一种戊型肝炎病毒巢式数字PCR检测平台及其应用的制作方法

本发明涉及体外诊断试剂，主要涉及一种戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测平台，涉及一套巢式数字pcr的引物和探针组合物，特别适合用于低载量病毒的临床样本。

背景技术：

1、戊型肝炎病毒（hev）是全球急性肝炎的重要病原体，对全球公共卫生构成显著威胁[1]。hev的流行病学模式因地理区域和经济社会因素而异[2]。hev分为1～8共8个基因型。在亚洲和非洲等发展中国家，hev感染主要由hev基因1型和2型引起，常通过被污染的水源传播，导致暴发性或散发性急性肝炎疫情 。而在发达国家，hev基因3型和4型感染更为常见，多为散发病例，并与人畜共患传播有关[2]。

2、hev的传播途径多样，主要包括粪-口途径，具体可分为食源性传播、水源性传播以及与动物接触相关的跨物种传播（尤其是猪源性3/4型hev）。水源性传播是hev基因1型和2型在发展中国家引起暴发性疫情的主要途径[3]。当饮用水源被hev感染者或动物的粪便污染时，病毒会通过被污染的水传播给大量人群，导致大范围的疾病暴发[4]。这种传播模式在卫生条件较差的地区尤为常见[5]。食源性传播在全球范围内，尤其是发达国家和地区，是hev基因3型和4型感染的重要途径[4]。此类型传播主要通过食用受hev污染的动物产品，尤其是未煮熟或生食的猪肉、野猪肉及鹿肉制品[6]。尽管食源性传播主要表现为散发病例，但其在工业化国家中hev感染的上升趋势中扮演了关键角色，其中，猪被认为是hev基因3型和4型的重要宿主和传染源[7]。研究表明，在屠宰场环境中和零售猪肉产品中均可检测到hevrna[8]。欧洲多项研究显示，猪农的hev igg血清阳性率较高，证实了猪是hev感染的重要风险因素[9]。此外，食用受污染的甲壳类海产品或贝类也是潜在的食源性传播途径[10]。某些案例甚至将感染与食用生猪肝香肠等特定食品联系起来[11]。猪源性3/4型hev跨物种传播是指hev从感染动物（主要是猪）传播给人类的过程[4][12]。除了食用受污染的肉制品，与受感染动物的直接接触，如养殖场工人、兽医等，也可能导致hev的传播[4][11]。越来越多的证据表明，除了猪和野猪，其他动物如鹿、犬、兔子甚至某些鸟类也可能携带hev，并可能作为潜在的动物宿主，进一步扩大了hev的潜在传播范围[10]。例如，在瑞士的狗群中检测到hev特异性抗体，表明犬类可能暴露于hev，并提示与犬类接触可能成为人类hev感染的风险因素[13]。这种跨物种传播增加了疫情溯源的复杂性，并对食品安全和公共卫生构成持续挑战[14][15]。

3、hev感染的临床表现多样，多数感染者可能无症状或表现为自限性急性肝炎，但特定高危人群（如孕妇、免疫功能低下人群，老年基础肝病患者、婴幼儿等）感染hev后可能导致严重的健康危害，包括急性肝损伤、重症肝炎、慢性感染及妊娠不良结局等[16]。

4、综上所述，戊型肝炎病毒（hev）基因型多样、传播途径多样、临床表现多样，对孕妇、免疫低下人群等高危群体健康威胁严重，对hev的检测需求已从单一的临床诊断延伸至公共卫生溯源、食品安全监测、血源安全保障等多个领域。然而，现有检测技术难以兼顾高灵敏度、快速便携、适配多样本与复杂场景的要求，难以全面满足临床早诊、疫情溯源、食品/环境常态化监测、基层筛查等多元化需求。因此，亟需开发一种高灵敏、高特异、快速、便携且适用多种样本与复杂环境的新型hev检测方案。

5、当前hev主流检测方法以血清学抗体检测（elisa）和核酸检测（rt-pcr）为主，但是elisa抗体检测存在窗口期长、无法区分现症与既往感染、对免疫缺陷人群易因假阴性导致漏诊等缺陷，并且无法直接检测食品环境样本；常规的实时荧光rt-pcr检测虽然灵敏且窗口期短，但是，对低载量样本（如早期感染、免疫低下者、食品痕量污染）检测下限偏高，存在假阴性致漏检的风险，并且难以精准定量、难以完全覆盖临床早诊、高危人群筛查、复杂样本监测等多元化场景的迫切需求。

