一种高热稳定性的蒜糖醇脱氢酶突变体及其应用

本发明属于酶工程，具体涉及一种高热稳定性的蒜糖醇脱氢酶突变体及其应用。

背景技术：

1、蒜糖醇（allitol，亦称阿洛醇）是一种六碳稀有糖醇，分子式为c6h14o6，具有低热量、低血糖生成指数（gi）以及抗龋齿等独特优势，在功能性食品、医药中间体合成等领域前景广阔。蒜糖醇不易被口腔链球菌代谢利用，在高温条件下不参与美拉德反应，能够在烘焙食品、乳制品和饮料等热加工过程中保持稳定。此外，蒜糖醇在稀有糖“izumoring”代谢网络中处于枢纽地位，既可经由酶催化途径由多种稀有糖转化生成，又可作为重要前体物质用于合成其他d型或l型稀有糖。

2、蒜糖醇的获得路径主要包括自然提取法、化学合成法、体外酶催化法和全细胞催化法。自然提取法原料消耗大、分离成本高，化学合成法步骤繁琐、副产物复杂且安全性不高，因此生物催化法因其条件温和、专一性强且环境友好，被视为实现蒜糖醇绿色制造的最具潜力途径。该路径的核心在于利用蒜糖醇脱氢酶（rdh）高效催化d-阿洛酮糖转化为蒜糖醇。

3、蒜糖醇脱氢酶（rdh）是短链脱氢酶/还原酶（sdr）超家族的重要成员，其催化功能依赖辅酶nadh。rdh已从多种微生物中分离获得，包括 aerobacter aerogenes、enterobacter agglomerans、gluconobacter oxydans、klebsiella aerogenes、rhodobacter sphaeroides、klebsiella oxytoca与 zymomonas mobilis等。这些不同来源的rdh大多在弱碱性条件（ph 7.5-9.0）和中等温度范围（35-40℃）下具有最高催化活性。然而，不同微生物来源的rdh在氨基酸序列、空间构象及酶学性质上存在显著差异，其底物选择性、动力学参数、辅酶偏好性以及稳定性等方面的不同，直接影响其在蒜糖醇合成中的催化效率与实际应用潜力。

4、值得关注的是，来源于碱普罗威登斯菌（providenciaalcalifaciensrimd1656011）的蒜糖醇脱氢酶（pardh）展现出优异的底物专一性和较宽的ph稳定性范围。然而，该酶的热稳定性普遍不足，在工业化生产过程中所面临的高温环境极易导致其失活。野生型pardh在45℃下的半衰期仅为49分钟，在55℃下的半衰期仅为8.8分钟，远不能满足工业化连续生产的需求。酶在高温下的快速失活不仅降低了催化效率、增加了酶的使用成本，更严重制约了连续化生产工艺的实现。

5、因此，亟需通过蛋白质工程改造手段提高pardh的热稳定性，在不损失催化活性的前提下增强其在高温环境下的结构刚性，为蒜糖醇的绿色、高效、规模化生产提供技术支持。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服来源于碱普罗威登斯菌（providenciaalcalifaciensrimd1656011）的野生型蒜糖醇脱氢酶pardh热稳定性不足、在高温环境下极易失活、无法满足工业化生产需求的技术缺陷。

2、本发明提供一种高热稳定性的蒜糖醇脱氢酶突变体，所述突变体是将seq idno.1序列截短mais序列，然后以截短后的序列为出发序列，突变167和199位获得的。

3、进一步地限定，将167位的t突变为l，将199位m突变为l。

4、本发明提供一种编码上述的突变体的基因。

5、本发明提供一种含有上述的基因的重组载体。

6、本发明提供一种含有上述的基因的重组微生物细胞。

7、本发明提供一种上述的突变体、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组微生物细胞在合成蒜糖醇中的应用。

8、本发明提供一种合成蒜糖醇的方法，以d-阿洛酮糖为底物，在上述蒜糖醇脱氢酶突变体的催化下进行还原反应，生成蒜糖醇。

9、进一步地限定，加入nadh浓度30~90 mm，反应温度25~45℃，反应ph 7~10，反应时间5~180 min，突变体浓度为30g/l。

10、本发明提供一种合成蒜糖醇的方法，以d-阿洛酮糖为底物，将上述的重组微生物细胞进行冻干处理，然后催化还原反应，生成蒜糖醇，菌体浓度15~80 g/l。

11、进一步地限定，加入nadh浓度30~90 mm，反应温度25~45℃，反应ph 7~10，反应时间5~180 min。

12、有益效果：双突变体δ1-4-t167l-m199l的残余活性达到截短骨架δ1-4的9.98倍，热稳定性提升效果极为显著。

13、最适反应温度提高：酶学性质表征结果显示，双突变体δ1-4-t167l-m199l的最适反应温度从野生型的35℃提高至40℃，提高了5℃，表明突变体在更高温度下仍能保持较高的催化活性，更适应工业化生产中的高温环境。

14、半衰期显著延长：热稳定性测定结果显示，双突变体δ1-4-t167l-m199l在45℃下的半衰期为124.4分钟，较野生型（49分钟）提高了2.54倍；在55℃下的半衰期为16.77分钟，较野生型（8.8分钟）提高了1.9倍。在55℃下孵育45分钟后，突变体仍具有15%的残余活性，而此时野生型已检测不到残余活性。

15、催化活性协同提升：双突变体δ1-4-t167l-m199l在热稳定性大幅提升的同时，相对活性较截短骨架δ1-4提高了15.3%，实现了热稳定性与催化活性的协同优化。酶动力学参数测定结果显示，突变体的km值为51.20 mmol/l，较野生型（56.75 mmol/l）降低了9.78%，表明底物亲和力有所增强；kcat/km值为2.03 min-¹·mm-¹，较野生型（1.80 min-¹·mm-¹）提高了12.78%，催化效率得到小幅优化。

16、全细胞催化工艺高效：在应用层面，建立了基于冻干处理的全细胞催化工艺。通过对冻干菌体浓度、nadh浓度和反应时间进行系统优化，在菌体浓度40 g/l、nadh浓度60 mm、反应时间120 min的最优条件下，蒜糖醇产量可达10.7 g/l，为蒜糖醇的工业化生物制造提供了具有潜力的酶催化剂和工艺基础。

1.一种高热稳定性的蒜糖醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq id no.1序列截短mais序列，然后以截短后的序列为出发序列，突变167和199位获得的。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将167位的t突变为l，将199位m突变为l。

3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因。

4.含有权利要求3所述的基因的重组载体。

5.含有权利要求3所述的基因的重组微生物细胞。

6.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组微生物细胞在合成蒜糖醇中的应用。

7.一种合成蒜糖醇的方法，其特征在于，以d-阿洛酮糖为底物，在权利要求1或2所述蒜糖醇脱氢酶突变体的催化下进行还原反应，生成蒜糖醇。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，加入nadh浓度30~90 mm，反应温度25~45℃，反应ph 7~10，反应时间5~180 min，突变体浓度为30g/l。

9.一种合成蒜糖醇的方法，其特征在于，以d-阿洛酮糖为底物，将权利要求5所述的重组微生物细胞进行冻干处理，然后催化还原反应，生成蒜糖醇，菌体浓度15~80 g/l。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，加入nadh浓度30~90 mm，反应温度25~45℃，反应ph 7~10，反应时间5~180 min。