提供一种所述的纳米抗体在制备用于降解line-1蛋白的药物或研究工具中的应用。

15、本发明还提供一种体外非诊断目的检测line-1蛋白的方法，包括使用所述的纳米抗体与待测样品接触的步骤。

16、本发明还提供一种检测line-1蛋白的试剂或者试剂盒，所述试剂盒包括所述的纳米抗体。

17、本发明公开了以下技术效果：

18、（1）高亲和力：本发明提供的纳米抗体对line-1蛋白具有极高的结合亲和力，hdock对接分数达到-402.5，alphafold3复合物结构预测的ptm+iptm值达到1.01，表明纳米抗体与line-1蛋白之间的结合非常稳定，亲和力极高。

19、（2）高特异性：本发明提供的纳米抗体能够特异性地识别line-1蛋白的活性位点区域，结合位点区域形成大量氢键，呈现出高度稳定的构象，纳米抗体hdock评分都达到了-200的结合阈值，且结合位点区域有大量氢键，呈现出非常稳定的构象。hdock对接分数越低表明结合越稳定，且具有良好的靶向特异性。

20、（3）人工智能辅助设计：本发明采用rfdiffusion、hdock和alphafold3等先进的人工智能算法，实现了纳米抗体的从头设计，避免了传统免疫方法周期长、成本高、成功率低的缺点，大幅缩短了研发周期。

21、（4）结构稳定性好：本发明提供的纳米抗体来源于骆驼科动物重链抗体框架，具有优异的稳定性和可溶性，易于在大肠杆菌等宿主细胞中表达和纯化。

22、（5）应用前景广阔：本发明的纳米抗体可广泛应用于line-1蛋白的检测、诊断，以及line-1相关疾病（如癌症、自身免疫性疾病等）的治疗药物开发，具有良好的经济效益和社会效益。

1.一种特异性靶向line-1的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为vhh505或vhh526；其中，所述vhh526的氨基酸序列如seq id no:8所示，所述vhh505的氨基酸序列如seq idno:15所示。

2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述vhh526和所述vhh505均包含框架区fr1、fr2、fr3、fr4和互补决定区cdr1、cdr2、cdr3；

3.编码权利要求1或2所述的纳米抗体的核酸分子。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，编码所述vhh526的核酸分子的序列如seq id no:9或seq id no:10所示；

5.包含权利要求3或4所述的核酸分子的重组载体。

6.包含权利要求5所述的重组载体的宿主菌。

7.一种权利要求1或2所述的纳米抗体在制备用于检测line-1蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

8.一种权利要求1或2所述的纳米抗体在制备用于降解line-1蛋白的药物或研究工具中的应用。

9.一种体外非诊断目的检测line-1蛋白的方法，其特征在于，包括使用权利要求1或2所述的纳米抗体与待测样品接触的步骤。

10.一种检测line-1蛋白的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的纳米抗体。