6、当前hev核酸检测方法还面临三大核心瓶颈：一是病毒基因组多样性：存在8个基因型及大量亚型、重组株，给核酸检测的引物探针设计带来极大挑战，单核苷酸突变即可导致假阴性漏检（如taqman探针因c→t突变漏检），通过保守区设计的引物探针序列难以全覆盖所有变异株，难以兼顾新发或罕见基因型的流行筛查；二是对低载量样本的检出能力不足：目前检测下限（lod）普遍高于500 copies/ml，导极易致三类样本（早期感染病毒载量尚未抬升的临床样本、免疫低下者维持低病毒血症的隐性感染样本、食品与环境痕量污染的监测样本）漏检；三是绝对定量依赖高纯度标准品制备的标准曲线：统hev核酸的绝对定量需要通过梯度稀释校准品构建的标准曲线来完成，而用于制备校准品的重组rna常存在纯度不足、易引入杂质干扰定量精度的问题，且稀释和检测操作流程繁琐也会导致定量精准度受限；上述缺陷相互叠加，严重制约了早期诊断、高危人群管理、疫情溯源及食品安全监测等领域对hev检测的准确性与及时性。

7、微滴数字pcr（droplet digital pcr，ddpcr）作为第三代pcr技术，通过将反应体系分割为独立微单元，在无需依赖标准品和标准曲线的情况下能够实现单分子级高灵敏度的绝对定量，但是，其pcr的本质同样需要依赖在高保守靶标区域（如orf3）设计引物来实现,因此，亟需开发一种兼具高灵敏度（突破现有lod限制）、强基因通用性（覆盖主要基因型）和无需标准曲线就能够实现绝对定量的hev核酸检测的新方案。

8、参考文献：

9、[1] structural aspects of hepatitis e virus. cancela f等，《archives ofvirology》2022（167），2022年；doi:10.1007/s00705-022-05575-8；

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11、[3]current knowledge on hepatitis e. pérez-gracia mt等，《journal ofclinical and translational hepatology》2015（3），2015年；doi:10.14218/jcth.2015.00009；

12、[4]zoonotic and foodborne transmission of hepatitis e virus. meng xj等，《seminars in liver disease》2013（33），2013年；doi:10.1055/s-0033-1338113；

13、[5]universal detection of hepatitis e virus by two real-time pcrassays: taqman and primer-probe energy transfer. gyarmati p等，《journal ofvirological methods》2007（146），2007年；doi:10.1016/j.jviromet.2007.07.014；

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15、[7]hiding in plain sight? it’s time to investigate other possibletransmission routes for hepatitis e virus (hev) in developed countries. kingnj等，《food and environmental virology》2018（10），2018年；doi:10.1007/s12560-018-9342-8；

16、[8]hepatitis e in thailand: from seroprevalence to foodborne andtransfusion-associated risks. poovorawan y等，《journal of clinical medicine》2026（15），2026年；doi:10.390/jcm15082837；

17、[9]epidemiology of hepatitis e virus in european countries. lapa d等，《international journal of molecular sciences》2015（16），第25711-25743页，2015年10月27日；doi:10.3390/ijms161025711；

18、[10]a review of hepatitis e virus. smith jl等，《journal of foodprotection》2001（64），第572-586页，2001年；doi:10.4315/0362-028x-64.4.572；

19、[11]acute hepatitis e in french patients and neurologicalmanifestations. abravanel f等，《journal of infection》2018（77），2018年；doi:10.1016/j.jinf.2018.06.007；

20、[12]hepatitis e: epidemiology and natural history. aggarwal r等，《journal of clinical and experimental hepatology》2013（3），2013年；doi:10.1016/j.jceh.2013.05.010；

21、[13]seroprevalence of hepatitis e virus in dogs in switzerland.veronesi r等，《zoonoses and public health》2020（67），2020年；doi:10.1111/zph.12779；

