一种丹参SmRGLG1基因、蛋白及其在丹参酮生物合成中的应用

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种丹参

smrglg1基因、蛋白及其在丹参酮生物合成中的应用。

背景技术：

1、丹参（

salvia miltiorrhiza bunge）为我国核心大宗药用植物，其主要药效活性成分为丹参酮类与丹酚酸类化合物。其中，二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮ⅰ、丹参酮ⅱa等脂溶性二萜醌类化合物，是丹参发挥核心药理活性的关键物质基础。丹参酮的生物合成机制复杂、代谢通路层级繁多，其合成过程主要依赖甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，mva途径）与2-c-甲基-d-赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-c-methyl-d-erythritol 4-phosphatepathway，mep途径）提供异戊二烯前体物质，经牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，ggpps）催化生成ggpp，再通过cps1、ksl酶促反应完成二萜骨架构建，最终由cyp76、cyp71家族细胞色素p450酶完成后续氧化修饰，形成各类丹参酮活性成分。茉莉酸（ja）是调控丹参次生代谢的关键激素，外源茉莉酸甲酯（meja）可显著诱导丹参酮积累，其调控网络涉及jaz蛋白、myb/myc/bhlh等转录因子构成的转录调控层级。

2、泛素化修饰是真核生物核心的翻译后调控机制，e3泛素连接酶决定了底物识别的特异性，通过泛素-蛋白酶体途径调控底物蛋白稳定性，进而参与植物激素信号、次生代谢与逆境响应。rglg家族是植物特有的ring型e3泛素连接酶，n端含vwa结构域负责底物识别，c端含ring结构域发挥酶活功能；模式植物研究证实rglg家族参与ja信号、铁稳态、干旱胁迫等过程，但在药用植物次生代谢调控中的功能研究极少。

3、现阶段，国内外针对丹参酮生物合成的调控研究已取得一定进展，多集中于通路结构基因过表达、转录因子转录水平调控、激素诱导及基因编辑修饰等常规手段，能够在一定程度上单一提升部分丹参酮成分的积累量。但现有丹参品质改良及丹参酮合成调控技术仍存在诸多核心技术短板与瓶颈问题，极大制约了丹参高产优质育种与丹参酮产业化生物制造的发展。

4、现有技术的缺点在于：（1）现有公开的调控靶点与技术手段多针对丹参酮合成通路单一环节、单一限速步骤进行调控，缺乏可同时覆盖前体供应、骨架合成、氧化修饰等多个核心代谢通路的广谱性优良遗传靶点，无法实现二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮ⅰ、丹参酮ⅱa等多种关键丹参酮类成分的同步、稳定增量积累，改良效果片面且稳定性差。（2）当前丹参酮合成调控研究重心集中于转录水平调控，泛素化修饰介导的丹参酮代谢通路蛋白稳定性、酶活性调控及代谢流重分配机制尚未被解析，是当前丹参合成生物学研究的重大空白领域。综上，现有技术存在靶点单一、调控维度片面、机制研究滞后、改良效果有限且稳定性差等核心缺陷，难以满足规模化、产业化高产丹参酮种质创制、毛状根高效培养及丹参酮类天然产物工业化生物制造的高质量技术需求。

5、因此，有必要提供一种丹参

smrglg1基因、蛋白及其在丹参酮生物合成中的应用来解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种丹参

smrglg1基因、蛋白及其在丹参酮生物合成中的应用，旨在解决丹参高产种质创制、毛状根高效培养的问题。本发明通过克隆丹参

smrglg1基因构建了植物过表达载体，采用农杆菌介导转化获得

smrglg1过表达的丹参毛状根；通过实验验证了在丹参植株中过表达

smrglg1基因可全面上调丹参酮合成全通路关键酶基因，显著提升各类丹参酮单体含量，对解决丹参酮药源紧缺具有十分重要的意义。

2、本发明的第一个目的在于提供一种丹参

smrglg1基因，所述

smrglg1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的第二个目的在于提供一种丹参smrglg1蛋白，由

smrglg1基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明的第三个目的在于提供一种重组载体，所述重组载体为丹参

smrglg1基因序列的过表达载体，构建的过表达载体为35s::

smrglg1-myc过表达载体，所述载体的核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、可选地，构建所述35s::

smrglg1-myc过表达载体时所用的引物对序列如seq idno.4和seq id no.5所示。

6、可选地，构建所述35s::

smrglg1-myc过表达载体时所用的同源臂引物对序列如seq id no.6和seq id no.7所示。

7、本发明的第四个目的在于提供一种重组菌种，所述重组菌种为重组农杆菌，具体为采用冻融法将重组载体转入含pria4bri质粒的根癌农杆菌c58c1中，筛选得到阳性工程菌株即重组菌种。

8、本发明的第五个目的在于一种重组菌种在诱导丹参毛状根转化中的应用，包括以下步骤：

9、获取丹参无菌苗叶盘；采用农杆菌转化法在26℃温度下将叶盘浸入重组菌种浸染液中10-15min，取出叶盘，用无菌滤纸轻轻吸干表面多余菌液，叶背朝下平铺于ms固体培养基中，25℃暗培养2d后转移至含筛选抗生素固体培养基中诱导毛状根；

10、待毛状根长至2-3cm时，在无菌条件下切取单根独立继代，获得

smrglg1过表达阳性株。

11、可选地，无菌苗的培育具体包括：将丹参种子进行消毒；将消毒后的种子进行接种；接种后先暗培养1-2天，随后转入光照培养条件下培养，25℃的温度下、16h光照/8h黑暗条件培育5周无菌幼苗；丹参种子的消毒操作具体为：采用75%乙醇消毒1-2min，再用10%的次氯酸钠消毒5-10min，消毒结束后弃去次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗5-6次，每次1-2min。

12、本发明的第六个目的在于丹参

smrglg1基因在培育转基因丹参植株中的应用。

13、本发明的第七个目的在于

smrglg1基因在提高丹参中丹参酮含量中的应用，其特征在于，通过过表达丹参

smrglg1基因促进丹参毛状根产生丹参酮。

14、应用本发明的技术方案，具有以下有益效果：

15、（1） 本发明首次在丹参中克隆出

smrglg1基因，并构建了携带

smrglg1基因的过表达载体和重组菌种，通过农杆菌介导转化获得过表达丹参毛状根，通过分子实验验证了

smrglg1可全面上调丹参酮合成全通路关键酶基因，显著提升各类丹参酮单体含量。

16、（2） 本发明提出的smrglg1蛋白属于ring型e3泛素连接酶，具备保守的vwa与ring蛋白结构域；通过蛋白互作、体内外泛素化实验验证了smrglg1蛋白通过vwa结构结合负调控因子smmyb76，经26s蛋白酶体介导smmyb76泛素化降解，解除smmyb76对丹参酮合成关键基因的转录抑制，全通路同步激活，进而提升了丹参酮积累。

17、（3） 本发明公开了一种携带丹参

smrglg1基因序列的重组载体在诱导丹参毛状根转化中的应用，该应用得到的过表达丹参毛状根及转基因植株经实验验证了可促进丹参酮生物合成，提高丹参酮含量，对丹参优良品种的培育具有重要参考价值和意义。