一氧化氮清除分子与脑靶向NO清除纳米药物及其制备方法和应用

本发明属于生物医学材料，尤其涉及一氧化氮清除分子与脑靶向no清除纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞（car-t）疗法在b细胞恶性肿瘤治疗中取得突破性进展，但临床应用中常伴随严重毒副作用，其中免疫效应细胞相关神经毒性综合征（icans）发生率高，3-4级高级别icans发生率达10%~34%，靶向cd19、bcma、cd22等抗原的car-t产品均会诱发致命性神经毒性。

2、目前icans临床治疗存在显著缺陷：1.皮质类固醇激素为一线疗法，但其广谱免疫抑制作用会损伤car-t细胞抗肿瘤活性，降低患者长期疗效；2.il-6受体拮抗剂、il-1受体拮抗剂等靶向细胞因子药物仅对细胞因子释放综合征（crs）有效，无法预防或治疗icans，甚至增加重度神经毒性风险；3.现有药物均非机制靶向药物，研究证实中枢神经系统（cns）内一氧化氮（no）大量积累是血脑屏障（bbb）破坏、神经炎症与认知障碍的核心上游介质，但传统no清除剂（如ptio）存在反应动力学慢、特异性差、体内稳定性差、无法穿透血脑屏障等问题，无法用于icans体内治疗。

3、基于此，开发一种可高效穿透血脑屏障、特异性清除脑内过量no、不影响car-t抗肿瘤疗效的靶向纳米药物，成为car-t神经毒性临床管理的迫切需求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一氧化氮清除分子与脑靶向no清除纳米药物及其制备方法和应用。本发明以opta分子为核心，以dspe-peg2000、dspe-peg-mal2000为载体骨架自组装形成，并在纳米颗粒表面共价偶联angiopep-2靶向肽获得脑靶向no清除纳米药物，解决了car-t细胞疗法所致icans缺乏安全有效靶向药物的问题，实现了脑内no特异性清除、血脑屏障修复、神经炎症抑制与活体no成像，且不损害car-t细胞抗肿瘤活性。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供一氧化氮清除分子，其结构式如式1或式9所示：

4、式1，

5、式9，

6、其中式1为opta（4,7-双[5-(4-(双(4-甲氧基苯基)氨基)苯基)-4-丁基噻吩-2-基]-5,6-二氨基苯并[c][1,2,5]噻二唑），式9为ota。

7、本发明提供所述的一氧化氮清除分子的制备方法，所述opta的制备方法包括以下步骤：

8、（1.1）将2-溴-3-丁基噻吩丁基锂化后，与2-异丙氧基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷反应，得到硼酸酯中间体2；

9、（1.2）将中间体2与4-溴-4',4'-二甲氧基三苯胺发生suzuki偶联反应，生成中间体3；

10、（1.3）将中间体3经丁基锂锂化后与三丁基氯化锡反应，得到有机锡中间体4；

11、（1.4）将中间体4与4,7-二溴-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑反应，生成硝基中间体5；

12、（1.5）在醋酸体系中用铁粉还原中间体5，将硝基转化为氨基，纯化后得到目标分子opta；

13、所述ota的制备方法包括以下步骤：

14、（2.1）将4-溴-n,n-双（4-甲氧基苯基）苯胺丁基锂化后，与三丁基氯化锡反应，得到中间体7；

15、（2.2）将中间体7与4,7-二溴-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑反应，生成中间体8；

16、（2.3）在醋酸体系中用铁粉还原中间体8，将硝基转化为氨基，纯化后得到目标分子ota。

17、本发明提供了所述的一氧化氮清除分子或根据所述的制备方法获得的一氧化氮清除分子在制备脑靶向no清除药物中的应用，所述药物以opta分子为核心。

18、本发明提供了一种脑靶向no清除纳米药物，所述纳米药物包括以下质量比的组分：所述的一氧化氮清除分子opta：纳米载体：靶向配体=1：4~8：1~3。

19、作为优选，所述纳米载体为能够通过自组装包裹一氧化氮清除分子opta的两亲性材料；所述靶向配体为能够特异性识别bbb表面受体的靶向配体。

20、作为优选，所述纳米载体包括dspe-peg2000、dspe-peg-mal2000、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、peg-b-pcl、peg-b-pla、脂质体中的一种或多种；

