Hobi样病毒SYBRGreen实时荧光PCR检测引物及方法与流程

本发明涉及生物检测，具体涉及hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测引物及方法。

背景技术：

1、hobi样病毒属于黄病毒科瘟病毒属，单股正链rna病毒，是非典型瘟病毒的代表，大小为12.3 kb，有1个开放阅读框，两侧为非编码区（utr）。2004年，德国实验室从巴西进口来源的胎牛血清中分离到第1个hobi样病毒。随着胎牛血清的广泛使用，在美国、瑞士、意大利、澳大利亚、中国等国家陆续从胎牛血清中检测或分离该病毒。瘟病毒属病毒不是严格的宿主特异性病毒，可交叉感染牛、羊、猪、山羊和其他野生反刍动物。hobi样病毒可导致怀孕母羊繁殖障碍，出现流产、死胎或产出持续性感染带毒的新生羊羔。

2、现有hobi样病毒的检测方法可分为病毒分离，通过使用牛肾细胞参照bvdv分离方法可以实现hobi样病毒的分离；或者通过使用针对bvdv的ace试剂盒，可对血清中的hobi样病毒进行检测，但无法与bvdv进行有效区分。

3、目前，尚缺乏针对hobi样病毒非编码区（utr）建立快速、便捷、低成本的sybrgreen实时荧光pcr检测方法，而这方面的研究可为兽医工作者研究和疫病的快速诊断提供技术支持，对于生物制品的生物安全保障具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测引物及方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好和检测用时短的特点。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测引物，其所述引物的序列为：

4、上游引物：ggtgaaagagggtcattatg

5、下游引物：tagtgatgtagcaggtctc。

6、一种hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测试剂盒，所述试剂盒包含前述引物。

7、一种非诊断目的的hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测方法，所述方法包括如下步骤：

8、（1）取待测样品；

9、（2）按照如下方案配置反应体系：qpcr mix (2x) ：10 µl，上游引物、下游引物：各0.4~1.0µl，模板：5 µl，rnase free dh2o补足至20 µl；

10、（3）按照如下方案进行反应：95℃预变性2 min；95℃预变性15 s、53~61℃退火40s，循环40次；

11、所述上游引物、下游引物如前述一种hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测引物。

12、优选地，所述反应体系为：qpcr mix (2x) ：10 µl，上游引物、下游引物：各0.6µl，模板：5 µl，rnase free dh2o补足至20 µl。

13、优选地，所述反应条件为：95℃预变性2 min；95℃预变性15 s、55℃退火40s，循环40次。

14、本发明的有益效果：

15、本发明具有较好的特异性、敏感性和重复性，与牛病毒性腹泻病毒（bvdv）、口蹄疫病毒（fmdv）、小反刍兽疫病毒（pprv）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、猪瘟病毒（csfv），无交叉反应；本发明最低检测限为1 copies/μl，组内变异系数小于1%；本发明建立的hobi样病毒sybr green 实时荧光pcr检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好和检测用时短等特点，适合于hobi样病毒的病原学检测和流行病学调查。

1.一种hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测引物，其特征在于，所述引物的序列为：

2.一种hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物。

3.一种非诊断目的的hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测方法，其特征在于，反应体系为：qpcr mix (2x) ：10 µl，上游引物、下游引物：各0.6µl，模板：5 µl，rnase free dh2o补足至20 µl。

5.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的hobi样病毒sybr green实时荧光pcr检测方法，其特征在于，反应条件为：95℃预变性2 min；95℃预变性15 s、55℃退火40s，循环40次。