22、[14]zoonotic origin of hepatitis e. pavio n等，《current opinion invirology》2015（10），第34-41页，2015年；doi:10.1016/j.coviro.2014.12.006；

23、[15]emerging foodborne and agriculture-related viruses. kingsley dh等，《microbiology spectrum》2016（4），2016年；doi:10.1128/microbiolspec.pfs-0007-2014；

24、[16]hepatitis e virus: epidemiology, diagnosis, clinicalmanifestations, and treatment. aslan at等，《world journal of gastroenterology》2020（26），第5543-5560页，2020年；doi:10.3748/wjg.v26.i37.5543；

技术实现思路

1、本发明为了克服上述问题，提供一种兼具高灵敏度、强特异性和无需标准曲线就能够实现绝对定量的hev核酸检测方法。

2、本发明的目的还在于提供了一种具有强基因通用性的数字pcr检测方法。

3、为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

4、第一方面，本发明提供了一种引物和探针组合物，包括巢式内引物、探针和巢式外引物，该引物和探针组合物用于对戊型肝炎病毒基因组的orf2保守区域进行巢式数字pcr扩增。

5、根据本发明的一个优选实施例，所述巢式内引物包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:8所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no:14所示；所述巢式外引物的核苷酸序列分别如seqid no:16、seq id no:22所示。

6、优选地，所述探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

7、优选地，所述探针标记的荧光基团选自fam、hex、vic、rox、cy3或cy5中的任意一种；所述探针标记的荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、tamra或mgb中的任意一种。

8、进一步优选地，所述的荧光基团选自fam或rox中的任意一种；所述探针标记的荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2或mgb中的任意一种。

9、根据本发明的一个优选实施例，所述引物和探针组合物能够覆盖检测hev 1型、hev 2型、hev 3型、hev 4型和hev 7型。

10、优选地，所述hev 1型、hev 2型、hev 4型为人源，所述hev 3型、hev 7型为动物源。

11、根据本发明的一个优选实施例，在反应体系中，所述巢式内引物与巢式外引物的终浓度之比为7∶1，巢式内引物与探针的终浓度之比为7∶4。

12、第二方面，本发明提供了一种戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测试剂盒，包含第一方面所述的引物和探针组合物。

13、根据本发明的一个优选实施例，所述戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测试剂盒还包括数字rt-pcr反应液、聚合酶和去离子水。

14、根据本发明的一个优选实施例，所述戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测试剂盒，在每个检测反应中，所述巢式内引物的终浓度为0.8～1.8 μmol/l，所述探针的终浓度为0.8 μmol/l，所述巢式外引物的终浓度为0.2 μmol/l。

15、优选地，所述巢式内引物的终浓度为1.4～1.6 μmol/l。

16、进一步优选地，所述巢式内引物的终浓度为1.4 μmol/l。

17、根据本发明的一个优选实施例，所述戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测试剂盒，在每个检测反应中，所述聚合酶的用量为6 μl。

18、第三方面，本发明提供了一种戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测方法，检测步骤如下：1）提取待测样本中的hev rna；2）以提取的hev rna为模板，采用第一方面所述的引物和探针组合物，或者采用第二方面所述的戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测试剂盒，制备巢式数字pcr的反应体系，在数字pcr仪中自动运行微滴生成和巢式数字pcr扩增程序；3）数字pcr仪自动输出待测样本的定量结果和微滴散点图。

19、根据本发明的一个优选实施例，在步骤1)中，所述待测样本为血液、粪便或者组织。

20、根据本发明的一个优选实施例，在步骤2)中，所述反应体系为25 μl，包括5 μl的数字rt-pcr反应液、6μl的聚合酶、1 μl第一方面所述的引物和探针组合物、5 μl的模板，8μl的去离子水。

21、根据本发明的一个优选实施例，在步骤3)中，数字pcr仪自动读取扩增产物的荧光信号，基于泊松分布计算阳性微滴比例，并输出待测样本hev rna绝对拷贝数的定量结果和微滴散点图。

22、第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的引物和探针组合物，第二方面所述的戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测试剂盒，或者第三方面所述的戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测方法在戊型肝炎病毒核酸检测中的应用。

