一种快速高效提取酵母菌基因组DNA的方法及应用

本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种快速、高效、低成本提取酵母菌基因组dna的方法及应用。

背景技术：

1、酵母菌是一类单细胞真核微生物，属于真菌界（fungi）子囊菌门（ascomycota）或担子菌门（basidiomycota），具有兼性厌氧代谢特性。其细胞形态以球形或卵圆形为主，常见出芽生殖，部分种类可形成子囊孢子或担孢子进行有性繁殖。酵母菌广泛分布于土壤、水体、植物表面及动物宿主体内等多种生境。从分类学角度，酵母菌主要集中于酿酒酵母属（

saccharomyces）、假丝酵母属（

candida）、毕赤酵母属（

pichia）及汉逊德巴利酵母属（

debaryomyces）等，其中酿酒酵母（

saccharomyces cerevisiae）因其在传统食品发酵（如酒类酿造、面包发酵）及现代分子生物学研究中的双重角色而被视为模式生物。然而在开展酵母菌pcr检测与分子鉴定过程中，酵母细胞坚固的细胞壁结构给酵母菌基因组dna模板制备带来显著阻碍，是当前酵母分子生物学实验中亟待解决的关键问题之一。

2、酵母菌细胞壁结构坚韧，其组分中富含葡聚糖、几丁质等大分子物质，常规细胞裂解方法难以实现有效破壁，无法充分释放基因组dna。酵母菌pcr模板制备是开展酵母分子鉴定、基因检测、菌株分型等研究的核心基础环节。现有主流酵母菌dna模板制备方法仍存在显著技术缺陷，无法同时兼顾操作简便性、检测稳定性与试验安全性，难以满足批量、快速、稳定、低成本酵母分子检测的应用需求。

3、现有酵母菌dna模板制备主流方法存在诸多缺陷，具体不足之处如下：

4、（1）传统ctab法操作弊端较为突出。该方法为经典的真菌dna提取方案，整体操作流程繁琐复杂，涵盖样品洗涤、裂解、有机抽提、沉淀、洗脱等多步处理环节，试验步骤冗余、周期漫长，且试验过程需使用氯仿、异戊醇等有毒有机溶剂，所需试剂多，既繁琐费时，也存在操作安全隐患，易引发环境污染，无法适配快速批量检测的应用场景。

5、（2）酶解法制备成本较高。该方法依托溶壁酶、纤维素酶等专用酶制剂实现酵母细胞壁的温和裂解，破壁效果相对稳定，但商用酶制剂价格高昂，会显著提升试验成本；同时酶解反应对孵育温度、反应时长、体系ph值等条件要求严苛，容错率低，开展批量检测时的经济成本与时间成本均较高，应用局限性显著。

6、（3）简易裂解方法的扩增稳定性较差。菌液直接pcr法、单一碱性裂解法、单纯反复冻融法（包括液氮冻融）等简易制备方案操作流程简便，但存在破壁不彻底的问题，基因组dna释放量低且杂质干扰严重，最终会导致pcr扩增成功率低、结果重复性差，核酸产物浓度不均一，琼脂糖凝胶电泳条带模糊、亮度不均，无法满足sanger测序等高精度分子实验的要求。

7、针对现有酵母菌dna模板制备技术存在的上述缺陷与不足，本发明提出一种碱裂解耦合冻融的酵母菌dna模板快速制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速、高效、低成本提取酵母菌基因组dna的方法及应用，以解决上述技术问题。

2、本发明通过碱性裂解与高低温冻融协同处理，可实现酵母菌的高效破壁与基因组dna的充分释放。本发明先通过碱性裂解液对酵母细胞壁进行化学软化，破坏其致密结构，再借助高温与超低温交替冻融产生的物理效应进一步裂解细胞结构；在化学处理与物理裂解的双重作用下，可显著提升酵母细胞破壁效率，促进基因组dna高效释放，随后加入中和液调节体系ph至中性，最终即可获得可直接用于pcr扩增反应的dna模板。

3、为实现上述目的，本发明提供了一种快速、高效、低成本提取酵母菌基因组dna的方法，包括以下步骤：

4、取酵母菌菌液12000 rpm离心2 min，去上清，加入裂解缓冲液，混匀后100℃加热5-10 min，随后置于超低温冰箱冷冻处理5-15min，重复1-3次，然后加入tris-hcl进行中和，然后12000 rpm离心1 min，取上清得到酵母菌基因组dna，并作为pcr模板。

5、进一步地，所述裂解缓冲液组分为15~50 mm naoh、0.05~0.25 mm na2-edta，ph 9~13。

6、进一步地，所述加热方式为金属浴加热或水浴加热。

7、进一步地，所述加热方式为金属浴加热，加热时间10 min。

8、进一步地，所述超低温冰箱冷冻处理5 min，重复1次。

9、进一步地，所述tris-hcl浓度为10~40 mm，ph 6.0~7.5。

10、本发明还提供了上述方法在酵母菌分子鉴定中的应用，采用上述方法提取酵母菌基因组dna，进行酵母菌分子鉴定。

11、本发明所述的一种快速高效提取酵母菌基因组dna的方法及应用的优点和积极效果是：

12、1、本发明通过正交实验确定了最优处理条件：100℃金属浴10 min，-80℃冷冻5min，重复1次，最快18分钟内即可得到满足分子鉴定需求的dna。该方法的适用性检测表明，碱裂解-冻融联合破壁法在金属浴和水浴加热条件下均可稳定扩增；菌液pcr效果优于菌落pcr。碱裂解-冻融联合破壁法无需酶制剂或有机溶剂，操作简便、快速高效、效果稳定、成本低廉、耗时短，适用于多种酵母菌属的pcr模板制备和分子鉴定。

13、2、本发明利用naoh-edta裂解液对细胞壁进行化学软化，再通过高温与超低温交替处理，使冰晶的机械穿刺效应与热冲击效应协同作用，从而实现细胞壁的高效破裂与dna的充分释放。该方法在设计上整合了碱性裂解法和煮冻法，进一步优化了处理强度和操作流程。通过对比实验，碱裂解-冻融联合破壁法提取的dna的pcr扩增成功率达100%，显著优于菌液直接pcr法、碱性裂解法和反复冻融法，且所得pcr产物核酸浓度稳定，条带亮度较均一，满足sanger测序要求。

14、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

1.一种快速高效提取酵母菌基因组dna的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种快速高效提取酵母菌基因组dna的方法，其特征在于：所述裂解缓冲液组分为15~50 mm naoh、0.05~0.25 mm na2-edta，ph 9~13。

3.根据权利要求1所述的一种快速高效提取酵母菌基因组dna的方法，其特征在于：所述加热方式为金属浴加热或水浴加热。

4.根据权利要求3所述的一种快速高效提取酵母菌基因组dna的方法，其特征在于：所述加热方式为金属浴加热，加热时间10min。

5.根据权利要求1所述的一种快速高效提取酵母菌基因组dna的方法，其特征在于：所述超低温冰箱冷冻处理5min，重复1次。

6.根据权利要求1所述的一种快速高效提取酵母菌基因组dna的方法，其特征在于：所述tris-hcl浓度为10~40 mm，ph 6.0~7.5。

7.权利要求1-6任一项所述的方法在酵母菌分子鉴定中的应用，其特征在于：采用权利要求1-6任一项所述的方法提取酵母菌基因组dna，进行酵母菌分子鉴定。