一种病毒裂解液及其制备方法与流程

本发明属于病毒检测，涉及一种病毒裂解液及其制备方法。

背景技术：

1、病毒核酸检测是传染病诊断、疫情监测和临床治疗的核心手段之一，而病毒核酸的高效释放是核酸检测的关键前提。病毒颗粒由蛋白质衣壳及部分病毒的包膜组成，其结构完整性依赖于衣壳蛋白之间的二硫键、氢键、疏水相互作用等多重非共价及共价作用力。因此，病毒裂解液的核心功能在于破坏上述结构，释放病毒基因组核酸，同时抑制核酸酶活性以保护释放出的核酸不被降解。

2、然而，传统的病毒裂解液技术体系存在以下三个固有缺陷：

3、一、高浓度胍盐对下游核酸检测的强烈抑制效应，经传统胍盐类裂解液处理后的样本通常需要经过核酸纯化步骤才能用于pcr、rt-pcr或lamp等下游扩增检测。二、tritonx-100是病毒裂解和灭活中最广泛使用的非离子表面活性剂之一，然而，由于triton x-100的降解产物对水生生物具有生态毒性；三、传统还原剂仅提供可逆的化学还原作用，对于结构紧密、二硫键密度高的非包膜病毒（如诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等）裂解效率仍有不足，难以实现不可逆的衣壳蛋白结构破坏。

4、因此，亟需开发一种既能高效裂解包膜病毒和非包膜病毒、又对下游核酸检测无显著抑制、且完全规避胍盐和triton x-100使用的病毒裂解液。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种病毒裂解液及其制备方法，在不依赖传统胍盐和triton x-100的条件下实现了对包膜/非包膜病毒的高效裂解。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种病毒裂解液，所述病毒裂解液由由独立分装的第一组分和第二组分构成；

4、所述第一组分为ph 11.8~13.0的水溶液，含有焦亚硫酸钠或亚硫酸钠30~100mm、植酸钠5~20mm和有机季铵碱50~200mm；

5、所述第二组分为ph 8.0~9.0的水溶液，含有尿素2~4m、硫脲1~2m、阴离子表面活性剂17~50mm、非离子糖苷表面活性剂5~25mm和三羟甲基氨基甲烷20~100mm；

6、所述第一组分与第二组分使用时的体积混合比为（1~2）：1。

7、本发明的病毒裂解液由独立分装的第一组分和第二组分组成。其中，第一组分中的焦亚硫酸钠/亚硫酸钠在强碱性条件下解离产生亚硫酸根离子，能够与病毒衣壳蛋白的二硫键发生不可逆的磺解反应，将二硫键转化为稳定的硫代磺酸盐；植酸钠在碱性条件下携带密集负电荷，产生静电排斥膨胀效应辅助衣壳松散；有机季铵碱提供强碱性环境以激活上述反应。第二组分中的尿素与硫脲复配协同破坏蛋白质氢键和疏水相互作用，阴离子表面活性剂剥离核酸-蛋白复合物，非离子糖苷表面活性剂温和破坏残余脂质包膜，tris在混合后中和强碱并提供缓冲。两组分独立分装避免了各组分在储存过程中相互反应或降解，延长了货架期。混合后终溶液ph回落至8.0~9.0，避免核酸在强碱中长期暴露导致降解，同时规避了胍盐对pcr的抑制和triton x-100的环保合规风险。

8、作为本发明的一种优选技术方案，所述第一组分与第二组分混合后的终溶液中，焦亚硫酸钠或亚硫酸钠、植酸钠、尿素、硫脲的摩尔浓度比为（3~10）:（0.5~2）:（200~400）:（100~200），终溶液ph为8.0~9.0。

9、通过限定各组分的摩尔比，确保病毒裂解液在终溶液中达到最佳协同状态；植酸钠浓度与焦亚硫酸钠/亚硫酸钠匹配，协同发挥“化学拆链、物理膨胀”的双重效果。

10、作为本发明的一种优选技术方案，所述阴离子表面活性剂为n-月桂酰肌氨酸钠，所述非离子糖苷表面活性剂为癸基-β-d-吡喃葡萄糖苷或十一烷基葡萄糖苷。

11、n-月桂酰肌氨酸钠是一种温和的阴离子表面活性剂，能有效裂解病毒包膜并剥离核酸-蛋白复合物，同时对下游pcr扩增的抑制较低；癸基-β-d-吡喃葡萄糖苷或十一烷基葡萄糖苷属于烷基糖苷类表面活性剂，对包膜病毒具有良好的灭活效果，可通过膜重构途径实现透化，且完全可生物降解。两者复配实现“阴离子解离蛋白+非离子温和破膜”的分工协同，覆盖包膜病毒和非包膜病毒的不同裂解需求。

