一种基于分子信标的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflR快速鉴定方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于分子信标的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr快速鉴定方法。

背景技术：

1、黄曲霉毒素是一类引起肝细胞癌的强致癌剂，不仅对人类健康造成危害，而且通过污染农作物给国民经济造成巨大损失。

2、黄曲霉毒素的生物合成过程非常复杂，共涉及到21步酶促反应，参与黄曲霉毒素合成的绝大多数基因聚集于某特定基因簇中，其中包括黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr，该基因在黄曲霉毒素产生过程中发挥十分重要的作用，它为绝大多数黄曲霉毒素合成相关基因的表达所必需；aflr的中断可抑制其他黄曲霉毒素合成相关基因的表达；aflr的表达产物aflr蛋白是af生物合成途径中的主要正性转录因子，该蛋白调节大多数黄曲霉毒素合成相关基因，也包括其自身基因的表达。

3、传统aflr基因检测技术的一般原理是，根据基因序列，设计并筛选引物建立pcr检测方法。但该方法存在不足之处：产物纯化测序等二次处理过程可能造成扩增产物污染；扩增结束后仍需电泳检测，耗时较长；检测灵敏度低。

4、传统dna检测技术只适用于dna未降解或降解较少的新鲜样品，然而，在药材、饲料、粮食等长期储存的检材中，产黄曲霉毒素真菌可能因环境压力(如温湿度波动、氧化作用)导致菌体死亡，其表面残留的dna会逐渐降解为短片段。传统pcr方法依赖aflr基因长片段，当目标dna严重降解时，引物无法有效结合保守区域，易产生假阴性结果。

5、本领域技术人员熟知的分子身份证是分子身份证序列是为特定物种或属群开发的极短dna序列，高度保守且在相应分类群内无变异，可作为物种或基因鉴定的特异分子标签。同时，分子身份证具有较好的抗降解性，短序列片段可耐受dna断裂，即使样本储存超过5年，仍能有效扩增。

6、尽管分子身份证技术已经成熟，但aflr基因在不同菌株个体中存在显著序列多态性，其非编码区及部分编码区变异率较高，因此，筛选兼具保守性与唯一性的靶标区域较为困难。

7、因此，亟待建立一种快速、灵敏、免电泳的黄曲霉毒素生物合成调节基因aflr快速检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种基于分子信标的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr快速鉴定方法，以解决现有技术检测时间长、易污染、检测成本较高、难以大批量检测等问题。

2、为达到以上发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr的分子身份证，其为如seq id no.1所示的核苷酸序列。

4、第二方面，本发明提供一种基于第一方面所述的aflr基因分子身份证的分子信标，其核苷酸序列为如seq id no.2所示的序列。

5、优选地，所述分子信标的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。

6、优选地，所述荧光基团包括fam、joe、tet、hex、cy3、rox、texas red、cy5或cy5.5中任意一种。

7、优选地，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2、dabcyl或bhq3中任意一种。

8、第三方面，本发明提供一种aflr基因特异性引物，为如seq id no.3和seq idno.4所示的核苷酸序列。

9、seq id no.1：5'-ctcggtgtatcgaacgtgg-3′；

10、seq id no.2：5′-ccctcggtgtatcgaacgtggcgaggg-3′；

11、seq id no.3：5'-gtcgccgagttgaatcaagg-3′；

12、seq id no.4：5′-tccgggatagctgtacgagt-3'；

13、第四方面，本发明提供一种基于分子信标的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr快速鉴定方法，所述方法包括：

14、(1)提取待测样品的总dna，作为模板dna；

15、(2)采用第二方面和第三方面所述的特异性分子信标和引物对模板dna进行qpcr扩增；

16、(3)读取并分析荧光信号，判断待测样品dna中是否含有黄曲霉毒素产毒菌关键基因；

17、优选地，所述方法中qpcr的反应体系为20μl，包括taq-hs probe premix 10μl，浓度为2.5μmol/l的分子信标2.0μl，浓度为2.5μmol/l的引物各1.0μl，浓度为10ng/μl的模板dna 2.0μl，双蒸水4.0μl。

18、优选地，所述方法中qpcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；

19、优选地，所述方法中，判定规则为：ct值≤38.0，则判定为被检样品阳性；ct值＞38.0，则判定为被检样品阴性。

20、与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

21、本发明针对aflr基因设计特异性引物和分子信标，利用qpcr法，检测黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr。该方法特异性良好；比传统pcr方法灵敏度高100倍，检测限低至0.001ng/μl dna浓度；适用于检测药材、饲料、粮食等储存时间较长且菌体dna已降解的检材；具有快速、灵敏、可大规模检测的优势。

1.一种基于分子信标的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr快速鉴定方法，其特征在于，利用分子信标和特异性引物，采用qpcr法对黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于，包括：

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，qpcr扩增所使用的引物为如seq idno.3和seq id no.4所示的核苷酸序列。

4.基于分子信标的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr快速鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：

5.如权利要求4所述的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr快速鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，qpcr体系为：taq-hs probe premix 10μl，浓度为2.5μmol/l的分子信标2.0μl，浓度为2.5μmol/l的引物各1μl，浓度为10ng/μl的模板dna2μl，双蒸水补足至20μl。

6.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素生物合成途径调节基因aflr快速鉴定方法，其特征在于，所述qpcr扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。