23、根据本发明的一个优选实施例，所述应用包括但不限于戊型肝炎病毒早期诊断、戊型肝炎病毒感染的疫情溯源、食品污染监测、环境常态化监测、戊型肝炎病毒隐性感染筛查。

24、本发明的有益效果是：

25、本发明提供了一种戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测平台，目的是从源头解决因hev基因型多样导致的假阴性漏检问题，首先在靶标序列的选择上，通过对本地流行毒株和近20年国内公开的不同类型的序列资源的大规模序列比对分析，从中锁定靶标序列位于hev不同基因型（尤其是hev 3型和4型）orf2基因上的高度保守区域，在该区域开展定向引物探针设计，通过先筛选巢式内引物、再优化巢式外引物的分级筛选策略，并且创新性将巢式嵌套扩增逻辑与数字pcr平台深度融合，经过层层筛选获得一组最优巢式引物和探针组合物（frp4组合），该组合有效避开了hev基因组的高变性区域，该设计、筛选从源头上解决了hev核酸检测易因基因组序列变异出现漏检的技术痛点，确保了引物探针从分子层面对多种基因型间具有良好的广谱覆盖能力和兼容性。

26、本发明提供一种戊型肝炎病毒巢式数字pcr检测为一管式rt-pcr，在优选引物和探针组合物（frp4组合）的基础上，通过终浓度配比优化确定了巢式外引物:巢式内引物:探针= 1:7:4，再通过精准调控反应体系的聚合酶用量、配套梯度优化调整扩增程序中反转录温度、退火温度、扩增循环数等全流程参数；在反应体系和扩增程序优化的基础上，本发明采用的巢式数字pcr通过在扩增程序中引入“10个循环高温退火（68℃）结合35个循环适宜退火（58℃）”的分段策略，在早期循环中利用高温退火有效抑制非特异性扩增，在后续循环中通过适宜退火温度保障低拷贝靶标的充分扩增，创造性地解决了巢式扩增与数字pcr微滴体系兼容的技术难题。该技术融合使本发明方法同时具备三重优势：巢式扩增的双重识别机制显著提高了检测特异性；数字pcr的绝对定量特性实现了无需标准曲线即可精确定量；分段扩增策略在保障灵敏度的同时有效控制了非特异性背景，使阳性与阴性微滴群体间形成清晰的信号区分度。本发明优化构建的单管巢式数字rt-pcr检测平台，无需开盖，即可在不引入气溶胶污染风险的前提下，实现了对低载量hev靶序列先富集再精准特异的两轮扩增，大幅提升了对低载量样本的扩增检出率，95%检出下限（lod95）降至3.0 copies/μl，灵敏度较常规荧光pcr法提升约16.7倍，从方法学层面实现了检测性能的阶跃式提升。

27、本发明提供的hev巢式数字pcr实现了无需依赖梯度标准曲线即可完成hev核酸绝对定量的核心能力，突破了传统hev绝对定量方法操作繁琐、结果偏差大的技术瓶颈，可直接输出精准的病毒拷贝数结果。绝对定量优势配合高灵敏度、高特异性的性能优势，能够让本发明的hev巢式数字pcr适配hev感染早期诊断、输血安全筛查、动物源性食品安全监测等多类核心场景，尤其针对低载量隐性感染样本、痕量污染食品样本具备显著的检出优势，填补了现有hev高灵敏度绝对定量检测的技术空白，具备极高的临床落地价值与行业推广潜力。

28、本发明将巢式pcr“两轮扩增、双重识别”的特异性优势与数字pcr“绝对定量、不依赖标准曲线”的精准计数优势进行有机整合，建立了“巢式数字pcr”检测平台，在性能验证环节，通过严格的probit回归分析，系统验证了检测平台的灵敏度边界，获得95%检出下限（lod95）为3.0 copies/μl（95%ci: 2.7～3.4 copies/μl），相当于每反应投入量仅15copies即可实现95%的可靠检出。该lod值较市售荧光pcr试剂盒（50.0 copies/μl）显著降低约94%，灵敏度提升约16.7倍，卓越的灵敏度使本发明能够在病毒早期感染的窗口期、免疫抑制人群的低载量阶段实现较高的阳性检出效率，较传统方法能够提前、灵敏地捕获到阳性信号。同时，以诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等6种常见胃肠道病原体为干扰测试对象的特异性验证显示，本方法仅对hev产生阳性信号，与所有非靶标病原体均无交叉反应，高度的特异性能够彻底排除了其他胃肠道病原体的干扰，避免了假阳性结果。因此，本发明hev巢式数字pcr灵敏度和特异性的双重保障，使本发明在临床低载量样本检测中具备显著的技术优势和结果可靠性。

