N-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1H-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/FLT3双靶点抑制剂及其制备方法与应用
本发明涉及n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂及其制备方法与应用，属于医药。
背景技术：
1、flt3（fms样酪氨酸激酶3）属于ⅲ型受体酪氨酸激酶家族，与fms、kit及pdgfr具有高度结构同源性，主要表达于造血祖细胞及急性髓系白血病（aml）细胞表面。flt3可通过激活下游pi3k/akt/mtor、ras/mapk及jak/stat等多条信号通路，驱动白血病细胞异常增殖并抑制凋亡，从而促进aml的恶性进展。
2、近年来，flt3靶向抑制剂的研发取得了显著进展。根据作用特异性的不同，现有药物可分为两代：第一代抑制剂（如舒尼替尼、索拉非尼、米哚妥林）为多靶点酪氨酸激酶抑制剂，在抑制flt3的同时对多个激酶亦有作用，多靶点特性或可增强抗白血病效应，但非选择性抑制也显著增加脱靶相关毒性；第二代抑制剂（如吉瑞替尼、奎扎替尼、克莱拉尼）则具有更高的激酶选择性，脱靶效应相对减少。
3、尽管药物迭代已取得突破，flt3抑制剂的临床应用仍面临两大核心挑战：一是激酶选择性不足导致的剂量限制性毒性。现有抑制剂对flt3与c-kit的选择性普遍偏低（如奎扎替尼对二者的选择性倍数仅约3倍），单独抑制任一激酶尚可维持正常造血功能，但二者同时被显著抑制时将引发严重的骨髓抑制，严重制约治疗窗口的拓展。二是复杂的耐药机制。在接受ii型抑制剂治疗的患者中，约60%的复发者检出flt3激酶结构域的获得性点突变（如d835或f691位点），直接削弱药物与靶蛋白的结合亲和力；同时，非flt3依赖的代偿性信号通路（如ras/mapk通路的再激活或抗凋亡蛋白上调）亦被异常激活，进一步介导治疗逃逸，成为临床持久缓解的主要障碍。
4、微管是真核细胞三大细胞骨架系统的重要组成部分，其动态不稳定性（即聚合与解聚之间的周期性转变）在细胞形态维持、胞内信号转导、有丝分裂进程以及胞内物质定向运输等关键生物学过程中均发挥核心调控作用。正因如此，微管已成为抗肿瘤药物研发中极具吸引力的干预靶点。目前临床上广泛使用的微管蛋白靶向药物要作用于微管蛋白上的紫杉醇位点或长春碱位点，代表性药物包括紫杉烷类（如紫杉醇、多西他赛）、埃博霉素类（如伊沙匹隆）、喜树碱类以及长春碱类（如长春新碱、长春瑞滨）等。然而，上述药物在临床应用中所面临的主要瓶颈包括固有或获得性多药耐药现象，以及较为突出的神经毒性和骨髓抑制等剂量限制性毒副作用。其耐药机制较为复杂，目前认为主要涉及药物作为p-糖蛋白等外排转运体底物而被主动泵出细胞，以及βiii-微管蛋白亚型选择性过表达所引发的微管结合亲和力改变等分子基础。
5、鉴于单靶点药物在临床上常受限于疗效不足及耐药问题，多靶点/双靶点药物通过单一分子同步调控疾病通路中的多个关键节点，不仅能够发挥协同作用，还可降低代偿性耐药风险并减少脱靶毒性。从药物研发角度来看，多靶点分子具有显著优势：其药代动力学特征单一可控，避免了联合用药中不同组分在体内暴露水平差异大的问题；同时，相较于需分别开展安全性评价的联合疗法，多靶点药物仅需作为单一实体申报审批，大幅降低研发成本并缩短周期。因此，该策略已成为突破复杂肿瘤治疗瓶颈的重要方向之一。在此背景下，将微管蛋白抑制剂与flt3抑制剂的功能整合于同一分子中，有望通过协同机制增强抗肿瘤活性，并有效克服单靶点药物引发的耐药问题。
6、因此，设计并合成结构新颖的小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂，是提升药物特异性与疗效、降低毒副作用并规避耐药性的关键策略。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明提供n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂及其制备方法与应用。
2、为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
3、本发明第一方面，提供一种n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂，具有如下式i所示结构：
4、
5、式i，
6、其中，r为1h-吲哚-4-基。
7、本发明第二方面，提供上述n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
8、以式1化合物3,5-二溴-1h-吡唑为起始原料，在对甲苯磺酸存在下，使用3,4-二氢-2h-吡喃对n1位进行保护，得到式2化合物3,5-二溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基）-1h-吡唑，式2化合物与3,4,5-三甲氧基苯胺在三（二亚苄基丙酮）二钯、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽和碳酸铯催化下发生buchwald-hartwig交叉偶联反应，得到式3化合物5-溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基）-n-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-胺，式3化合物用三氟乙酸脱除保护基，得到式4化合物5-溴-n-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-胺，式4化合物与4-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基）-1h-吲哚在[1,1'-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯和碳酸钾催化下发生suzuki交叉偶联反应，得到目标化合物；
9、。
10、具体的，上述n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