21、所述靶向配体包括angiopep-2多肽、转铁蛋白、转铁蛋白受体单克隆抗体、rvg29多肽、胰岛素受体靶向多肽中的任一种。

22、本发明还提供所述的脑靶向no清除纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

23、（7.1）将一氧化氮清除分子opta与纳米载体溶于四氢呋喃中，获得有机相；

24、（7.2）将有机相中滴入去离子水中，形成纳米混悬液；

25、（7.3）将纳米混悬液进行透析后，加入靶向配体，反应过夜，再次透析、浓缩、过滤获得脑靶向no清除纳米药物。

26、本发明还提供所述的脑靶向no清除纳米药物或根据所述的制备方法获得的脑靶向no清除纳米药物在制备car-t细胞疗法所致免疫效应细胞相关神经毒性综合征制剂中的应用。

27、本发明还提供了所述的脑靶向no清除纳米药物或根据所述的制备方法获得的脑靶向no清除纳米药物在制备治疗中枢神经系统疾病制剂中的应用。

28、本发明还提供了所述的脑靶向no清除纳米药物或根据所述的制备方法获得的脑靶向no清除纳米药物在制备高灵敏度脑内no实时荧光成像探针或光声成像造影剂中的应用。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、1.本发明设计合成了特异性no清除分子4,7-双[5-(4-(双(4-甲氧基苯基)氨基)苯基)-4-丁基噻吩-2-基]-5,6-二氨基苯并[c][1,2,5]噻二唑（opta）以及ota，具有式1与式2所示结构，以opta为核心、dspe-peg2000和dspe-peg-mal2000为载体、angiopep-2为靶向肽，构建脑靶向no清除纳米药物nanonosap。该药物兼具脑内no实时近红外成像与清除功能，能修复血脑屏障、抑制神经炎症、逆转icans所致认知障碍。本发明可用于car-t相关神经毒性的预防与治疗，也适用于其他伴no过量积累的中枢神经系统疾病，还可作为脑内no成像探针，具有重要临床转化价值。

31、2.采用本发明式1所示结构所制备的靶向脑部no的纳米粒子nanonosap，其反应动力学极快、no特异性极高（解决传统清除剂反应慢的痛点）：本发明通过在核心分子骨架中引入强给电子基团二甲氧基三苯胺，显著降低了电离势与反应能垒。与传统no清除剂ptio相比，本发明纳米药物到达反应平衡的速度提升了13.3倍，且对其他活性氧/氮物质无交叉反应。这为体内快速、精准地阻断病理性no级联反应提供了可靠保障。

32、3.本发明制备的靶向脑部no的纳米粒子nanonosap，其可突破血脑屏障（bbb）的优异靶向递送能力（解决现有药物难以入脑的难题）：本发明通过精确调控纳米颗粒表面的angiopep-2靶向肽修饰密度（优选约4000个/np），实现了对中枢神经系统（cns）的高效递送。给药后能迅速在脑部富集并保持长效滞留，克服了常规大分子或纳米药物无法穿透完整血脑屏障的重大技术瓶颈。

33、4.本发明制备的靶向脑部no的纳米粒子nanonosap，其独特的原位显像与治疗双重功能（解决脑内炎性微环境难以实时监测的痛点）：opta分子与no特异性反应后，其吸收与荧光发射峰会显著红移至近红外区域（950nm）。这一特性赋予了该纳米药物在活体状态下对脑内no水平进行无创、动态光学示踪的能力，实现了靶标检测监测与靶向治疗的高度融合。

34、5.本发明制备的靶向脑部no的纳米粒子nanonosap，其逆转神经毒性且不损害car-t抗肿瘤疗效（解决激素类药物抑制免疫系统的致命缺陷）：在免疫完整的icans动物模型中，本发明不仅能快速清除过量no、修复受损的血脑屏障，还能显著降低中枢炎性因子风暴并逆转认知功能障碍。更为关键的是，与目前临床使用皮质类固醇激素会削弱细胞疗法疗效不同，本发明的no清除机制对car-t细胞在体内的扩增及靶向杀伤肿瘤的能力无任何负面影响，为icans的临床管理提供了一种极其安全、有效的新型靶向干预策略。