29、本发明检测对象戊型肝炎病毒（hev）是无囊膜、单股正链的rna病毒，由5’utr、三个部分重叠的orf和3’utr组成，orf2中部有保守区域、主要编码hev结构蛋白——衣壳蛋白，不同基因型（1-8型）在orf2序列上存在明确的不同基因型的序列保守性特征，是hev分型的核心依据。本发明为克服hev基因组多样性问题，通过对不同类型的序列资源的大规模序列比对分析，锁定hev不同基因型orf2保守区域作为靶标序列进行引物设计，从源头解决因hev基因型多样导致的假阴性漏检问题，经过实验验证，对hev 1型、2型、3型、4型、7型均能够实现均衡的高检出性能，在2 copies/μl的极低浓度下仍保持≥70%的阳性检出率，可有效覆盖国内所有主流流行及罕见hev基因型，从根源上避免因基因型序列差异导致的假阴性漏检问题。本发明不仅是灵敏的，更是真正“广谱”和“稳健”的，跨越了hev基因组遗传多样性的障碍，构建了一个可同时应对当前主要流行株和未来新发威胁的检测平台，一个“一管检测所有”的广谱体系简化了操作流程，降低了成本，更易于在临床诊断、输血安全、公共卫生监测及食品安全等领域进行推广或常态化检测。

30、同时，本发明hev巢式数字pcr对血液、粪便、猪肝三类高干扰复杂基质的阳性临床样本实现100%阳性检出率（15/15），其中包含一份第三方荧光pcr法漏检的低浓度样本（对应ct值>38），证明了本体系对血清血红蛋白、粪便胆盐、动物源性脂肪蛋白等各类复杂基质干扰物的强抗干扰能力。粪便和肝脏组织中含有大量pcr抑制物（如胆盐、血红素、腐殖酸等），常规方法往往需要额外的样本前处理或易出现假阴性结果，而本发明无需特殊前处理即可在上述复杂样本中实现稳定检出，充分验证了该反应体系对临床常见样本类型及食品样本的良好耐受性和广泛适用性。本发明对多种类型临床样本100%成功的阳性检出率，使其具备从实验室研究向多场景应用转化的技术基础：在临床医学领域，可用于hev感染的早期诊断、抗病毒治疗的病毒载量动态监测及器官移植人群的复发预警；在输血安全领域，可作为血液制品hev筛查的高灵敏度替代方案；在食品安全领域，可用于猪肝等动物源性食品的hev污染监测。因此，本发明解决了传统hev核酸检测在复杂样本中易出现假阴性、假阳性的行业痛点，检测稳定性远高于第三方试剂。

31、综上，本发明提供一种hev巢式数字pcr检测平台及其应用，通过锁定覆盖hev的主要人兽共患基因型的orf2保守区域，设计、筛选获得优选的巢式引物和探针组合物（frp4组合），从源头保障了检测的特异性和广谱性；巢式pcr“两轮扩增、双重识别”的特异性优势与数字pcr“绝对定量、不依赖标准曲线”的结合，从方法学层面实现了检测性能的大幅提升，再通过优化反应体系和扩增程序，经验证，优化后的hev巢式数字pcr的95%检出下限（lod95）为3.0 copies/μl，灵敏度比pcr荧光法提高了约16.7倍，与诺如病毒、轮状病毒等常见胃肠道病原体均无交叉反应，并且能够对血液、粪便及猪肝等不同类型的临床样本实现100%的阳性检出率，尤其适合对低载量病毒的临床样本，检测结果灵敏度高、特异性强、稳定性高、无需标准曲线就能够实现绝对定量，适用于hev早期诊断、输血安全筛查、动物源性食品安全监测等，具有良好的临床应用和推广价值。