12、作为本发明的一种优选技术方案，所述有机季铵碱为四甲基氢氧化铵或四乙基氢氧化铵。

13、四甲基氢氧化铵和四乙基氢氧化铵均为强有机碱，能够将第一组分的ph调节至11.8~13.0的强碱性范围，以激活焦亚硫酸钠/亚硫酸钠的磺解反应活性和植酸钠的最大电离；与无机碱（如naoh）相比，有机季铵碱与后续的tris缓冲体系具有更好的兼容性，混合后ph回落更平稳。

14、作为本发明的一种优选技术方案，所述第一组分中包括稳定剂，所述稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠中的至少一种，浓度为第一组分总质量的0.05~0.5%。

15、焦亚硫酸钠/亚硫酸钠在水溶液中易被溶解氧氧化而失效，乙二胺四乙酸二钠和柠檬酸钠作为金属离子螯合剂，能够螯合溶液中微量过渡金属离子，这些金属离子是焦亚硫酸钠/亚硫酸钠氧化分解的催化剂；通过螯合去除这些催化剂，可有效延缓焦亚硫酸钠/亚硫酸钠的氧化降解，延长第一组分的货架期和稳定性。

16、作为本发明的一种优选技术方案，所述第一组分与第二组分使用时的体积混合比为（1.2~1.8）：1。

17、该配比可保证第一组分中的焦亚硫酸钠/亚硫酸钠和植酸钠在终溶液中达到有效工作浓度，使裂解效率和检测兼容性达到最优。

18、作为本发明的一种优选技术方案，所述第一组分中焦亚硫酸钠或亚硫酸钠的浓度为50~80mm，植酸钠的浓度为10~15mm，有机季铵碱的浓度为80~150 mm；所述第二组分中尿素的浓度为2.5~3.5m，硫脲的浓度为1.2~1.8m，阴离子表面活性剂的浓度为25~35mm，非离子糖苷表面活性剂的浓度为10~20mm，三羟甲基氨基甲烷的浓度为40~80mm。

19、一种病毒裂解液的制备方法，包括以下步骤：

20、s1、制备第一组分：

21、在惰性气体保护下，将焦亚硫酸钠或亚硫酸钠、植酸钠和有机季铵碱溶解于无核酸酶水中，调节ph至11.8~13.0，得到第一组分；

22、s2、制备第二组分：

23、将尿素、硫脲、阴离子表面活性剂、非离子糖苷表面活性剂和三羟甲基氨基甲烷溶解于无核酸酶水中，调节ph至8.0~9.0，得到第二组分；

24、s3、独立分装：

25、将所述第一组分和第二组分分别独立分装于不同容器中，即得所述病毒裂解液。

26、惰性气体隔绝了空气中的氧气，有效防止焦亚硫酸钠/亚硫酸钠在配制过程中被氧化；先加入有机季铵碱调节至强碱性后再加入焦亚硫酸钠/亚硫酸钠和植酸钠的加入顺序，确保了焦亚硫酸钠/亚硫酸钠在碱性条件下稳定溶解并保持还原活性；两组分分别调至各自的目标ph后再分装，确保了“强碱启动裂解、中性终止保护”的ph时序控制功能得以实现；独立分装避免了各组分在储存期间发生反应，保证了产品的货架稳定性。

27、作为本发明的一种优选技术方案，所述病毒裂解液的使用方法为：将第一组分与第二组分按体积比混合后，加入待测样本，室温孵育1~5min，即可用于检测。

28、使用操作步骤简便，无需加热、无需额外纯化步骤，短时孵育即可完成裂解，满足快速检测的需求。

29、一种病毒裂解液在裂解含病毒的生物细胞或组织中的应用。

30、本发明的有益效果：

31、（1）本发明提供了一种病毒裂解液，在不依赖传统胍盐和triton x-100的条件下实现了对包膜/非包膜病毒的高效裂解。利用第一组分中的焦亚硫酸钠/亚硫酸钠在强碱性条件下释放亚硫酸根，与植酸钠的密集负电荷基团的静电排斥作用，两种机制协同作用，实现病毒早室温的快速裂解。

32、（2）本发明的第一组分为强碱性，可激活亚硫酸盐的最佳磺解活性，第二组分近中性（ph 8.0~9.0），在混合后自动将终溶液ph中和至8~9，因此可以同时具有强碱启动的高速裂解性，又避免了核酸在强碱中长期暴露导致降解，使终溶液直接适配pcr/lamp酶的活性窗口。本发明完全不含高浓度胍盐（传统配方>4m），裂解产物可直接作为模板进行核酸扩增检测，无需任何纯化步骤。