11、（1）将3,5-二溴-1h-吡唑溶于二氯甲烷中，加入3,4-二氢-2h-吡喃和对甲苯磺酸，搅拌，加入饱和碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取，洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析，得到3,5-二溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基）-1h-吡唑；
12、（2）将3,5-二溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基）-1h-吡唑和3,4,5-三甲氧基苯胺溶于1,4-二氧六环中，加入三（二亚苄基丙酮）二钯、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽和碳酸铯，经氮气吹扫脱气，加热搅拌反应，硅藻土垫过滤，滤液减压浓缩，柱层析，得到5-溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基）-n-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-胺；
13、（3）将5-溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基）-n-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-胺溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，搅拌，饱和碳酸氢钠溶液调节ph至7–8，二氯甲烷萃取，合并萃取液，无水硫酸钠干燥，柱层析，得到5-溴-n-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-胺；
14、（4）将5-溴-
n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1
h-吡唑-3-胺溶于二氧六环和水的混合溶液中，加入4-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基）-1
h-吲哚、碳酸钾和[1,1'-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯，搅拌，经氮气吹扫脱气，加热搅拌反应，加水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析，得式i所示结构化合物。
15、根据本发明优选的，步骤（1）中，3,5-二溴-1h-吡唑、3,4-二氢-2h-吡喃与对甲苯磺酸的质量比为（1-3）：（1-3）：（0.05-0.1）。
16、根据本发明优选的，步骤（2）中，3,5-二溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基）-1h-吡唑、3,4,5-三甲氧基苯胺、三（二亚苄基丙酮）二钯、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽、碳酸铯的质量比为（3-6）：（1-4）：（0.5-5）：（1-4）：（10-15）。
17、根据本发明优选的，步骤（2）中，加热搅拌反应为在90-120 °c下搅拌反应8-12小时。
18、根据本发明优选的，步骤（3）中，5-溴-1-（四氢-2h-吡喃-2-基)-n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺与三氟乙酸的质量比为（1-4）：（3-7）。
19、根据本发明优选的，步骤（4）中，5-溴-n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺、4-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基）-1h-吲哚、碳酸钾与[1,1'-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯的质量比为（50-70）：（45-60）：（65-75）：（12-20），二氧六环和水的混合溶液中二氧六环与水的体积比为（2-5）：1。
20、根据本发明优选的，步骤（4）中，热搅拌反应为在90-120 °c下搅拌反应8-12小时。
21、本发明第三方面，提供上述n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
22、一种抗肿瘤药物，包括有效量的式i所示结构的n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子微管蛋白/flt3双靶点抑制剂。
23、根据本发明优选的，所述抗肿瘤药物与一种或多种药学上可接受载体和/或赋形剂制成口服制剂和肠胃外给药制剂。
24、根据本发明优选的，口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂，肠胃外给药制剂为注射剂。
25、根据本发明优选的，所述载体选自生理盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油或乙醇；所述赋形剂选自磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糊精，淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐或聚乙烯吡咯烷酮。
26、本发明的技术特点及优点：
27、1、本发明的化合物为结构新颖的n-（3,4,5-三甲氧基苯基）-1h-吡唑-3-胺类小分子双靶点抑制剂，可同时靶向微管蛋白与flt3激酶。生物活性评价结果显示，该系列化合物对人结肠癌hct116细胞、人肺癌a549细胞、人乳腺癌mda-231细胞以及人白血病molm-13和mv4-11细胞均表现出显著的增殖抑制活性，并能有效抑制微管蛋白聚合及flt3激酶活性。
28、2、本发明所提供的微管蛋白/flt3双靶点抑制剂具有新颖的化学结构，该结构设计有助于提升靶向选择性与生物学活性，同时具备降低毒副反应发生概率及延缓或克服耐药性产生的潜力，具有重要的研究与应用价值。