一种自组装抗真菌肽及其在粮食防霉中的应用

本发明涉及一种自组装抗真菌肽及其在粮食防霉中的应用，属于抗真菌肽、超分子自组装和粮食储藏防霉。

背景技术：

1、粮食在采收和储藏环节中极易遭受真菌污染，由此引发的霉变和真菌毒素问题不仅造成巨大的经济损失，更直接威胁食品安全与公众健康。烟曲霉（

aspergillus

fumigatus）作为世界卫生组织认定的最高优先级真菌病原体，广泛分布于土壤和腐烂有机物中，其产生的大量分生孢子可侵染玉米、花生、小麦等粮食作物，导致籽粒霉变及黄曲霉毒素等强致癌性代谢产物的积累。

2、目前粮食防霉主要依赖化学杀菌剂（如三唑类、甲氧基丙烯酸酯类），但长期大量使用已导致耐药性快速蔓延，残留问题也严重制约其可持续应用。抗菌肽（antimicrobialpeptides, amps）因其物理破膜杀菌机制而展现出较低的耐药性进化风险，被视为化学杀菌剂的潜在替代品，已有乳酸链球菌素（nisin）等产品在食品防腐中获得应用。

3、然而，现有抗菌肽在粮食防霉中的直接应用仍面临活性瓶颈。抗真菌肽通常通过与真菌细胞膜作用而发挥抑制作用，但常规线性肽在溶液中以分散单体为主，局部有效浓度和膜亲和力有限，往往需要较高剂量才能达到抑菌效果。专利cn112430262b公开了三种富含正电荷的亲水/亲油氨基酸组成的抗真菌肽；专利cn104059129a公开了一种抗真菌肽，能够抑制黄曲霉毒素但侧重体外活性与机制设想，未披露体内疗效、安全性（溶血/宿主毒性），尚不足以支撑临床转化。现有技术中虽有对线性抗真菌肽进行序列改造以提升其活性的尝试，但均未揭示通过特定疏水帽和二苯丙氨酸结构单元驱动有序自组装、并以该自组装作为低mic抗真菌活性必要条件的技术路径。真菌孢子致密的细胞壁结构也对多肽分子构成高效穿透屏障，进一步削弱了实际抑菌效果。

4、自组装肽（self-assembling peptides）可通过分子间非共价键自发形成有序纳米结构，产生多价效应和局部富集效应，为解决上述活性瓶颈提供了新思路。目前已报道的食源自组装肽（如大麦、绿豆来源等）均聚焦于疏水性功能因子的包埋递送，不具备直接的抗真菌能力。具备抗真菌活性的线性抗菌肽又缺乏自组装结构设计，难以实现活性增强。将自组装策略与抗真菌功能进行分子层面的有机结合，并建立结构、组装与活性之间的明确因果关系，是该领域亟待突破的核心难题，目前尚无系统研究报道。

5、因此，开发一种能够自组装且具有强抗真菌性能的抗真菌肽，并用于粮食防霉具有极高的实用价值与经济价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明通过模块化设计策略，将疏水帽（nap）、自组装连接子（phe-phe）和阳离子抗真菌域进行结构整合，获得了一种具有优异自组装能力和抗真菌活性的多肽nap-dmkf。本发明首次揭示了特定疏水帽与二苯丙氨酸结构单元协同驱动有序自组装，且该自组装行为是肽分子获得低mic抗真菌活性的必要条件。

2、本发明的第一个目的是提供一种自组装抗真菌肽，所述自组装抗真菌肽结构为：nap-dmet-lys-arg-trp-dmet-lys-phe-phe-arg-arg-phe-nh2；其中，nap为2-萘乙酰基，dmet为d-甲硫氨酸。

3、在一种实施方式中，所述自组装抗真菌肽包括：由nap构成的疏水帽、由phe-phe构成的自组装连接子以及由dmet-lys-arg-trp-dmet-lys-phe-phe-arg-arg-phe-nh2构成的阳离子抗真菌域。

4、在一种实施方式中，dmet-lys-arg-trp-dmet-lys-phe-phe-arg-arg-phe是在氨基酸序列如seq id no.1所示的基础上，将甲硫氨酸（met，l-甲硫氨酸）替换为d-甲硫氨酸（即，dmet）；l-甲硫氨酸与d-甲硫氨酸互为镜像。

5、在一种实施方式中，nap（2-萘乙酰基）中的羰基碳与met中的氨基形成酰胺键（-co-nh-）；phe的羟基被nh2取代，形成酰胺基（-co-nh2）

6、在一种实施方式中，所述自组装抗真菌肽在水相环境中具有形成超分子聚集体的结构基础，所述超分子聚集体包括纳米纤维。

7、在一种实施方式中，所述自组装抗真菌肽由固相合成法合成得到。

8、在一种实施方式中，所述自组装抗真菌肽在水相环境中可自发形成β-折叠构象为主的超分子聚集体，所述超分子聚集体包括纳米纤维，临界聚集浓度（cac）为2.88 μm。

9、在一种实施方式中，所述自组装抗真菌肽用于抑制烟曲霉（aspergillusfumigatus），最低抑菌浓度（mic）为4 μm。

10、本发明的第二个目的是提供一种抗真菌药物，所述抗真菌药物含有任一上述的自组装抗真菌肽。

11、在一种实施方式中，所述抗真菌药物还含有药学上可接受的药用辅料；所述药用辅料指药学领域常规的药物载体。

12、在一种实施方式中，所述辅料包括如下的一种或多种：粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；稀释剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇；填充剂如淀粉、蔗糖；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和干淀粉；

13、吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如聚山梨酯、脂肪酸山梨坦和脂肪酸甘油酯；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；润滑剂如氢化植物油、滑石粉和聚乙二醇；包衣材料如丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯；

14、另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂。

15、在一种实施方式中，所述抗真菌药物的剂型为固体制剂或者液体制剂。

16、在一种实施方式中，固体制剂包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂；液体制剂包括溶液型制剂、胶体型制剂、乳剂型制剂或混悬型制剂。

17、在一种实施方式中，所述抗真菌药物是抑制烟曲霉（

aspergillus fumigatus）、黄曲霉（

aspergillus flavus）、白色念珠菌（

candida albicans）、指状青霉（

penicillium

digitatum）、赭曲霉（

aspergillus ochraceus）、扩展青霉（

penicillium expansum）、禾谷镰刀菌（

fusarium graminearum）和尖孢镰刀菌（

fusarium oxysporum）的孢子萌发、菌丝生长或孢子扩增。

18、本发明的第三个目的是提供任一上述的自组装抗真菌肽在制备抗真菌药物中的应用。

19、在一种实施方式中，所述抗真菌药物是抑制抑制烟曲霉（

aspergillus

fumigatus）、黄曲霉（

aspergillus flavus）、白色念珠菌（

candida albicans）、指状青霉（

penicillium digitatum）、赭曲霉（

aspergillus ochraceus）、扩展青霉（

penicillium

expansum）、禾谷镰刀菌（

fusarium graminearum）和尖孢镰刀菌（

fusarium oxysporum）的孢子萌发、菌丝生长或孢子扩增。

20、在一种实施方式中，所述抗真菌药物还含有药学上可接受的药用辅料；所述药用辅料指药学领域常规的药物载体；

21、可选的，所述辅料包括如下的一种或多种：粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；稀释剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇；填充剂如淀粉、蔗糖；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和干淀粉；

22、吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如聚山梨酯、脂肪酸山梨坦和脂肪酸甘油酯；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；润滑剂如氢化植物油、滑石粉和聚乙二醇；包衣材料如丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯；

23、另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂；

24、可选的，所述抗真菌药物的剂型为固体制剂或者液体制剂；

25、可选的，固体制剂包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂；液体制剂包括溶液型制剂、胶体型制剂、乳剂型制剂或混悬型制剂。

26、本发明的第四个目的是提供任一上述的自组装抗真菌肽在粮食防霉中的应用。

27、在一种实施方式中，粮食包括玉米粒和/或花生粒。

28、在一种实施方式中，防霉是抑制烟曲霉（

aspergillus fumigatus）、黄曲霉（

aspergillus flavus）、白色念珠菌（

candida albicans）、指状青霉（

penicillium

digitatum）、赭曲霉（

aspergillus ochraceus）、扩展青霉（

penicillium expansum）、禾谷镰刀菌（

fusarium graminearum）和尖孢镰刀菌（

fusarium oxysporum）的孢子萌发、菌丝生长或孢子扩增。

29、本发明的第五个目的是提供一种抑制粮食中霉菌滋生的方法，将任一上述的自组装抗真菌肽与溶剂配置成自组装抗真菌肽溶液，通过喷雾、浸渍的形式施用于粮食表面；或将任一上述的自组装抗真菌肽以粉剂形式施用于粮食表面。

30、在一种实施方式中，自组装抗真菌肽溶液中自组装抗真菌肽浓度为50~100 μm；所述溶剂为水、磷酸盐缓冲液或或生理盐水。

31、在一种实施方式中，所述粮食包括玉米粒和/或花生粒。

32、在一种实施方式中，所述霉菌包括：烟曲霉（

aspergillus fumigatus）、黄曲霉（

aspergillus flavus）、白色念珠菌（

candida albicans）、指状青霉（

penicillium

digitatum）、赭曲霉（

aspergillus ochraceus）、扩展青霉（

penicillium expansum）、禾谷镰刀菌（

fusarium graminearum）和尖孢镰刀菌（

fusarium oxysporum）。

33、本发明的有益效果

34、（1）本发明通过模块化设计将疏水帽、二苯丙氨酸自组装连接子和阳离子抗真菌域整合在同一分子中，使nap-dmkf在水相环境中自发形成β-折叠纳米纤维，临界聚集浓度低至2.88 μm，实现了分子层面的自组装与抗真菌功能的一体化集成。

35、（2）本发明首次明确了自组装行为与抗真菌活性之间的因果关系。通过定点突变和自组装破坏实验证实，去除n端萘基或改变苯丙氨酸排列均导致自组装能力丧失或显著减弱，同时mic值大幅升高；加入tween 80破坏自组装后，nap-dmkf的mic由4 μm升高至512μm（增加128倍）。上述结果证明特定疏水帽nap和二苯丙氨酸结构单元驱动有序自组装是nap-dmkf获得低mic抗真菌活性的必要条件。

36、（3）本发明提供的nap-dmkf对烟曲霉的最低抑菌浓度（mic）低至4 μm；在50 μm1浓度下对玉米粒和花生粒表面烟曲霉孢子的抑制率分别达到56%和51%。

37、（4）本发明提供的自组装抗真菌肽对哺乳动物细胞毒性低（对raw 264.7细胞的ic50为89.93 μm，对hek 293细胞的ic50为98.81 μm），具备良好的生物安全性，适合在粮食仓储等复杂环境中实际应用。

38、（5）本发明提供的自组装抗真菌肽制备方法简单，采用固相合成法即可获得高纯度产品，适合规模化生产。